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    侵染湖南甘薯種質(zhì)資源的曲葉病毒和桿狀病毒的檢測及其親緣關(guān)系分析

    2021-11-08 12:09:12黃艷嵐張超凡張道微董芳鄒學(xué)校
    熱帶作物學(xué)報 2021年9期

    黃艷嵐 張超凡 張道微 董芳 鄒學(xué)校

    摘? 要:采用PCR技術(shù)對2015—2016年從湖南省多個市縣采集的180份甘薯種質(zhì)資源進(jìn)行兩種DNA病毒(sweet potato leaf curl virus,SPLCV和sweet potato badnavirus,SPBV)檢測,并以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列為基礎(chǔ),對這兩種病毒的親緣關(guān)系進(jìn)行分析。結(jié)果表明:(1)180份甘薯種質(zhì)資源中,22份檢測出SPLCV,占總數(shù)的12.2%;32份檢測出SPBV,占總數(shù)的17.8%;8份同時檢出SPLCV和SPBV這兩種病毒,占總數(shù)的3.9%。(2)檢出SPLCV的市縣有長沙、永州、懷化、邵陽、郴州、常德、婁底、益陽、岳陽和株洲;檢出SPBV的市縣有長沙、永州、懷化、衡陽和邵陽;檢出兩病毒復(fù)合侵染的市縣有懷化、長沙、永州和邵陽。(3)基于病毒全基因組序列分析顯示,全球已報道的36個SPLCV分離物可分為3組,本研究獲得的12個湖南分離物可分別歸于3個組中,其中6個歸于組Ⅰ,1個歸于組Ⅱ,5個歸于組Ⅲ,表明湖南SPLCV具有高度多樣性。(4)基于病毒運動蛋白和外殼蛋白編碼基因部分序列分析顯示,全球已報道的36個SPBV分離物可分為4組,絕大部分分離物屬于組Ⅰ,我國1個安徽分離物單獨成組(組Ⅱ),我國2個山東分離物和1個海南分離物構(gòu)成1個組(組Ⅲ),本研究獲得的2個湖南分離物其中1個歸于組Ⅰ,而另1個與已報道各分離物的核苷酸序列均存在顯著差異,相似性僅為74.92%,單獨成組(組Ⅳ),表明我國SPBV具有高度的變異性,存在多個變異類型。本研究結(jié)果可為湖南地區(qū)這兩種病毒病防控提供依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:甘薯種質(zhì)資源;甘薯曲葉病毒;甘薯桿狀病毒;鑒定與分析

    中圖分類號:S435.31????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

    Detection and Genetic Relationship Analysis of Sweet Potato Leaf Curl Virus and Sweet Potato Badnavirus Infecting Sweet Potato Germplasm Resources in Hunan, China

    HUANG Yanlan1, ZHANG Chaofan, ZHANG Daowei1, DONG Fang1, ZOU Xuexiao2*

    1. Crop Research Institute, Hunan Academy of Agricultural Sciences, Changsha, Hunan 410125, China; 2. Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China

    Abstract: 180 sweet potato germplasm resources from different regions of Hunan were used to detect sweet potato leaf curl virus (SPLCV) and sweet potato badnavirus (SPBV) during 2015-2016. The genetic relationship of the two viruses was analyzed based on the sequence of PCR amplification products. 22 sweet potato germplasm resources were infected with SPLCV, making up 12.2% of the total, and 32 sweet potato germplasm resources were infected with SPBV, or 17.8% of the total. There were 8 sweet potato germplasm resources infected with both SPLCV and SPPV, accounting for 3.9% of all 180 sweet potato germplasm resources. SPLCV was detected in Changsha, Yongzhou, Huaihua, Shaoyang, Chenzhou, Changde, Loudi, Yiyang, Yueyang and Zhuzhou. SPBV was detected in Changsha, Yongzhou, Huaihua, Hengyang and Shaoyang. Both SPLCV and SPBV were detected in Huaihua, Changsha, Yongzhou and Shaoyang. Based on the whole genome sequence analysis of the virus, 36 SPLCV isolates reported in the world were divided into 3 groups. The 12 strains isolated from Hunan obtained in this study could be classified into 3 groups, six of them belonged to groupⅠ and one of them to groupⅡ, five of them to groupsⅢ, meaning that sweet potato leaf curl virus was highly diverse in Hunan. Based on the partial sequence analysis of viral movement protein and coat protein coding genes, 36 SPBV isolates reported in the world could be divided into 4 groups, the most of isolates belong to group I, and one Anhui isolate in China was divided into groupⅡalone. Two Shandong isolates and one Henan isolate in China constituted groupⅢ. One of the two Hunan isolates obtained in this study belongs to groupⅠ, and the other was significantly different from the reported isolates, only 74.92% similarity, classified groupⅣ. The results indicate that SPBV have high variability and many types of variation in China. This study could offer a useful reference for prevention and control of these two kinds of sweet potato virus diseases in China.

