生物樣品組織自由水氚測量制樣方法研究

韓萬春 朱月龍 蔣佳寧 高 陽 朱震宇

（中核核電運(yùn)行管理有限公司，浙江 海鹽314300）

0 引言

環(huán)境中的氚容易通過呼吸道、皮膚接觸、飲用水和食物鏈等途徑進(jìn)入人體，氚會(huì)發(fā)出β粒子，在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生電離，引起細(xì)胞DNA的單鏈斷裂，進(jìn)而導(dǎo)致基因突變[1]。生物樣品氫的同位素分布在自由水和有機(jī)化合物中，分布在自由水中的氚稱為組織自由水氚（TFWT），分布在有機(jī)化合物中的氚稱為有機(jī)結(jié)合氚（OBT）[2]。目前自由水氚通用的制樣方法主要有真空冷凍干燥法，高溫蒸餾法，共沸蒸餾法[3]。這些方法都有各自的優(yōu)缺點(diǎn)（表1）。制得的生物樣品組織自由水氚樣品采用低本底液體閃爍計(jì)數(shù)器測量氚活 度 濃 度[4，5]。

本文以旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀為基礎(chǔ)，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備樣品以測量生物樣品中組織自由水氚，滿足海洋環(huán)境、食品安全領(lǐng)域等監(jiān)測實(shí)驗(yàn)室日益增加的組織自由水氚樣品制備需求。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

蘿卜、牛奶、羊肉、大米等環(huán)境生物樣品，KMnO4（國藥）、Bradford蛋白定性檢測試劑盒（碧云天）、閃爍液（美國PerkinElmer OPTIPHASE“HISAFE”3）。

1.2 試驗(yàn)儀器

冷凍干燥儀（美國LABCONCO FREEZONE 2.5plus）、電爐、蛇形冷凝管、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、液閃譜儀（美國PerkinElmer Quantulus1220）、電導(dǎo)率儀（梅特勒）。

1.3 試驗(yàn)方法

樣品前處理：蘿卜、羊肉等體積大的生物樣品需要切成小塊。

樣品制備：

（1）冷凍脫水干燥法：固體生物樣品直接放在冷凍干燥儀上冷凍抽真空；液體生物樣品放在冰箱里冷凍成冰后，再放在冷凍干燥儀上冷凍抽真空。待組織自由水氚樣品被完全抽出后，樣品解凍，在300 mL制備樣品中加入1 g KMnO4，在蛇形冷凝管上共沸蒸餾，再用液體閃爍計(jì)數(shù)方法進(jìn)行測定。

（2）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法：將生物樣品直接放入加熱瓶內(nèi)，加熱，旋轉(zhuǎn)，抽真空，冷凝，定容，再在制得的組織自由水氚樣品中加入1 g KMnO4進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，再用液體閃爍計(jì)數(shù)方法進(jìn)行測定。制樣結(jié)束后，采用水洗氣吹裝置清洗冷凝管壁，防止對(duì)下次制樣產(chǎn)生記憶效應(yīng)（如圖1所示）。

圖1 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法示意圖

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)驗(yàn)室制備樣品時(shí)間統(tǒng)計(jì)

冷凍脫水干燥法及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備生物樣品的時(shí)間統(tǒng)計(jì)見表2。

表2 冷凍干燥法及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備樣品時(shí)間統(tǒng)計(jì)

2.2 Bradford蛋白定性檢測試劑盒檢測

牛奶是液態(tài)生物樣品，含有豐富的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)為有機(jī)物，在液閃譜儀測定時(shí)會(huì)產(chǎn)生干擾。Bradford檢測試劑盒測定蛋白表現(xiàn)出快速、穩(wěn)定、高靈敏度的特性用，該方法可以判斷制備的自由水氚樣品是否載帶蛋白質(zhì)。

Bradford蛋白定性檢測試劑遇到原牛奶會(huì)變成藍(lán)色（如圖2所示）。而Bradford蛋白定性檢測試劑與冷凍干燥機(jī)及旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀制備的樣品都不變色。實(shí)驗(yàn)證明這兩種方法制得的樣品都不會(huì)載帶蛋白，不會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生干擾。

圖2 Bradford蛋白定性實(shí)驗(yàn)

2.3 液閃譜儀測定的樣品結(jié)果

真空冷凍干燥法與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備樣品測量結(jié)果見表3。

表3 液閃譜儀測定結(jié)果

本次實(shí)驗(yàn)采集的都是環(huán)境中的生物樣品，發(fā)現(xiàn)生物樣品之間有良好的平行性，各生物樣品制得的組織自由水氚電導(dǎo)率都小于5μS/cm，可以滿足液閃測量需要。蘿卜、牛奶、羊肉、大米組織自由水氚測量結(jié)果的相對(duì)誤差分別為20.3%、5.3%、27.1%、0.8%。

3 結(jié)論

真空冷凍干燥法與旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法都能夠制備生物樣品組織自由水氚，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法的制樣速率比真空冷凍干燥法快幾十倍。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法還有提取土壤等樣品中自由水氚的能力。目前，國內(nèi)實(shí)驗(yàn)室基本采用真空冷凍干燥法作為生物樣品組織自由水氚制樣方法，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法可以作為真空冷凍干燥法的補(bǔ)充。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀與冷凍干燥法都能滿足生物樣品中組織自由水氚的測量要求。但是冷凍干燥儀價(jià)格昂貴，一般用于生命科學(xué)研究領(lǐng)域，如制備肽類化合物樣品等。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀價(jià)格相對(duì)便宜，一般在化學(xué)提純中使用較多，主要用于固液分離、液液分離。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在提取生物樣品組織自由水氚時(shí)，表現(xiàn)出樣品制備效率高、樣品質(zhì)量優(yōu)、能耗小的特點(diǎn)，在生物樣品組織自由水氚提取中有較好的經(jīng)濟(jì)性。

采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法制備樣品可以快速準(zhǔn)確地測量生物樣品中的組織自由水氚，該方法可以用于常規(guī)輻射環(huán)境監(jiān)測、事故應(yīng)急監(jiān)測、食品分析及人體內(nèi)氚含量測量，具有較廣的應(yīng)用范圍。