蘭科蝦脊蘭屬HSP70基因家族及其適應(yīng)性進(jìn)化

朱雅婷 俞霞 李笑平 劉仲健 吳沙沙 蘭思仁 翟俊文

摘? 要：生物體受環(huán)境刺激，尤其是高溫刺激時會迅速產(chǎn)生熱激蛋白（Heat shock proteins，HSPs），幫助受逆境脅迫導(dǎo)致的變性蛋白恢復(fù)正常到折疊狀態(tài)，以維持其正常生長。蘭科（Orchidaceae）蝦脊蘭屬（Calanthe R. Br.）植物海拔分布范圍可從海平面至3 500 m，是研究HSP基因家族的理想材料。本研究通過蝦脊蘭屬7種植物葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行HSP70基因的篩選，再對各基因的理化參數(shù)、家族標(biāo)簽、保守結(jié)構(gòu)域和選擇壓力等參數(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，7種植物中共鑒定出47個HSP70基因，且發(fā)現(xiàn)隨著物種海拔的降低基因數(shù)量依次增多，其中大黃花蝦脊蘭（C. striata）和三棱蝦脊蘭（C. tricarinata）分別為4個，三褶蝦脊蘭（C. triplicata）5個，香花蝦脊蘭（C. odora）7個，長距蝦脊蘭（C. sylvatica）8個，銀帶蝦脊蘭（C. argenteo-striata）9個，中華蝦脊蘭（C. sinica）10個，其基因數(shù)量可能與物種對溫度的適應(yīng)進(jìn)化相關(guān);HSP70s基因有典型的3個結(jié)構(gòu)域和標(biāo)簽，且N-末端motif數(shù)量最多;選擇壓力Ka/Ks< 基因家族較保守，表明其受到了純化選擇;系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，HSP70s基因聚為6組，相同亞細(xì)胞的基因聚為一組，說明同一細(xì)胞器的HSP70s可能具有相似的功能。該研究結(jié)果為蝦脊蘭屬植物HSP基因家族的功能和對環(huán)境的適應(yīng)性進(jìn)化提供了新視角，為其適應(yīng)性育種提供參考。

關(guān)鍵詞：蝦脊蘭屬;適應(yīng)性進(jìn)化;熱激蛋白

中圖分類號：S682.31????? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Analysis of HSP70 Gene Family and Adaptive Evolution in Calanthe （Orchidaceae）

ZHU Yating， YU Xia， LI Xiaoping， LIU Zhongjian， WU Shasha， LAN Siren， ZHAI Junwen*

Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration for Orchid Conservation and Utilization， College of Landscape Architecture， Fujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian 350002， China

Abstract： Heat shock proteins （HSPs） emerge quickly when organisms are stimulated， especially by high temperature， which help the denatured protein return to its normal folding state so as to maintain its normal growth. Calanthe R. Br. （Orchidaceae） is an ideal group of plant to study the HSP gene family as they present an altitude distribution range from 0 m up to 3 500 m. In this study， HSP70s genes of seven Calanthe plants were identified through transcriptome data; consequently physical and chemical parameters， gene family tags， conserved domains and selection pressure of the each gene were analyzed. A total of 47 HSP70 gene sequences were confirmed in the seven plants， and the gene numbers increased in descending order along with the altitude. Among them， there were four sequences in C. striata and C. tricarinata， five in C. triplicata， seven in C. odora， eight in C. sylvatica， nine in C. argenteo–striata and ten in C. sinica. HSP70 genes had three typical domains and tags， and the number of N–terminal motifs was the largest. The selection pressure Ka/Ks<1， which revealed the gene family was conservative， subject to purification selection. Phylogenetic analysis showed that HSP70s were clustered into 6 groups. The genes from the same subcells were clustered into one group， which inferred that the HSP70 from the same organelle had similar functions. The results of this study would provide a new perspective for the study of the function and adaptive evolution of HSP family genes in the genus Calanthe， and provide suggestions for the adaptive breeding.

Keywords： Calanthe R. Br.; adaptive evolution; heat shock protein

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561. 2021.09.009

熱激蛋白（Heat shock proteins，HSPs）幾乎存在所有生物體中，按分子量的大小，可分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60及HSP20等5個大家族，其中HSP70家族是生物體中分布最廣泛、最保守的基因家族，研究也最為深入[1]。該基因的一級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列由2個部分組成：N-末端44 kD的ATP酶結(jié)構(gòu)域（NBD），約由450個氨基酸殘基組成的高度保守區(qū);C-末端25 kD的底物結(jié)合域（SBD），約由200個氨基酸組成，又可以分為一個15 kD左右相對保守的多肽的結(jié)合部位，另一個10 kD可變區(qū)域結(jié)合域[2]。