    Keywords: sweet potato germplasm resources; sweet potato leaf curl virus; sweet potato badnavirus; identification and analysis

    DOI: 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.031

    甘薯(Ipomoea Batatas)在全球作物糧食生產(chǎn)中排名第七,是僅次于馬鈴薯和木薯的第三大塊根作物[1]。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織(FAO,2017)統(tǒng)計數(shù)據(jù),全球有120多個國家和地區(qū)種植甘薯,全世界甘薯種植面積約12.5×106 hm2,產(chǎn)量約18.5×107 t。甘薯為無性繁殖作物,病毒通過世代傳遞在甘薯塊莖中累積,導(dǎo)致產(chǎn)量逐年降低,因此帶病毒的甘薯種薯已成為世界各國產(chǎn)量存在差異的主要因素[1]。目前侵染甘薯的病毒達(dá)30多種[2]。國際病毒分類委員會(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)發(fā)布侵染甘薯的病毒有31種[3]。近年來,國內(nèi)外甘薯生產(chǎn)上報道的主要病毒病害為甘薯羽狀斑駁病毒(sweet potato feathery mottle virus,SPFMV)和甘薯褪綠矮化病毒(sweet potato chlorotic stunt vitus,SPCSV)復(fù)合侵染導(dǎo)致的復(fù)合病害[4],以及由甘薯曲葉病毒(sweet potato leaf curl virus,SPLCV)侵染產(chǎn)生的甘薯曲葉病害[5]。

    SPLCV是雙生病毒科(Geminiviridae)菜豆金色花葉病毒屬(Begomovirus)成員,基因組僅含有DNA-A,共編碼6個開放閱讀框:AV1(CP)、AV2、AC1、AC2、AC3 和AC4,由煙粉虱(Bemisia tabaci)以持久性方式傳播[6]。部分甘薯曲葉病毒侵染甘薯后葉片無明顯癥狀,多數(shù)表現(xiàn)為葉緣向上卷曲、葉脈黃化、葉脈間褪綠斑駁[7]。甘薯曲葉病毒病害是對甘薯生產(chǎn)危害較大的病毒病害之一,可導(dǎo)致甘薯減產(chǎn)20%~60%[8]。SPPV也稱為sweet potato badnavirus(SPBV),含SPBA-A和SPBB,屬花椰菜花葉病毒科(Caulimoviridae)桿狀DNA病毒屬(Badnavirus),包含5個開放閱讀框:ORF1、ORF2、ORF3a、ORF3b和ORF4[9],由粉蚧和少數(shù)種類的蚜蟲以半持久性方式傳播[10]。受SPPV侵染的甘薯植株無癥狀或表現(xiàn)為兩種以上病毒共同侵染的癥狀[2,11]。

    除甘薯種薯(種苗)易攜帶病毒外,甘薯種質(zhì)資源也存在不同程度的病毒感染。Paprotka等[12]在巴西甘薯種質(zhì)中鑒定出2個新的雙生病毒新種、3個新的株系和其他變異株系,甘薯曲葉病毒陽性檢測率為83.6%。Adane等[13]用ELISA方法檢測埃塞俄比亞甘薯種質(zhì)資源,存在甘薯羽狀斑駁病毒、甘薯褪綠矮化病毒和甘薯病毒2的陽性率達(dá)64.7%、36.8%和1.8%,部分種質(zhì)受甘薯羽狀斑駁病毒和甘薯褪綠矮化病毒共同侵染。Barkley等[14]檢測美國甘薯種質(zhì)資源,有6.7%種質(zhì)被檢測為甘薯曲葉病毒陽性。董芳等[15]對采自邵陽市、長沙市、永州市和株洲市4個地區(qū)的甘薯種質(zhì)檢測甘薯曲葉病毒,陽性率為5.7%。以上研究表明2種或2種以上甘薯病毒的復(fù)合侵染已不斷增加,導(dǎo)致協(xié)生而加重甘薯病毒病害[16]。

