糖尿病腎臟疾病中腎小球相關差異表達基因的生物信息學分析

談冬錦，石敏，徐玉迪，張紅，

(1.徐州醫(yī)科大學淮安臨床學院，江蘇 淮安 223300； 2.南京醫(yī)科大學附屬淮安第一醫(yī)院內分泌科，江蘇 淮安 223300)

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病常見的微血管并發(fā)癥之一，30%～40%的1型糖尿病和2型糖尿病患者可發(fā)展為DKD，其中約一半的患者將進展為終末期腎臟病，已成為糖尿病患者死亡的主要原因，對社會發(fā)展和人類健康造成嚴重威脅[1]。目前在治療DKD方面，雖然已經(jīng)證實新近研發(fā)的鈉葡萄糖協(xié)同轉運蛋白2抑制劑和胰高血糖素樣肽-1受體激動劑可以延緩腎臟疾病的進展及減少心血管事件的發(fā)生[2-3]，但并沒有從根源上遏制DKD的產(chǎn)生，需要更深入地了解DKD潛在的遺傳因素和分子機制，從而確定更好的診斷和治療方法。隨著基因轉錄組學研究技術的廣泛應用，產(chǎn)生了大量的高通量基因分析結果，從而誕生了眾多的公共數(shù)據(jù)庫，為研究疾病生物學過程和潛在的發(fā)病機制提供了便利。本研究利用生物信息學技術分析DKD中腎小球相關的差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)，通過富集分析評估其生物學功能，并建立蛋白質-蛋白質相互作用(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡和微RNA(microRNA，miRNA)-DEGs調控網(wǎng)絡等尋找關鍵基因和miRNA，以期為DKD的診斷和治療提供新方向。

1 資料與方法

1.1數(shù)據(jù)的獲取 本研究數(shù)據(jù)來源于美國國家生物技術信息中心-GEO(Gene Expression Omnibus)數(shù)據(jù)庫，以“diabetic kidney disease”和“diabetic nephropathy”為關鍵詞，研究類型為“Expression profiling by array”，物種為“Homo sapiens”，經(jīng)過仔細篩選共獲得36個數(shù)據(jù)集，選擇GSE30528和GSE1009兩個與腎小球有關的DKD數(shù)據(jù)集進行下一步分析，試驗平臺分別為GPL571和GPL8300。其中，GSE30528含有來自DKD患者的9個腎小球組織樣本和13個對照腎小球組織樣本。GSE1009含有3個DKD和3個對照人腎小球組織樣本。

1.2DEGs的識別 利用GEO2R在線工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ geo/geo2r)對微陣列數(shù)據(jù)進行處理，分別篩選兩個數(shù)據(jù)集的DEGs，在下載DEGs數(shù)據(jù)后，進一步篩選，標準為|logFC|>1且調整后的P<0.05，并通過在線工具繪制韋恩圖(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)獲得在兩個數(shù)據(jù)集中重疊的DEGs。

1.3生物功能和信號通路富集分析 將重疊的DEGs導入Metascape在線工具(https://metascape.org/)進行基因本體論(Gene Ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encycopedia of Genes and Genomes，KEGG)信號通路富集分析，篩選條件P<0.01，并利用R語言裝載GOplot包使結果可視化，分析重疊DEGs的生物功能和參與的信號通路。GO富集分析包括生物學過程、分子功能和細胞組分。KEGG是一個整合了基因組、化學和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫，深入分析基因產(chǎn)物在細胞中的代謝途徑和功能，有助于將基因及表達信息作為一個整體的網(wǎng)絡進行研究。

1.4PPI網(wǎng)絡的建立 將重疊DEGs導入STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)分析對應的蛋白質之間的相互作用，構建PPI網(wǎng)絡圖，界值設定為0.4，結果應用Cytoscape軟件可視化，利用CytoHubba插件選擇最大集團中心性算法計算得到前5個基因即為Hub基因，從而分析網(wǎng)絡中的核心蛋白質。

1.5miRNA-DEGs網(wǎng)絡的建立 將重疊DEGs導入NetworkAnalyst在線工具(https://www.networkanalyst.ca/)，建立miRNA-DEGs交互網(wǎng)絡，數(shù)據(jù)庫采用miRTarBase v8.0，獲得的miRNA進一步篩選，標準為自由度>2，應用Cytoscape軟件 (https://www.cytoscape.org/)使結果可視化，從而分析重疊DEGs上游miRNA的調控情況。