HSP70基因家族的生物學(xué)功能包括2大類，一類作為分子伴侶，輔助蛋白質(zhì)的正確折疊、組裝和轉(zhuǎn)運(yùn)且維持構(gòu)象的穩(wěn)定[3-4]。如新生肽鏈從核糖體釋放后，由于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)高濃度的溶質(zhì)環(huán)境，易使肽鏈包裹一些疏水性殘基，造成錯誤的卷曲折疊，HSP70s便可以保護(hù)新生的肽鏈不聚集，防止非天然構(gòu)象形成[5]。另一類參與一些應(yīng)激反應(yīng)，包括植物體內(nèi)的干旱、低溫、高溫、鹽度和重金屬等多個代謝調(diào)控。如鐵皮石斛（Dendrobium officinale）受低溫脅迫后HSP70開始表達(dá)且能維持?jǐn)?shù)小時，表明參與了低溫的逆境脅迫[6];參與植物病毒組分及金屬脅迫的互作機(jī)制，相同物種在冶煉廠污染區(qū)和未污染生境條件下，前者體內(nèi)HSP70表達(dá)水平明顯更高[7-9]。及可被熱激誘導(dǎo)并提高耐熱性，擬南芥（Arabidopsis thaliana）經(jīng)熱處理后HSP70表達(dá)量激增，且過表達(dá)可以提高植株的耐熱或耐旱能力[10-11]。同時部分研究顯示物種的耐熱程度與HSP70基因的表達(dá)相關(guān)，如低海拔蝴蝶的HSP70表達(dá)比高海拔蝴蝶高[12]。

中國分布的蝦脊蘭屬（Calanthe R. Br.）植物有60余種，屬內(nèi)物種多樣性較高，超過20種為中國特有。該屬植物在氣候溫和的中新世中期分化，后因?yàn)榍嗖馗咴奶\(yùn)動導(dǎo)致氣候變冷卻，使得高山起源的蝦脊蘭屬植物為應(yīng)對氣候變化逐漸向低海拔區(qū)域擴(kuò)散，形成從海平面至3500 m以上的垂直分布格局[13]。蝦脊蘭屬植物在應(yīng)對溫度變化時產(chǎn)生了新的適應(yīng)性，使得不同種演化出不同的海拔分布格局，是研究適應(yīng)性較理想的材料。熱激蛋白是適應(yīng)環(huán)境變化的一個重要媒介分子，在生物長期適應(yīng)環(huán)境溫度中起著重要的作用。本研究中以分布于不同海拔范圍的蝦脊蘭屬7種植物作為研究對象，從生物信息學(xué)角度分析蝦脊蘭屬植物的HSP70基因家族特性，對研究該屬的適應(yīng)性進(jìn)化有一定的參考價值。

1? 材料與方法

1.1? 材料

實(shí)驗(yàn)材料中華蝦脊蘭（C. sinica）、銀帶蝦脊蘭（C. argenteo-striata）、長距蝦脊蘭（C. sylvatica）和三褶蝦脊蘭（C. triplicata）已種植于海拔35 m的福建農(nóng)林大學(xué)蘭苑1年，2016年6月取樣。香花蝦脊蘭（C. odora）來源于云南昆明海拔810 m原生境，大黃花蝦脊蘭（C. sieboldii）來源于湖南陽明山海拔1200 m原生境，三棱蝦脊蘭（C. tricarinata）來源于四川黃龍風(fēng)景區(qū)海拔1700 m原生境，這3種蝦脊蘭屬植物于2017年6月取樣。中華蝦脊蘭、銀帶蝦脊蘭、香花蝦脊蘭、長距蝦脊蘭和三褶蝦脊蘭是低海拔耐熱物種，海拔分布范圍分別為0～1100、500～1200、750～1300、800～2000、0～3000 m，三褶蝦脊蘭分布較廣，總體上低海拔分布較多。大黃花蝦脊蘭和三棱蝦脊蘭是高海拔耐寒物種，海拔分布范圍為1200～1500 m和300～3500 m[13]。外類群用深圳擬蘭（Apostasia shenzhenica）和鐵皮石斛（Dendrobium catenatum）已測序的基因組數(shù)據(jù)。

1.2? 方法

1.2.1? 樣品的采集與測序? 采集蝦脊蘭屬植物新鮮幼嫩的葉片作為轉(zhuǎn)錄組樣品，采樣前用70%的酒精和超純水對植株葉片表面進(jìn)行噴灑清洗，樣品于液氮中冷凍并轉(zhuǎn)移至–80 ℃超低溫冰箱保存。提取總RNA并構(gòu)建文庫，在Illumina Hiseq 2000平臺上對文庫進(jìn)行測序。深圳擬蘭、鐵皮石斛基因組數(shù)據(jù)信息在NCBI下載所得（https：// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore）。

1.2.2? HSP70基因家族成員的鑒定? 使用蝴蝶蘭‘滿天紅的PhHSP70 cDNA為查詢序列（GenBank登錄號為 MG214259），BLAST（比對閾值設(shè)置為1e-5）鑒定蝦脊蘭屬植物、深圳擬蘭和鐵皮石斛中HSP70基因家族成員。設(shè)置默認(rèn)E值的HMMER 3.0程序，用HSP70結(jié)構(gòu)域（PF00012）來搜索鑒定候選基因[14]。將候選基因的蛋白序列分別提交至CDD（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）、Pfam（https：//pfam.xfam.org/）和SMART（http：//smart. embl-heidelberg.de/）以確認(rèn)HSP70的保守域[15-16]。最后用軟件cdhit-4.6.2去除冗余序列[17]。