    以2015—2016年從湖南省各市縣采集的甘薯種質(zhì)及湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所甘薯種質(zhì)資源圃的種質(zhì)資源為材料,經(jīng)前期檢測,發(fā)現(xiàn)存在SPLCV[17]和SPPV[18]兩種DNA病毒,本文通過檢測甘薯曲葉病毒和甘薯桿狀病毒的發(fā)生及分布情況,為甘薯病毒病防控提供理論依據(jù)。

    1? 材料與方法

    1.1? 材料

    甘薯材料為101份地方品種和79份選育品種,共180份。地方品種是2015—2016年采自湖南省13個地級市34個縣(區(qū))的甘薯種質(zhì)資源;選育品種是采自湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所種質(zhì)資源圃的甘薯資源。采樣以1個甘薯塊根萌發(fā)的植株為1個混合樣本,葉片統(tǒng)一采摘甘薯植株新鮮展開頂葉3~4片,并記錄癥狀。

    1.2? 方法

    1.2.1? 甘薯葉片基因組DNA提取? 甘薯葉片基因組DNA提取參照CTAB法[19](CTAB、Tris、EDTA、PVP、TEMED購自北京鼎國公司;其余試劑為國產(chǎn)分析純)進(jìn)行。

    1.2.2? 甘薯DNA病毒PCR引物篩選及反應(yīng)體系的建立? SPLCV檢測引物參照背靠背引物L(fēng)CVQF1/R1、LCVQF2/R2、LCVQF3/R3和LCVQF4/R4[17]。SPBV檢測引物參照SPBV保守區(qū)引物SPBV-F1、SPBV-F2、SPBV-F3和SPBV- R1、SPBV-R2、SPBV-R3[18]。

    取甘薯葉片總DNA各3 ng為模板,利用SPLCV擴(kuò)增的引物組合LCVQF1/R1、LCVQF2/ R2、LCVQF3/R3和LCVQF4/R4(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,10 ?L反應(yīng)體系為:DNA模板約50 ng,2×Phanta Max Buffer 5 ?L,dNTP Mix(10 mmol/L)0.5 ?L,Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.2 ?L,上下游引物(10 ?mol/L)各0.5 ?L,ddH2O補(bǔ)足10 ?L。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸3 min,35個循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。經(jīng)PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物回收后與PMDTM19-T Vector連接,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,篩選陽性克隆,測序委托武漢奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行。利用SPBV正反引物兩兩配對組合(表1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,退火溫度58 ℃,72 ℃延伸1 min,其余反應(yīng)條件、測序鑒定與SPLCV鑒定的條件相同。

    1.2.3? 序列分析? 序列用Blast進(jìn)行比對,用MEGA7[20]軟件對SPLCV和SPPV的核酸序列進(jìn)行進(jìn)化分析,用Neighbor-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,分支可信度Bootstrap為1000。

    2? 結(jié)果與分析

    2.1? SPLCV的PCR檢測

    經(jīng)引物篩選,甘薯葉片DNA樣品用引物對LCVQF1/R1進(jìn)行PCR檢測,目的條帶特異性高。陽性對照為Sim- 陰性對照為N3020。經(jīng)檢測,樣品2、4、9、11和14能獲得近3000 bp的特異性目的條帶(圖1)。通過對180份甘薯樣品進(jìn)行全基因序列檢測,其中有22份檢測為陽性。將目的條帶回收測序,獲得12個SPLCV基因全序列,大小在2769~2835 bp之間。

    2.2? SPPV的PCR鑒定

    經(jīng)引物篩選,9對SPBV引物組合中,引物SPBVF3/R2擴(kuò)增序列特異性強(qiáng)。用引物組合SPBVF3/R2對甘薯葉片DNA樣品進(jìn)行PCR檢測,以Sim-1為陽性對照,以N3020為陰性對照。經(jīng)檢測,樣品1~14能擴(kuò)增出750 bp的目的條帶(圖2)。將目的條帶回收測序,獲得大小約700 bp的序列。通過對180份甘薯樣品進(jìn)行SPBV檢測,其中有32份檢測為陽性。