2 結 果

2.1重疊DEGs的篩選 通過GEO2R在線工具分析兩個數(shù)據(jù)集并形成火山圖(圖1)，根據(jù)標準進一步篩選，在GSE30528中確定了632個DEGs，在GSE1009中確定了49個DEGs，兩個數(shù)據(jù)集之間的交集包含26個DEGs(圖2)，均在DKD中表達上調，包括二氫嘧啶酶樣蛋白3、1號染色體開放閱讀框21、信號素5A、磷脂酶Cε1、ST3β-半乳糖苷α-2,3唾液酸轉移酶6、1型血小板反應蛋白7A域、巨噬細胞金屬彈力酶、凝血因子Ⅱ凝血酶受體、N-乙酰葡糖胺轉移酶Ⅴ、血管內皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)、生長抑制特異性蛋白1、同種異體移植炎癥因子1、微管結合蛋白、細胞內氯離子通道蛋白5、叉頭框蛋白C1(forkhead box protein C1，F(xiàn)OXC1)、IQ模體的GTP酶活化蛋白2、磷脂酶A2受體1、同源框基因1、凝血因子Ⅲ、成纖維細胞生長因子1、酪氨酸激酶3、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)、蛋白酪氨酸磷酸酶受體(protein tyrosine phosphatase receptor，PTPR)O、GDP甘露糖-4，6-脫水酶、肌鈣蛋白C1、PTPRD。

2.2GO和KEGG富集分析 采用Metascape在線工具進行GO和KEGG富集分析，并利用R語言裝載GOplot包使結果可視化，其中GO富集分析結果見圖3，展示了每個層面上P值最小的5個富集項目，在生物過程上，重疊DEGs主要富集在腎臟和泌尿系統(tǒng)的形成以及正向調節(jié)細胞遷移等方面；在細胞成分上，主要富集在板狀偽足、細胞前緣、肌動蛋白細胞骨架等方面；在分子功能上，主要富集在磷酸酯水解酶活性、蛋白質同型二聚化活性、糖胺聚糖結合等方面。KEGG富集分析結果見圖4，重疊DEGs主要參與7條信號通路，包括糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end product，AGE)-AGE受體(receptor for advanced glycation end product，RAGE)信號通路、Rap1信號通路、鈣信號通路、細胞骨架調節(jié)信號通路、Ras信號通路、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)-蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)信號通路和癌癥相關信號通路。

2.3PPI網(wǎng)絡圖 重疊DEGs形成的PPI網(wǎng)絡圖見圖5，包括1個主網(wǎng)絡和2個次網(wǎng)絡，整個網(wǎng)絡圖由17個節(jié)點和16條邊形成，其中VEGFA位于核心位置，與8種蛋白有關，如FOXCO1、BMP2、成纖維細胞生長因子1等。將PPI網(wǎng)絡圖信息導入Cytoscape軟件，應用MCC算法得到排名前5的Hub基因為VEGFA、信號素5A、1型血小板反應蛋白7A域、磷脂酶A2受體1、FOXC1。

DEGs：差異表達基因；CON：正常對照組；DKD：糖尿病腎臟疾病組；fold change：差異倍數(shù)；1a：GSE30528；1b：GSE1009；藍色：下調的DEGs；紅色：上調的DEGs；黑色：無差異的基因

圖2 兩個數(shù)據(jù)集重疊的差異表達基因

2.4構建miRNA-DEGs網(wǎng)絡 通過NetworkAnalyst建立miRNA-DEGs網(wǎng)絡見圖6，共獲得693個節(jié)點，901條邊。其中具有最多交互miRNAs的前3個基因為VEGFA、FOXC1、酪氨酸激酶3，邊線分別為126、106、99。經(jīng)過進一步篩選后得到36個miRNAs，其中hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20a-5p屬于miR-17家族，共同靶向最多的6個DEGs，分別為VEGFA、BMP2、FOXC1、凝血因子Ⅱ凝血酶受體、凝血因子Ⅲ、PTPRO，靶向5個DEGs的miRNAs分別為hsa-miR-26b-5p、hsa-miR-93-5p、hsa-miR-106a-5p、hsa-miR-106b-5和hsa-miR-355-5p。

DEGs：差異表達基因；GO：基因本體論；BP：生物過程；CC：細胞成分；MF：分子功能

DEGs：差異表達基因；KEGG：京都基因與基因組百科全書；rich factor：富集到的基因數(shù)與該條通路基因總數(shù)之比；count：富集到該通路的基因數(shù)

DEGs：差異表達基因；PPI：蛋白質-蛋白質相互作用

miRNA：微RNA；DEGs：差異表達基因；粉紅色圓形的為重疊DEGs，黃色六邊形的為miRNA，中央兩個黃色六邊形是靶向6個重疊DEGs的miRNA

3 討 論

DKD是糖尿病常見的一種微血管并發(fā)癥，腎臟代謝環(huán)境的改變以及血流動力學的異常引發(fā)炎癥、氧化應激、細胞去分化、細胞內信號通路異常等病理生理學活動[4-5]，出現(xiàn)腎小球基膜增厚、足細胞損傷、系膜基質擴張、腎小管萎縮和間質纖維化等病理改變，進而損傷腎小球濾過膜、破壞腎小管功能，最終出現(xiàn)白蛋白尿和腎功能下降[6-8]。雖然鈉-葡萄糖協(xié)同轉運蛋白2抑制劑和胰高血糖素樣肽-1受體激動劑能夠改善DKD，但仍無法根治。隨著基因組學和生物信息技術的發(fā)展，遺傳學研究表明DKD的發(fā)病與基因轉錄組學改變有關，這為從根本上解決DKD提供了方向[9]。