1.2.3? 蝦脊蘭屬HSP70基因家族物理特性與保守基序的獲取? 所有高可信度HSP70s序列均提交至ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/），以計(jì)算氨基酸數(shù)量、分子量和理論等電點(diǎn)[18]。使用MEME程序（版本4.11.2，http：//alternate.meme- suite.org/tools/meme）[19]來識別HSP70序列中的保守基序，其參數(shù)如下：任意重復(fù)次數(shù)最多10個，最佳基序?qū)挾?～200個氨基酸殘基。

1.2.4? 亞細(xì)胞定位與多重序列比對? 將HSP70蛋白序列分別提交至BIOCOMP（http：// busca.biocomp.unibo.it）和WoLF PSORT II（http：// www.genscript.com/wolf-psort.html），以分析HSP70s的亞細(xì)胞定位[20]。最后確認(rèn)的HSP70基因用Jalview軟件可視化比對序列[21]。

1.2.5? 系統(tǒng)演化關(guān)系構(gòu)建? 同源基因的選擇壓力采用tbtool（simple Ka/Ks calculator）工具分析。將檢索到的深圳擬蘭、鐵皮石斛和7種蝦脊蘭屬植物HSP70基因家族成員用MEGA比對[22]，再用CIPRES Science Gateway網(wǎng)站（https：//www. phylo.org/）構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹，參數(shù)使用默認(rèn)值[23]。

2? 結(jié)果與分析

2.1? HSP70基因家族同源序列鑒定

本研究基于蝦脊蘭屬7個植物的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)共獲得47個HSP70基因，其中大黃花蝦脊蘭所含的4個被命名為CSIEHSP7001～CSIEHSP7004，三棱蝦脊蘭的4個被命名為CTRAHSP7001～ CTRAHSP7004，三褶蝦脊蘭的5個被命名為CTRIHSP7001～CTRIHSP7005，香花蝦脊蘭的7個被命名為CODOHSP7001～CODOHSP7007，長距蝦脊蘭的8個被命名為CSYLHSP7001～ CSYLHSP7008，銀帶蝦脊蘭的9個被命名為CARGHSP7001～CARGHSP7009，中華蝦脊蘭的10個被命名為CSINHSP7001～CSINHSP7010，其等電點(diǎn)、分子量和亞細(xì)胞定位信息見表1。此外，本研究從深圳擬蘭基因組數(shù)據(jù)中篩共選出17個HSP70候選基因（如Ash012061等），鐵皮石斛基因組數(shù)據(jù)中篩選出23個HSP70候選基因（如XP_020702966.1等）。

ExPASy計(jì)算的結(jié)果如表1所示，蝦脊蘭屬植物的47個HSP70蛋白序列差異較大，三棱蝦脊蘭、大黃花蝦脊蘭、三褶蝦脊蘭、香花蝦脊蘭、長距蝦脊蘭、銀帶蝦脊蘭和中華蝦脊蘭的氨基酸長度分子量分別為663～704、652～709、131～751、583～716、115～706、137～704、和101～706;等電點(diǎn)分別為5.09～6.08、4.99～6.01、4.65～8.12、4.87～ 6.63、4.55～7.31、4.72～8.86和4.30～9.05;分子量分別為73 008.97～75 104.05、71 400.99～76 285.95、73 457.43～82 452.76、63 570.05～76 428.61、12 825.61～ 76 046.77、14 961.48～75 176.07、10 940.19～ 75 985.74 kDa。

使用BIOCOMP和WoLF PSORT進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，檢測到蝦脊蘭屬植物HSP70成員分別位于葉綠體、線粒體、細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。細(xì)胞質(zhì)中數(shù)量變化最大，三棱蝦脊蘭和大黃蝦脊蘭各只含有1個，中華蝦脊蘭和長距蝦脊蘭各含有5個。

2.2? HSP70基因序列特征和結(jié)構(gòu)分析

蝦脊蘭屬植物HSP70含有3個典型的家族標(biāo)簽：IDLGTT（Y/N）S、（I/V）（F/Y）DLGGGTFD（I/V） S（L/I/V）L和（L/I/V）LVGG（S/M）TRIP（K/R/A）（V/ A）Q。HSP70s基因C-末端含有特定的短片段序列，這些有特征的短序列可將HSP70引向不同亞細(xì)胞內(nèi)。蝦脊蘭屬植物葉綠體HSP70的定位序列含有DVIDADF（T/S）D（D/S）（SK）/（DTKS）基序，線粒體的定位序列含有PEAEFEEVKK/ （NRAARAYRKK），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位序列含有（H/K） DEL基序，細(xì)胞質(zhì)的定位序列EEVD與其他生物一樣（圖1A～圖1D）。

同時該屬植物HSP70的氨基酸序列含有3個保守結(jié)構(gòu)域，N端ATPase結(jié)構(gòu)域，中間鉸鏈區(qū)和C端區(qū)域，其中N-端存有的ATP結(jié)合位點(diǎn)為A（S/E）（K/S/A）（F/Y）L（N/G）（D/K/S/T）（K/S/N/T/P）。

2.3? 進(jìn)化壓力計(jì)算

為了確認(rèn)HSP70在演化過程中的選擇壓力，對蝦脊蘭屬內(nèi)HSP70同源基因編碼序列進(jìn)行Ka/Ks計(jì)算。系統(tǒng)進(jìn)化樹直系同源基因?qū)Φ腒a/Ks值除CSYLHSP7005-CSINHSP7004較大，為0.56，其余均小于0.5（圖2）。

