31份櫻屬材料親緣關(guān)系的ISSR分析

魏 杰，姚瑞紅，金夢然，劉雅蘭，寇紫倩，史寶勝

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園林與旅游學(xué)院，河北 保定 071000）

櫻屬（Cerasus）植物屬于薔薇科（Rosa）落葉喬木或灌木，包含植物種類數(shù)百種，集中分布于我國西部和西南部以及日本和朝鮮[1]。其中我國是世界櫻屬植物的起源中心，野生櫻屬植物資源最為豐富[2]。據(jù)最新統(tǒng)計，我國有櫻屬植物48種、10個變種[3]，均具有較高的觀賞價值和經(jīng)濟價值[4]。近年來，櫻屬植物的園林應(yīng)用方式也更加多樣，其中櫻花專類園及公園綠化是櫻屬植物應(yīng)用的最高表現(xiàn)形式[4-5]。

櫻屬植物資源豐富，分布范圍較廣，存在品種間授粉的現(xiàn)象，且近年來我國櫻屬植物育種工作成效顯著，出現(xiàn)許多新品種。加之地方文化差異，同名異物、同物異名現(xiàn)象普遍存在。因此櫻屬植物品種鑒定是十分必要的。Kawasaki[6]將櫻屬植物分為7組，并且得到了國際社會的普遍認可。吳保歡[7]根據(jù)形態(tài)特征對41種櫻屬植物進行聚類分析，將其分為11個類群。嚴春風(fēng)[8]將花色、花期作為主要分類依據(jù)，將55個品種按照花色分為5種顏色，根據(jù)花期分為4個花期，并對我國部分原生櫻屬植物進行了系統(tǒng)分類[9]。但是以形態(tài)特征為依據(jù)的分類方法存在環(huán)境、地域等條件的限制，導(dǎo)致分類結(jié)果不準確。

現(xiàn)代生物學(xué)蓬勃發(fā)展，分子標記技術(shù)與傳統(tǒng)方法相比具有更突出的優(yōu)點，它不受環(huán)境的影響、不受生長發(fā)育階段的影響、多態(tài)性高等特點[10]。1994年，Zietkeiwitcz[11]等人提出簡單重復(fù)系列區(qū)間（Intersimple Sequence Repeat，ISSR），該技術(shù)結(jié)合了 SSR和RAPD技術(shù)的優(yōu)點[12]。目前ISSR技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于園藝植物[12-14]的親緣關(guān)系鑒定中。Shahi-Gharahlar[15]和林立[16]分別對 39 個野生櫻亞屬和日本的39個櫻花品種進行了ISSR分析；蔣冬月[17]對浙江省部分櫻屬植物進行了親緣關(guān)系鑒定；周成城[18]對6份優(yōu)選材料和福建山櫻花進行了ISSR親緣關(guān)系分析。目前對櫻屬植物ISSR研究均集中于長江流域以南地區(qū)，華北地區(qū)主栽櫻屬植物研究未見報道。本研究以華北地區(qū)主栽的31個櫻花品種為試驗材料，進行親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析，以期了解華北地區(qū)櫻花主栽品種的親緣關(guān)系，并探討ISSR分子標記在櫻屬植物分類方面的應(yīng)用，為今后櫻花的品種鑒定和遺傳育種工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2020年9 月,櫻屬31個櫻花品種于采自山東省濰坊市、北京市海淀區(qū)和河北省保定市（見表1）。采集無病蟲害、生長健壯的葉片，擦拭干凈，用錫箔紙包裹裝入液氮瓶，然后保存于-80 ℃超低溫冰箱。

表1 31份櫻屬材料信息Table 1 Information of 31 Cerasus materials

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 利用康為世紀公司生產(chǎn)的新型植物基因組 DNA 提取試劑盒（NuClean Plant Genomic DNA Kit）提取31份櫻屬植物材料DNA。提取的DNA經(jīng)過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)中檢測DNA純度，并用NanoDrop 2000分光光度計檢測 DNA 濃度以及 OD260/280、OD260/230值[19]，于 -20 ℃保存。