    2.3? SPLCV核酸序列聚類分析

    經(jīng)Blast序列分析,本研究所得的12個SPLCV與NCBI下載的36個SPLCV序列進(jìn)行核苷酸相似性分析,利用MEGA7的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)?;诓《救蛐蛄蟹治鲲@示,全球已報道的36個SPLCV分離物可分為3組,本研究獲得的12個湖南分離物與選取序列的核苷酸相似性為90%~99%,可分別歸為3個組:SPLCV(21-5)、SPLCV(77)、SPLCV(4156)、SPLCV(6-1)、SPLCV(6-A5)和SPLCV(6-68)歸于組Ⅰ,其中SPLCV(4156)與甘薯廣西曲葉病毒(KJ476510)的相似性為95.51%,SPLCV(6-1)和SPLCV(6-A5)序列相似性為99.89%;SPLCV(3)歸于組Ⅱ,與甘薯河南曲葉病毒4(KJ476509)、甘薯曲葉病毒日本分離物(AB433786)、甘薯曲葉病毒西班牙分離物(EF456744)、甘薯曲葉病毒日本分離物(AB433788)、甘薯曲葉病毒美國分離物(HQ333143)、甘薯曲葉病毒中國分離物(KX033430)聚為1組,其中SPLCV(3)與甘薯曲葉病毒日本分離物(AB433788)親緣關(guān)系最近,相似性為95.77%;SPLCV(8-76)、SPLCV(8-47)、SPLCV(5)、SPLCV(194)、SPLCV(6126)歸于組Ⅲ,與甘薯曲葉病毒中國分離物(DQ512731)、甘薯河南曲葉病毒(KC907406、KJ476507)聚為1組,其中SPLCV(8-76)與甘薯喬治亞曲葉病毒中國分離物(KX033423)親緣關(guān)系最近,相似性為98.38%,這與聚類分析結(jié)果一致。

    2.4? SPPV核酸序列聚類分析

    對32份材料測序結(jié)果進(jìn)行分析,序列可分為兩大類,因此聚類分析只選擇了SPPV-A1和SPPV-A22這2個代表性分離物。在NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫中,SPPV基因組全序列較少,本研究獲得SPPV-A1序列位于FJ560944核酸位點1563~2228 bp之間,SPPV-A22序列位于FJ560943核酸位點1514~2171 bp之間,均為ORF3a區(qū)域?;诓《具\動蛋白和外殼蛋白編碼基因部分序列分析顯示,全球已報道的36個SPBV分離物可分為4組(圖4),絕大部分分離物屬于組Ⅰ,我國1個安徽分離物(KT448757)單獨成組(組Ⅱ),我國2個山東分離物(KT448748、KT448743)和1個河南分離物(KT448763)構(gòu)成1個組(組Ⅲ),本研究獲得的2個湖南分離物,其中SPBV-A1歸于組Ⅰ,與甘薯桿狀病毒TZ分離物(KF836892)親緣關(guān)系最近,相似性為88.44%;而SPBV-A22與已報道各分離物的核苷酸序列均存在顯著差異,與甘薯桿狀病毒(FJ560943)相似性為74.92%,單獨成組(組Ⅳ),表明我國SPBV具有高度的變異性,存在多個變異類型。

    2.5? 甘薯種質(zhì)資源感染SPLCV和SPPV統(tǒng)計分析

    180份甘薯種質(zhì)資源共檢測出SPLCV陽性樣品22份,包括17份地方品種和5份選育品種,占總數(shù)的12.2%;檢測出SPPV陽性樣品32份,包括20份地方品種和12份選育品種,占總數(shù)的17.8%。其中8份甘薯種質(zhì)資源樣品均檢測出SPLCV和SPBV這兩種病毒,包含6份地方品種和2份選育品種,占總數(shù)的3.9%。SPLCV分布為:長沙5份,永州4份,懷化和邵陽3份,郴州2份,常德、婁底、益陽、岳陽和株洲各1份;SPBV分布為:長沙14份,永州8份,懷化5份,衡陽3份,邵陽1份;SPLCV和SPPV復(fù)合侵染的分布點為:懷化3份,長沙和永州2份,邵陽1份(表2)。