2.4? 蝦脊蘭屬HSP70保守基序分析

使用MEME工具分析了HSP70的保守基序，結(jié)果顯示蝦脊蘭屬7個物種存在10個保守基序。利用CDD進(jìn)一步分析10個保守基序，再物理定位10個motif在基因中的位置。N端motifs數(shù)量多于C端，其中motif 1、2、5、6、8、9、10為HSP70的N端核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（nucleotidebinding domain，NBD）的結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。此外motif 8被鑒定為生物素化鈣調(diào)蛋白（CaM）結(jié)合位點(diǎn)（RAL（R＼S＼G）（R＼K）LR（T＼R）（A＼E） （C＼A）ERAKR（A＼T）LS（S＼N）（T＼Q）（A＼H）），見圖4。

2.5? 蝦脊蘭屬植物HSP70基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析

以鐵皮石斛和深圳擬蘭為外類群，對蝦脊蘭屬植物47條HSP70s蛋白序列進(jìn)行比對，構(gòu)建ML系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖5，不同細(xì)胞器的蛋白質(zhì)序列聚為6組，不同物種中同一細(xì)胞器的HSP70聚集在一起。第Ⅰ組為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的HSP70s基因。第Ⅱ組主要為鐵皮石斛和深圳擬蘭細(xì)胞質(zhì)中的HSP70s基因，蝦脊蘭屬植物細(xì)胞質(zhì)中的HSP70s基因主要位于第Ⅲ組。第Ⅳ組中只包含鐵皮石斛和深圳擬蘭HSP70s基因，位于葉綠體中。第Ⅴ組為蝦脊蘭屬植物葉綠體HSP70s基因。第Ⅵ組為線粒體中的HSP70s基因。系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定蝦脊蘭屬中11對直系同源基因，其中海拔相近的物種的HSP70聚為一對（CODOHSP7004和CTRIHSP7004）。

3? 討論

3.1? HSP70基因數(shù)量與適應(yīng)性進(jìn)化

高等植物HSP基因家族的數(shù)量高于低等植物，可能是高等植物需要更多的基因來維持生物過程，大豆和煙草中各含有61個HSP70基因[1，24]，水稻中含有32個HSP70基因[25]，辣椒中含有21個HSP70基因[26]，擬南芥中含有18個HSP70基因[27]，海洋真核微藻Ostreococcus lucimarinus中含有8個HSP70基因及Ostreococcus tauri中含有7個HSP70基因[28]。也有研究表明高等植物中HSP70基因家族進(jìn)化存在多樣性，這種多樣性可能與其對環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)，如蘭科中鐵皮石斛的HSP70基因家族成員比小蘭嶼蝴蝶蘭多2倍，推測鐵皮石斛比小蘭嶼蝴蝶的適應(yīng)性更強(qiáng)，分布更加廣泛[29]。

本研究中所用蝦脊蘭屬7種植物共鑒定47個HSP70基因家族成員，不同植物基因家族數(shù)量不一，中華蝦脊蘭10個、銀帶蝦脊蘭9個、長距蝦脊蘭8個、香花蝦脊蘭7個、三褶蝦脊蘭5個、大黃花蝦脊蘭和三棱蝦脊蘭各4個。結(jié)合前人研究，蝦脊蘭屬在冷氣候的選擇壓力下，從高海拔逐漸擴(kuò)散到低海拔。推測隨著海拔的降低，蝦脊蘭屬內(nèi)HSP70基因數(shù)量逐漸增多，以適應(yīng)低海拔高溫氣候。另外銀帶蝦脊蘭、香花蝦脊蘭、中華蝦脊蘭、長距蝦脊蘭和三褶蝦脊蘭從中新世開始逐漸積累和形成[13]，在長期面對古氣候脅迫時形成的環(huán)境功能基因HSP70多，有利于適應(yīng)氣候變換。

3.2? 蝦脊蘭屬植物HSP70s基因結(jié)構(gòu)特征

蝦脊蘭屬植物HSP70s有3個保守結(jié)構(gòu)域，N端一個較保守的ATPase結(jié)構(gòu)域，中間鉸鏈區(qū)和C端可變區(qū)，C末端的變化可極大地改變螺旋的位置，對蛋白質(zhì)功能上產(chǎn)生影響，極可能決定了單個HSP70的功能特異性[30-32]。同時鑒定到7種蝦脊蘭屬植物HSP70基因的N-端ATP結(jié)合位點(diǎn)為A（S/E）（K/S/A）（F/Y）L（N/G）（D/K/S/T）（K/S/N/T/P）。N端ATP基序的結(jié)合是重要調(diào)制器，直接影響HSP70表達(dá)[33]。ATP水解是HSP70家族蛋白質(zhì)執(zhí)行分子伴侶功能所必須的條件，能誘導(dǎo)ATPase結(jié)構(gòu)域構(gòu)象變化，ATP結(jié)合到HSP70上才能使底物從結(jié)合結(jié)構(gòu)域上釋放出來[2]。