1.2.2 ISSR與PCR擴增反應(yīng)體系 根據(jù)加拿大哥倫比亞大學(xué)設(shè)計并公布的通用引物序列[18]，由華大基因公司合成。經(jīng)過優(yōu)化，確定最終ISSR-PCR反應(yīng)體系為 25 μL 反應(yīng)液：100 ng DNA 模板，2 μL 引物（10 μmol/L），12.5 μL Master Mix，8.5 μL 去離子水。PCR 反應(yīng)程序為，94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性30 s，各種溫度復(fù)性 30 s，72 ℃延伸 90 s，共 35 個循環(huán)，72 ℃延伸 7 min，于 4 ℃保存。5 μL PCR 產(chǎn)物與 1 μL loading buffer經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，然后放置于凝膠成像系統(tǒng)中觀察條帶，拍照并記錄。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 通過人工讀帶的方式，對擴增產(chǎn)物的條帶數(shù)進行統(tǒng)計。同一引物擴增產(chǎn)物有條帶的記為1，無帶的記為0。構(gòu)建0、1條帶矩陣。利用POPGENE軟件來分析櫻屬植物的遺傳多樣性，對每一條引物擴增條帶，計算總位點數(shù)及多態(tài)性位點數(shù)，并構(gòu)建指紋圖譜。對該ISSR擴增條帶矩陣進行分析，分析指標包括多態(tài)位點百分率（PPB）、觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s遺傳多樣性指數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)。利用NTSYS軟件，根據(jù)各品種間的遺傳相似性系數(shù)，按照UPGMA法，做出聚類圖，并進行PCOA主坐標分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取效果

利用DNA試劑盒提取31份櫻屬植物材料DNA，提取結(jié)果如圖1所示。提取的DNA條帶清晰、完整、無降解，OD260/280的結(jié)果均在1.8～2.0之間，說明DNA純度較高，無蛋白質(zhì)等雜質(zhì)污染，可以滿足ISSR-PCR的試驗要求。

圖1 31份供試植物材料DNA電泳圖Fig. 1 DNA electrophoresis of 31 plant materials tested

2.2 ISSR引物篩選與擴增結(jié)果

由表2可知，最終篩選出14條條帶清晰、多態(tài)性好、明亮度高的引物[20]。31份櫻屬植物材料經(jīng)過ISSR-PCR擴增后，14條引物共擴增出141個重復(fù)性好、清晰穩(wěn)定的位點，其中多態(tài)性位點141個，多態(tài)性比例100%；各引物擴增的多態(tài)性位點數(shù)在7～13個之間，平均為10.07個位點（圖2）。

表2 優(yōu)選出的14條ISSR引物序列Table 2 14 ISSR primer sequences were optimized

圖2 引物UBC-841擴增圖譜Fig. 2 Amplification map of primer UBC-841

結(jié)果顯示，14條引物均可以擴增出多態(tài)性較高的位點，說明31份櫻屬植物材料具有較高的多態(tài)性，可以用于后續(xù)試驗分析。

2.3 遺傳多樣性分析

31份櫻屬植物材料的多態(tài)性比例均為100%，說明該材料對環(huán)境有較強的適應(yīng)能力，遺傳豐富度較高。利用軟件POPGENE1.32進行分析，結(jié)果顯示，31份櫻屬供試材料Na值為2.000 0，Ne值在1.033 1～1.963 7之間，平均有效等位基因數(shù)（Ne）為 1.352 5，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)在 0.032 0 ～ 0.490 8之間，平均 Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為0.231 0，Shannon多樣性指數(shù)在0.032 0～0.683 9之間，平均Shannon多樣性指數(shù)為0.374 0，表明供試材料間有豐富的遺傳多樣性。