    3? 討論

    通過對湖南地區(qū)甘薯種質(zhì)資源SPLCV和SPPV檢測,從品種類型上分析,甘薯種質(zhì)資源地方品種病毒單獨侵染發(fā)生率和復(fù)合侵染發(fā)生率均高于選育品種。甘薯是無性繁殖作物,病毒通過昆蟲媒介傳播,在塊莖中逐年積累,使甘薯產(chǎn)量降低,當(dāng)?shù)剞r(nóng)戶自留種的種植習(xí)慣使病毒積累成為目前地方品種產(chǎn)量降低的主要因素,種薯(種苗)的跨區(qū)域流通更加促進(jìn)病毒的傳播和累積。從分布區(qū)域上分析,甘薯種質(zhì)資源SPLCV和SPPV檢測率較高的分布點為長沙、永州、懷化和邵陽,郴州、常德、婁底、益陽、岳陽和株洲的病毒檢測率較低,整體呈現(xiàn)出分布范圍廣、湘西南地區(qū)分布多,湘東北和湘西北分布較少的特點,病毒發(fā)病區(qū)域與董芳等[15]的研究結(jié)果相比有明顯增加,這與昆蟲媒介的傳播、種薯的流通及甘薯塊根內(nèi)病毒的不斷累積相關(guān)。此外,長沙地區(qū)作為城市核心地帶,帶病種薯通過核心區(qū)域的流通而促進(jìn)病毒的傳播。從病毒特征上分析,分離獲得12個SPLCV湖南分離物基因全序列可分別歸于3個組中,表明湖南SPLCV具有高度多樣性。不同地區(qū)的SPLCV株系具有一定的相似性,相鄰區(qū)域的SPLCV株系相似性較高,這與SPLCV在自然界傳播過程中極易發(fā)生重組變異而產(chǎn)生新的株系有關(guān)[21]。相比SPLCV,本研究獲得的2個SPBV湖南分離物中1個歸于組Ⅰ,而另1個與已報道各分離物的核苷酸序列均存在顯著差異,相似性僅為74.92%,單獨成組(組Ⅳ),表明我國SPBV具有高度的變異性,存在多個變異類型。

    自然界中植物病毒既能由單一的媒介進(jìn)行病毒傳播產(chǎn)生單獨侵染,也能由不同媒介進(jìn)行多種病毒共同傳播而產(chǎn)生復(fù)合侵染[22]。復(fù)合侵染可分為不同種間和相同種內(nèi)不同株系病毒的共同侵染,相比較單一侵染,病毒復(fù)合侵染能使寄主產(chǎn)生更嚴(yán)重的癥狀。不同種間病毒復(fù)合侵染在番茄、辣椒、菜豆上已有報道。劉微等[23-25]從帶病毒病癥狀番茄植株中檢測出番茄褪綠病毒和番茄黃化曲葉病毒。王少立等[26]從山東辣椒檢測出辣椒輕斑駁病毒和黃瓜花葉病毒。相同種間復(fù)合侵染如趙麗玲等[27]在云南凹頭莧檢測出番茄黃化曲葉病毒和勝紅薊黃脈病毒;Li等[28]在四川菜豆檢測出煙草曲莖病毒、番茄黃化曲葉病毒和煙草曲莖病毒衛(wèi)星DNA。甘薯不同種間復(fù)合侵染也有類似報道,黃利利等[8]檢測廣西甘薯病毒由兩種或兩種以上RNA和DNA病毒復(fù)合侵染,使甘薯表現(xiàn)出復(fù)雜的癥狀。姜珊珊等[29]檢測出甘薯褪綠矮化病毒和甘薯曲葉病毒復(fù)合侵染山東甘薯,由此產(chǎn)生多重PCR方法檢測用于甘薯病毒復(fù)合侵染的鑒定[30-31]。本研究從8份甘薯種質(zhì)資源中檢測的兩種病毒為不同種間的病毒,且均為侵染甘薯的DNA病毒,葉片表現(xiàn)出嚴(yán)重上卷、葉脈肥大及葉片扇形皺縮等癥狀。Mbanzibwa等[32]從葉片卷曲、黃脈和生長發(fā)育遲緩的甘薯樣本中檢測出SPPV和SpSV/1這兩種DNA病毒。表明病毒復(fù)合侵染甘薯產(chǎn)生的癥狀比單獨侵染更重更復(fù)雜,而且DNA病毒單獨侵染率和復(fù)合侵染率均呈增加趨勢[33]。

    目前針對單獨侵染或復(fù)合侵染后具有相應(yīng)病毒病癥狀的甘薯種質(zhì)資源可以利用莖尖脫毒技術(shù)繁育健康種薯(種苗),對生產(chǎn)上流通的種薯或癥狀不明顯而又需要檢測的甘薯種質(zhì)資源可以提取種薯(種苗)DNA,用SPLCV和SPPV病毒特異性引物進(jìn)行PCR鑒定,達(dá)到快速檢測目的,最大程度上降低該病毒的傳播,對甘薯種質(zhì)資源的保存與利用具有重要意義。

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    責(zé)任編輯:沈德發(fā)

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