蝦脊蘭屬植物HSP70s與其他植物相比同樣具有該家族高度保守的序列特征，含有3個典型的家族標(biāo)簽：IDLGTT（Y/N）S、（I/V）（F/Y） DLGGGTFD（I/V）S（L/I/V）L和（I/V）VLVGG （S/M） TRIP（K/R/A）（V/A）（Q/S）。在真核生物中HSP70基因C末端序列，是將HSP70向特定細(xì)胞器進(jìn)行轉(zhuǎn)移的靶標(biāo)[31，32，34-35]。在不同細(xì)胞器上，蝦脊蘭屬HSP70基因家族的末端序列有各自的特點(diǎn)，且在序列上有高度保守和變化的位點(diǎn)。例如，葉綠體HSP70s末端定位片段為DVIDADF（T/S）D （D/S） （SK）/（DTKS），線粒體HSP70s末端定片段為PEAEFEEVKK/（NRAARAYRKK），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)HSP70s末端定位片段為（H/K）DEL，而細(xì)胞質(zhì)HSP70s末端為EEVD，該特征在動物和植物中具有高度的保守性，可能具有特定的功能。有些真核生物細(xì)胞質(zhì)HSP70的EEVD參與HSP70功能的分子內(nèi)調(diào)控和與分子間相互作用，可與一個保守的肽重復(fù)（TPR）結(jié)構(gòu)域相互作用（如Hsp40、CHIP、HIP等具有TRP結(jié)構(gòu)域），促進(jìn)HSP70復(fù)合物的組裝，如HIP與HSP70的結(jié)合可誘導(dǎo)HSP70的ATP酶結(jié)構(gòu)域發(fā)生構(gòu)象變化，從而抑制HSP70的ATP酶活性[36-37]。若刪除或突變EEVD發(fā)現(xiàn)會影響HSP70的ATP酶活性以及與底物結(jié)合活性[38]。

3.3? 不同物種GC含量差異的原因及基因選擇壓力

在選擇壓力分析中，Ka/Ks表示非義替換（Ka）和同義替換（Ks）之間的比例，這個比例可以判斷是否有選擇壓力作用于這個蛋白質(zhì)編碼基因。當(dāng)Ka/Ks> 基因受正選擇（positive selection）即非純化選擇（diversifying selection），表明基因在該進(jìn)化時間點(diǎn)可能產(chǎn)生一些新功能，這往往可能導(dǎo)致新基因或者物種新品種的產(chǎn)生;如果Ka/Ks= 則基因受中性選擇;如果Ka/Ks< 則基因受負(fù)選擇（negative selection）即純化選擇（purifyingd selection），當(dāng)基因處于強(qiáng)烈負(fù)選擇時，則意味著該物種的蛋白質(zhì)保持原有的重要功能且趨于穩(wěn)定[39-40]。蝦脊蘭屬植物HSP70直系同源基因Ka/Ks<0.5，說明了該基因在蝦脊蘭屬中演化較慢且高度保守，在結(jié)構(gòu)甚至是功能上已經(jīng)具有一定的穩(wěn)定性。

3.4? 蝦脊蘭屬植物HSP70s基序與保守性

蝦脊蘭屬植物中HSP70 N端的結(jié)合位點(diǎn)多于C端，且存在生物素化鈣調(diào)蛋白（CaM）結(jié)合位點(diǎn)（RAL（R＼S＼G）（R＼K）LR（T＼R）（A＼E）（C＼A）ERAKR （A＼T）LS（S＼N）（T＼Q）（A＼H）），即motif 8。研究顯示，擬南芥和玉米（Zea mays）幼苗都存在CaM位點(diǎn)[41-42]，用CaCl2溶液預(yù)處理玉米種子可顯著增強(qiáng)其耐熱性[43]。蝦脊蘭屬植物中該位點(diǎn)的作用能否增加耐熱性，還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

結(jié)合蝦脊蘭屬系統(tǒng)發(fā)育樹分析發(fā)現(xiàn)，距離較近的HSP70具有相似的motif組成，motif組成越相似，進(jìn)化方式和基因功能則可能越相近，這與玉米[35]、擬南芥[10， 27]、大豆[1]、水稻[25， 44]等模式植物的研究結(jié)果較為相似。蝦脊蘭屬植物motif除了細(xì)胞質(zhì)中HSP70存在缺失、移位和置換，其他HSP70家族成員之間幾乎沒有缺失，證明了HSP70s家族在蝦脊蘭屬內(nèi)保守性非常高。

3.5? HSP70s在蘭科中的分化及功能

通過牛耳草[45]、大豆[1]、煙草[24]等HSP70s基因家族的研究，發(fā)現(xiàn)該基因在雙子葉植物/單子葉植物分化之前產(chǎn)生，從單個共同的祖先HSP70基因經(jīng)過遠(yuǎn)古復(fù)制事件產(chǎn)生進(jìn)化而來，在不同物種內(nèi)基因數(shù)量、結(jié)構(gòu)等有自身的特異性擴(kuò)展，從而增加了HSP70s在物種內(nèi)的多樣性，這種特異性進(jìn)化體現(xiàn)了物種在適應(yīng)環(huán)境過程有自身的選擇性。對蝦脊蘭屬植物HSP70基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，所有不同物種HSP70s在6組中均有分布，不存在完全單獨(dú)的分枝;蝦脊蘭屬直系同源基因11對，深圳擬蘭和鐵皮石斛有4對。由于直系同源片段起源于物種分化，因此可以判斷，起源于共同祖先的直系同源HSP70基因在蘭科植物分離前就存在。