2.4 親緣關(guān)系分析

由表3可知，31份櫻屬植物材料間的Nei’s遺傳相似性系數(shù)在0.517 7～0.922 0之間，‘雅櫻’和‘啟翁’之間遺傳相似性系數(shù)最?。↖=0.517 7），表明二者之間存在較大遺傳差異。‘松前更砂’和‘小松乙女’之間遺傳相似性系數(shù)最大（I=0.922 0），表明二者之間的親緣關(guān)系最近。

表3 31份櫻屬植物材料間的遺傳相似性系數(shù)Table 3Coefficients of genetic similarity among31Cerasus materials

2.5 聚類分析

基于ISSR擴增結(jié)果，按照非加權(quán)組平均法UPGMA聚類進行親緣關(guān)系分析，得到31份櫻屬植物材料的親緣關(guān)系樹狀圖，見圖3。在以遺傳相似性系數(shù)0.60為閾值，31個品種可分為2個類群（Ⅰ、Ⅱ），其中類群Ⅰ包含29份櫻屬植物材料，類群Ⅱ包含‘啟翁’和櫻桃。進一步以遺傳相似性系數(shù)0.69為閾值，類群Ⅰ可分為5個亞類群，亞類群Ⅰ1包含‘河津’、‘橫濱緋櫻’‘陽光’及其他櫻花品種；亞類群Ⅰ2包含‘江戶彼岸’‘八重紅枝垂’‘美國’‘思川’‘飛寒’‘染井吉野’、日本櫻花和‘小彼岸’8個品種；亞類群Ⅰ3包含‘八重紅大島’‘松前紅豐’‘松月’‘關(guān)山’‘郁金’‘白妙’6個品種，該類均為山櫻系組，與傳統(tǒng)分類保持一致；亞類群Ⅰ4包含‘雅櫻’和東京櫻花；亞類群Ⅰ5包含日本晚櫻重瓣和山櫻花。

圖3 31份櫻屬材料聚類圖Fig. 3 UPGMA dendrogram of 31 Cerasus materials

2.6 主坐標分析

基于31份供試材料的遺傳相似性系數(shù)，利用Ntsys軟件進行主坐標分析。對31份材料做主坐標分析并構(gòu)建二維散點圖（見圖4）。

圖4 31份櫻屬材料的主坐標分析圖Fig. 4 Principal coordinate analysis diagrams of 31 Cerasus materials

其結(jié)果與聚類結(jié)果基本一致，僅有日本櫻花和‘小彼岸’有一定差異。在UPGMA聚類中，日本櫻花、‘小彼岸’聚類于亞類群Ⅰ2中，而主坐標分析結(jié)果卻顯示日本櫻花、‘小彼岸’與亞類群Ⅰ4中品種親緣關(guān)系更近，可能是第4、第5貢獻值忽略的結(jié)果。

2.7 DNA指紋圖譜的構(gòu)建

通過對篩選出的14條引物，發(fā)現(xiàn)引物UBC835和UBC842對31份櫻屬植物材料能夠完全鑒別出來，有較好的鑒別效果，構(gòu)建出了31份植物材料指紋編碼對應(yīng)的標準指紋圖譜（見圖5）。從圖5可以更加直觀的看出31份櫻屬材料的多態(tài)性擴增情況，每個品種都有一套唯一的指紋編碼。

圖5 引物UBC835和UBC842構(gòu)建31份櫻屬材料的DNA指紋圖譜Fig. 5 DNA fingerprints of 31 Cerasus materials constructed by primer UBC835 and UBC842