本研究通過從GEO數(shù)據(jù)庫中下載DKD相關的腎小球基因芯片數(shù)據(jù)集，采用生物信息學技術識別出2個數(shù)據(jù)集重疊的26個DGEs，進行GO和KEGG富集分析，結果顯示，DEGs主要與腎臟和泌尿系統(tǒng)的形成、板狀偽足、細胞前緣、磷酸酯水解酶活性、蛋白質同型二聚化活性等功能和細胞成分有關，參與的信號通路包括AGE-RAGE信號通路、Rap1信號通路、PI3K-Akt信號通路等。其中，AGE-RAGE信號通路能夠觸發(fā)多種途徑，增加炎癥細胞因子的釋放，產(chǎn)生活性氧類，并激活核因子κB等加重DKD的進展[5,10]。而Rap1信號通路可以通過轉錄因子CCAAT/增強子結合蛋白-β-過氧化物酶體增殖物激活受體γ協(xié)同刺激因子1α信號改善鏈脲菌素誘導的糖尿病大鼠線粒體功能障礙，從而減輕腎小管損傷[11]。PI3K-Akt信號通路介導的自噬機制在DKD中受到抑制，降低了機體對高糖引起血管內皮功能障礙和足細胞損傷的敏感性，從而進一步加重腎損傷[12]。這表明篩選出的DEGs可以通過炎癥、氧化應激、線粒體功能障礙、自噬等途徑影響DKD的進展，但需進一步探究。

為了分析重疊的DEGs上游miRNA，本研究建立了miRNA-DEGs網(wǎng)絡分析，結果顯示hsa-miR-17-5p和hsa-miR-20a-5p共同靶向最多的6個DEGs，而這兩個miRNAs同屬于miR-17家族，由6個序列相似、結構相仿、種子區(qū)序列相同(AAAGUGCU)、物種間高度保守的成熟體miRNA組成。有研究表明，DKD患者腎組織miR-17-5p和miR-20a-5p表達水平升高，體外實驗中在高糖培養(yǎng)的小鼠足細胞中下調 miR-17-5p和miR-20a-5p能夠有效抑制足細胞功能障礙、凋亡和纖維化[13-14]。Tian等[15]的研究表明，miR-20a-5p與circ-ADAM9上調的人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因和自噬相關蛋白7相互作用，從而抑制Akt和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白的磷酸化，加劇高糖條件下內皮祖細胞的自噬和凋亡，引起血管內皮細胞功能障礙。在C57BL6J小鼠的糖尿病視網(wǎng)膜病變中，miR-20a-5p等8種miRNAs被檢測到表達異常，而VEGFA、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、過氧化物酶體增殖物激活受體α等被驗證為失調miRNA的靶標，繼而調節(jié)糖尿病視網(wǎng)膜的蛋白異常表達[16]。

在本研究PPI網(wǎng)絡和CytoHubba插件計算得到的Hub基因中，VEGFA占據(jù)網(wǎng)絡核心位置。VEGFA是足細胞高表達的血小板源性生長因子超家族的一種分泌型糖蛋白，其基因產(chǎn)物為同型二聚體，具有8個保守的半胱氨酸殘基，與腎小球內皮細胞遷移、分化和存活密切相關[17-19]。腎小球內皮細胞利用蛋白多糖、糖胺聚糖、糖蛋白和可溶性血漿蛋白組成的內皮糖萼可以限制蛋白質通過高度特異化的腎小球毛細血管壁，而VEGFA為腎小球內皮細胞提供必要的支持功能，如再生、維持“開窗”信號和調節(jié)蛋白通道信號等，因此VEGFA水平過度升高被認為是DKD白蛋白尿產(chǎn)生的原因之一[20-22]，而阻斷其受體血管內皮生長因子受體2可改善2型糖尿病DKD實驗模型的腎損害[23]。網(wǎng)絡藥理學研究表明，治療腎臟病的中藥制劑雷公藤和黃芪可能通過下調VEGFA，減輕腎臟炎癥，降低尿白蛋白水平[24-25]。因此推測DKD中miR-17家族過表達可引起足細胞損傷導致VEGFA分泌過度減少，腎小球內皮細胞功能異常，“開窗”信號不能維持，致使尿白蛋白水平升高不明顯，這可能是部分DKD患者腎小球濾過率已出現(xiàn)降低而尿白蛋白排泄未相應增加的原因。

綜上所述，本研究通過生物信息學技術獲得DEGs，分析其生物學功能和富集的信號通路，并借助在線工具尋找到核心基因VEGFA，與Geng等[26]的結果類似，在此基礎上進一步建立了miRNA-DEGs網(wǎng)絡，探討核心基因及其上游miRNA在DKD中所起的作用，為研究DKD的發(fā)病機制、診斷和治療提供了新見解。然而，本研究樣本量少且缺乏基礎實驗，下一步將進行動物實驗和細胞實驗加以驗證，以進一步闡明miR-17家族與VEGFA在DKD中的聯(lián)系和作用機制。