系統(tǒng)發(fā)育分析中，相同細(xì)胞器中HSP70s聚為一枝，類似現(xiàn)象出現(xiàn)在玉米[35]、擬南芥[10，27]、水稻[25， 44]、煙草[24]等植物HSP70s基因家族中。此外還發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞質(zhì)HSP70更傾向于結(jié)合富含亮氨酸的肽基序（即富含脂肪族殘基），線粒體同源HSPA5更傾向于芳香殘基序[46]。說明蝦脊蘭屬不同植物的相同細(xì)胞器中HSP70s比同一物種不同細(xì)胞器中HSP70s的同源性要高，相同細(xì)胞器的HSP70s基因具有相似的功能，且有9對直系同源基因序列來源于海拔分布范圍較接近的物種序列，意味著直系同源基因功能可能更加相似。即在面對脅迫時，海拔分布范圍較近蝦脊蘭屬植物面對溫度脅迫反應(yīng)機(jī)制可能相似。

蝦脊蘭屬植物HSP70s基因數(shù)量相差主要是細(xì)胞質(zhì)中HSP70的數(shù)量多于其他亞細(xì)胞器，在蝦脊蘭屬植物中HSP70的基因數(shù)量差異最大的是細(xì)胞質(zhì)中的數(shù)量，三褶蝦脊蘭、香花蝦脊蘭、銀帶蝦脊蘭、中華蝦脊蘭和長距蝦脊蘭主要是細(xì)胞質(zhì)數(shù)量多，高海拔分布的三棱蝦脊蘭和大黃花蝦脊蘭僅含有1條。推測其原因：（1）細(xì)胞質(zhì)是生物體新陳代謝的主要場所[47]，蛋白質(zhì)是在細(xì)胞質(zhì)中合成，組成型的HSC70需要向各個亞細(xì)胞器運(yùn)送蛋白質(zhì)，且也需要作為分子伴侶參與新生肽的折疊和錯誤蛋白的降解等多種細(xì)胞活動[48];（2）提高抗性的遺傳基礎(chǔ)大部分是細(xì)胞質(zhì)HSP70s的因素，通過雜交獲得的遺傳變異可提高物種的耐熱性[49]。因此自然選擇可能導(dǎo)致了蝦脊蘭屬物種之間HSP70基因的差異，這種差異很可能造成了熱適應(yīng)性的強(qiáng)弱，也使不同蝦脊蘭屬植物獲得不同耐熱性以形成各自的海拔和緯度分布區(qū)。

4? 結(jié)論

蝦脊蘭屬植物在應(yīng)對環(huán)境變化方面具有多樣化的適應(yīng)機(jī)制，且物種分化的過程中產(chǎn)生了新的適應(yīng)性。但截至目前，該屬植物對環(huán)境適應(yīng)相關(guān)的功能基因挖掘，及其生態(tài)適應(yīng)性的分子機(jī)制研究尚未見報道。

本研究對蝦脊蘭屬HSP70基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探索蝦脊蘭屬植物適應(yīng)性演化。獲得的主要結(jié)論和發(fā)現(xiàn)如下：

（1）蝦脊蘭屬7種植物共鑒定47個HSP70基因家族，其中低海拔蝦脊蘭比高海拔蝦脊蘭的基因數(shù)量多，且推測細(xì)胞質(zhì)HSP基因數(shù)量的差異可能造成了蝦脊蘭屬植物之間的耐熱性的差異，以此適應(yīng)不同海拔區(qū)域環(huán)境溫度。

（2）蝦脊蘭屬的HSP70基因結(jié)構(gòu)與其他植物該基因家族特征一致，有3個保守結(jié)構(gòu)域，N端ATPase結(jié)構(gòu)域，中間鉸鏈區(qū)和C末端區(qū)域序列。且含有HSP70基因家族3個典型的家族標(biāo)簽：IDLGTT（Y/N）S、（I/V）（F/Y）DLGGGTFD（I/V）S（L/I/V）L和（I/V）VLVGG（S/M）TRIP（K/R/A）（V/A） （Q/S）。Motif組成顯示，HSP70基因N端有較多的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)，且motif 8被鑒定為CaM結(jié)合位點(diǎn)。

（3）HSP70基因家族純化選擇顯示，該基因家族在蝦脊蘭屬中較保守，說明該基因在功能上已經(jīng)具有一定的穩(wěn)定性。

（4）HSP70s基因系統(tǒng)發(fā)育樹聚為6組，相同細(xì)胞器HSP70s基因比同一物種不同細(xì)胞器HSPs的同源性要高，說明同一細(xì)胞基因功能相似。

參考文獻(xiàn)

[1]? Zhang L， Zhao H K， Dong Q L， et al. Genome-wide analysis and expression profiling under heat and drought treatments of HSP70 gene family in soybean （Glycine max L.）[J]. Frontiers in Plant Science， 2015， 6： 773.

[2]? 于曉麗. 三角渦蟲熱激蛋白70cDNA的克隆及生物信息學(xué)分析[D]. 陜西： 陜西師范大學(xué)， 2009.