3 討論與結(jié)論

ISSR是一種利用微衛(wèi)星序列作為 PCR引物生成多位點標記的技術(shù)。目前，該技術(shù)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于各種野生種與栽培品種的鑒定中[21]，可以作為常規(guī)表型分類、細胞學(xué)分類的重要補充手段[15]。31份櫻屬植物材料ISSR結(jié)果顯示，14條引物共擴增出141個位點，多態(tài)性位點占100%，平均Nei’s遺傳多樣性指數(shù)為0.231 0，表明所選的櫻屬植物材料具有較高的遺傳多樣性，品種間存在較豐富的遺傳變異。與下列研究相符合，林立[15]和周成城[17]的研究中，PPB分別為93.58%、93.75%，聚類結(jié)果較好，表明櫻屬植物品種間存在較豐富的遺傳變異，ISSR分子標記可以作為櫻屬植物品種間親緣關(guān)系分析的手段。在其他分子標記對櫻屬的研究中，劉厚宇[22]、?ZMH[23]和Kato[24]，運用REMAP、SSR分子標記技術(shù)，結(jié)果均表明櫻屬植物具有較豐富的遺傳多樣性。

31份櫻屬種質(zhì)資源基于遺傳相似性系數(shù)的UPGMA聚類和主坐標分析表明，具有相似遺傳背景的植物材料，彼此間遺傳相似性系數(shù)較大，親緣關(guān)系較近。在閾值為0.6時，中國櫻桃與江戶彼岸組、山櫻組、寒緋櫻組可以較好地區(qū)分開。類群Ⅰ是山櫻組、寒緋櫻組、江戶彼岸組混合品種。亞類群Ⅰ1中，‘河津’‘松前更砂’‘橫濱緋櫻’‘陽光’‘小松乙女’‘獎?wù)隆?，樹形為傘狀或傘形，花色均為粉紅色，故而聚為亞類群Ⅰ1，‘河津’與‘松前更砂’關(guān)系最近，可推測‘松前更砂’與‘河津’可能起源于共同祖先。‘仙臺垂枝’是枝條下垂品種，樹形為垂枝狀樹形，花色為粉白色。亞類群Ⅰ2除‘飛寒’外其余7個品種均為江戶彼岸組，有共同的祖先江戶彼岸，花序類型以江戶彼岸的傘形為主，花型以單瓣為主，花色均為粉白色?！w寒’與其它7個品種歸為一類，可能是因為‘飛寒’的花色與其它7種花色接近，花型為單瓣。亞類群Ⅰ3和Ⅰ5均為山櫻組，‘八重紅大島’‘松前紅豐’‘松月’‘關(guān)山’‘郁金’‘白妙’、日本晚櫻重瓣、山櫻花均有共同的祖先山櫻，遺傳背景相近，親緣關(guān)系較近，在花色、花序類型等表型方面相似，花色均為白色或粉色，其中在花型方面最為相似，以重瓣為主，其中亞類群Ⅰ5，日本晚櫻重瓣為山櫻花的變種，因此二者單獨聚為一類。類群Ⅱ包含‘啟翁’和櫻桃，‘啟翁’的親本之一是櫻桃，二者都屬于中國櫻桃組，故而‘啟翁’與櫻桃聚為類群Ⅱ。

根據(jù)ISSR分子標記結(jié)果，遺傳背景相似的品種，親緣關(guān)系也較近，并且發(fā)現(xiàn)花型、花色等表型性狀，可以作為鑒別櫻花品種的輔助手段。在本試驗中，單瓣品種主要為江戶彼岸組，而重瓣品種主要為山櫻組。

我國櫻花品種種類豐富[3]，但是櫻花產(chǎn)業(yè)起步較晚，沒有形成大規(guī)模、系統(tǒng)性的模式，櫻花品種鑒定工作困難。本研究利用選出的14條ISSR引物，在分子水平上揭示了櫻屬種質(zhì)資源具有豐富的遺傳多樣性，基于UPGMA聚類結(jié)果和主坐標分析，ISSR分子標記可以較好區(qū)分不同櫻屬不同品種。研究結(jié)果也證實，分子標記和表型形態(tài)相結(jié)合的方法可以有效對櫻屬種質(zhì)資源進行分類。因此，可利用ISSR分子標記對櫻屬觀賞植物進行親緣關(guān)系分析，為以后華北地區(qū)櫻花種質(zhì)資源利用開發(fā)提供理論依據(jù)。