[3]? WANG W X， Vinocur B， Shoseyov O， et al. Role of plant heat-shock proteins and molecular chaperones in the abiotic stress response[J]. Trends in Plant Science， 2004， 9（5）： 244-252.

[4]? 劉? 娜， 曲延英， 陳全家， 等. 棉花HSP70基因的克隆與原核表達(dá)[J]. 西北植物學(xué)報， 2015， 35（4）： 688-693.

[5]? Abrams J L. Functional analysis of cytosolic Hsp70 nucleotide exchange factor networks in Yeast[D]. State of Texas： The University of Texas MD Anderson Cancer Center， 2014.

[6]? 李東賓， 高燕會， 斯金平， 等. 鐵皮石斛HSP70基因的克隆及冷脅迫表達(dá)分析[J]. 中國中藥雜志， 2013， 38（20）： 3446-3452.

[7]? K?hler H R， Triebskorn R， St?cker W， et al. The 70 kD heat shock protein （hsp 70） in soil invertebrates： a possible tool for monitoring environmental toxicants[J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology， 1992， 22（3）： 334-338.

[8]? Mathioudakis M M， Veiga R， Ghita M， et al. Pepino mosaic virus capsid protein interacts with a tomato heat shock protein cognate 70[J]. Virus Research， 2012， 163（1）： 28-39.

[9] 王? 勇， 任亞峰， 李冬雪， 等. 熱休克蛋白與植物病毒組分的互作機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報， 2018， 24（2）： 415-424.

[10]????? Sung D Y， Vierling E， Guy C L. Comprehensive expression profile analysis of the Arabidopsis Hsp70 gene family[J]. Plant Physiology， 2001， 126（2）： 789-800.

[11]????? Su P H， Li H M. Arabidopsis stromal 70-kD heat shock proteins are essential for plant development and important for thermotolerance of germinating seeds[J]. Plant Physiology， 2008， 146（3）： 1231-1241.

[12]????? Karl I， S?rensen J G， Loeschcke V， et al. HSP70 expression in the copper butterfly Lycaena tityrus across altitudes and temperatures[J]. Journal of Evolutionary Biology， 2009， 22（1）： 172-178.

[13]????? 陳燕瓊. 廣義蝦脊蘭屬系統(tǒng)基因組學(xué)、生物地理學(xué)及網(wǎng)狀進(jìn)化[D] 福建： 福建農(nóng)林大學(xué)， 2020.

[14]????? Finn R D， Tate J， Mistry J， et al. The Pfam protein families database[J]. Nucleic Acids Research， 2007， 36（suppl 1）： D281-D288.

[15]????? Marchler-Bauer A， Anderson J B， Chitsaz F， et al. CDD： specific functional annotation with the Conserved Domain Database[J]. Nucleic Acids Research， 2009， 37（suppl 1）： D205-D210.

[16]????? Letunic I， Copley R R， Schmidt S， et al. SMART 4.0： towards genomic data integration[J]. Nucleic Acids Research， 2004， 32： D142-D144.

[17]????? Huang Y， Niu B F， Gao Y， et al. CD-HIT Suite： a web server for clustering and comparing biological sequences[J]. Bioinformatics， 2010， 26（5）： 680-682.

[18]????? Gasteiger E， Gattiker A， Hoogland C， et al. ExPASy： the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis[J]. Nucleic Acids Research， 2003， 31（13）： 3784-3788.

[19]???? Bailey T L， Williams N， Misleh C， et al. MEME： discovering and analyzing DNA and protein sequence motifs[J]. Nucleic Acids Research， 2006， 34（suppl 2）： W369-W373.

[20]???? Horton P， Park K J， Obayashi T， et al. WoLF PSORT： protein localization predictor[J]. Nucleic Acids Research， 2007， 35（suppl 2）： W585-W587.

[21]????? Waterhouse A M， Procter J B， Martin D M A， et al. Jalview Version 2： a multiple sequence alignment editor and analysis workbench[J]. Bioinformatics， 2009， 25（9）： 1189-1191.

[22]????? Kumar S， Stecher G， Tamura K. MEGA7： Molecular evolutionary genetics analysis version 7.0 for bigger datasets[J]. Molecular Biology and Evolution， 2016， 33（7）： 1870- 1874.

[23]????? Miller M A， Pfeiffer W， Schwartz T. Creating the CIPRES Science Gateway for inference of large phylogenetic trees[C]//2010 Gateway Computing Environments Workshop （GCE）. New Orleans， LA， USA. IEEE， 2010： 1-8.

[24]????? Song Z P， Pan F L， Lou X P， et al. Genome-wide identification and characterization of Hsp70 gene family in Nicotiana tabacum[J]. Molecular Biology Reports， 2019， 46（2）： 1941- 1954.

[25]????? Sarkar N K， Kundnani P， Grover A. Functional analysis of Hsp70 superfamily proteins of rice （Oryza sativa）[J]. Cell Stress and Chaperones， 2013， 18（4）： 427-437.

[26]????? Guo M， Liu J H， Ma X， et al. Genome-wide analysis of the Hsp70 family genes in pepper （Capsicum annuum L.） and functional identification of CaHsp70-2 involvement in heat stress[J]. Plant Science， 2016， 252： 246-256.

[27]????? Lin B L， Wang J S， Liu H C， et al. Genomic analysis of the Hsp70 superfamily in Arabidopsis thaliana[J]. Cell Stress and Chaperones， 2001， 6（3）：201-208.

[28]????? 張毓婷. 雷蒙德氏棉HSP70基因家族進(jìn)化與GhHSP70-20的功能解析[D]. 杭州： 浙江農(nóng)林大學(xué)， 2014.

[29]????? Zhang G Q， Xu Q， Bian C， et al. The Dendrobium catenatum Lindl. genome sequence provides insights into polysaccharide synthase， floral development and adaptive evolution[J]. Scientific Reports， 2016， 6（1）： 1-10.

[30]????? Fuertes M A， Jos M P， Soto M， et al. Thermodynamic stability of the C-terminal domain of the human inducible heat shock protein 70[J]. Biochimica et Biophysica Acta， 2004， 1699（1-2）：45-56.

[31]????? Park H， Ahn I Y， Lee H E. Expression of heat shock protein 70 in the thermally stressed Antarctic clam Laternula elliptica[J]. Cell Stress and Chaperones， 2007， 12（3）： 275-282.

[32]????? Wang Z L， Wu Z H， Jian J C， et al. Cloning and expression of heat shock protein 70 gene in the haemocytes of pearl oyster （Pinctada fucata， Gould 1850） responding to bacterial challenge[J]. Fish & Shellfish Immunology， 2009， 26（4）： 639-645.

[33]????? Henics T， Nagy E， Oh H J， et al. Mammalian Hsp70 and Hsp110 proteins bind to RNA motifs involved in mRNA stability[J]. Journal of Biological Chemistry， 1999， 274（24）： 17318-17324.

[34]????? 顧穎慧. 龍須菜熱激蛋白70（HSP70）基因克隆及熱激下的表達(dá)模式分析[D]. 青島： 中國海洋大學(xué)， 2011.

[35]????? 宋晉輝， 馬海蓮， 甕巧云， 等. 玉米HSP70基因家族的全基因組鑒定與分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報， 2017， 31（7）： 1245-1254.

[36]????? 高娟玉. Hsp70調(diào)控蛋白HBP21在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞及PVR增生膜中的表達(dá)[D]. 南京： 南京醫(yī)科大學(xué)， 2008.

[37]????? Smock R G， Blackburn M E， Gierasch L M. Conserved， disordered C Terminus of DnaK enhances cellular survival upon stress and DnaK in vitro chaperone activity[J]. Journal of Biological Chemistry， 2011， 286（36）： 31821-31829.

[38]????? Freeman B C， Myers M P， Schumacher R， et al. Identification of a regulatory motif in Hsp70 that affects ATPase activity， substrate binding and interaction with HDJ-1[J]. Embo Journal， 1995， 14（10）： 2281-2292.

[39]????? Hurst L D. The Ka/Ks ratio： diagnosing the form of sequence evolution[J]. Trends in Genetics， 2002， 18（9）： 486-487.

[40]????? 王? 捷， 徐? 羽， 石? 瑛， 等. 念珠藻屬植物nifH基因的適應(yīng)性進(jìn)化分析[J]. 西北植物學(xué)報， 2019， 39（11）： 1961-1969.

[41]????? Sun X T， Li B， Zhou G M， et al. Binding of the maize cytosolic Hsp70 to calmodulin， and identification of calmodulin- binding site in Hsp70[J]. Plant and Cell Physiology， 2000， 41（6）： 804-810.

[42]????? Cha J Y， Su'udi M， Kim W Y， et al. Functional characterization of orchardgrass cytosolic Hsp70 （DgHsp70） and the negative regulation by Ca2+/AtCaM2 binding[J]. Plant Physiology and Biochemistry， 2012， 58： 29-36.

[43]????? Gong M， Li Y J， Dai X， et al. Involvement of calcium and calmodulin in the acquisition of heat-shock induced thermotolerance in maize seedlings[J]. Journal of Plant Physiology， 1997， 150（5）： 615-621.

[44]????? Jung K H， Gho H J， Nguyen M X， et al. Genome-wide expression analysis of HSP70 family genes in rice and identification of a cytosolic HSP70 gene highly induced under heat stress[J]. Functional and Integrative Genomics， 2013， 13（3）： 391-402.

[45]????? 張振南. 復(fù)蘇植物牛耳草HSP基因家族分析及BhHSP70-1基因功能研究[D]. 大慶： 黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)， 2013.

[46]????? Rosenzweig R， Nillegoda N B， Mayer M P， et al. The Hsp70 chaperone network[J]. Nature Reviews Molecular Cell Biology， 2019， 20（11）： 665-680.

[47]????? 馬煒梁， 王幼芳， 李宏慶. 植物學(xué) [M]. 北京： 北京高等教育出版社， 2007： 12-38.

[48]????? 祁茂冬. 玉米HSP70家族成員的鑒定及抗旱基因的篩選和功能分析[D]. 保定： 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2018.

[49]????? 崔旭紅. B型煙粉虱和溫室粉虱熱脅迫適應(yīng)性及其分子生態(tài)機(jī)制[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院， 2007.

責(zé)任編輯：黃東杰