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    基于TLR4/NF-κB通路研究益氣活血藥對心梗大鼠心室功能的影響

    2021-11-07 01:01:42馮鵬飛郭書文魏路路王惠劉云柯魏梵域
    環(huán)球中醫(yī)藥 2021年10期
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    馮鵬飛 郭書文 魏路路 王惠 劉云柯 魏梵域

    心肌梗死(myocardial infarction,MI)是嚴(yán)重的心血管疾病,病死率較高,根據(jù)《中國心血管病報告 2018》顯示,中國心血管病患病率持續(xù)上升、心血管病死亡率仍居首位[1],其中MI是重要致死因素。心肌梗死后心力衰竭是常見且嚴(yán)重的合并癥,其發(fā)生發(fā)展與心室重塑、炎癥反應(yīng)等因素有關(guān)[2]。Toll樣受體4(toll-like receptor 4,TLR4)和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)介導(dǎo)TLR4/NF-κB信號通路,通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡[3]、心肌纖維化[4]及炎癥反應(yīng)[5]等參與心肌梗死相關(guān)的病理進(jìn)程,與MI后心室功能的進(jìn)展密切相關(guān)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)益氣活血藥對MI后心室功能具有保護(hù)作用,本研究將著重探討這種保護(hù)作用的發(fā)揮是否與TLR4/NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)相關(guān)及其對腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)、白細(xì)胞介素-6(interleukin- 6,IL-6)表達(dá)的影響,為益氣活血藥防止MI后心室功能進(jìn)展障礙的機制研究提供實驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物

    選用50只健康的雄性SD(Sprague Dawley)大鼠,SPF級,8周齡,體質(zhì)量(200±20) g,從北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司購買,生產(chǎn)許可證編號:SCXK(京)2016-0006。動物飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心。

    1.2 藥物和器材

    1.2.1 藥物制備 益氣活血藥由生黃芪30 g、生曬參10 g、當(dāng)歸15 g、三七6 g、川芎15 g組成,該藥物已申請專利(專利申請?zhí)枮?201610368030.7)。中藥材從北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院中藥房購入,根據(jù)口服水煎劑進(jìn)行制備,浸泡、煎煮、濾過、回流提取后濃縮定容,調(diào)整藥物濃度到每毫升藥液含生藥0.82 g;陽性對照藥物培哚普利(雅施達(dá)),施維雅天津制藥有限公司,國藥準(zhǔn)字:H20034053,研磨后利用蒸餾水制備成溶液使用。

    1.2.2 主要試劑和儀器 TLR4(Proteintech,貨號:19811-1-AP)、NF-κB(Abcam,貨號:Ab16502);大鼠TNF-α(武漢華美,貨號:CSB-E11987r,96T)、大鼠MCP-1(武漢華美,貨號:CSB-E07429r,96T)、大鼠IL-6(武漢華美,貨號:CSB-E04640r,96T)檢測試劑盒;小動物呼吸機(上海奧爾科特生物科技有限公司,ALC-V8),全景掃描儀(3DHISTECH公司,Pannoramic MIDI),高分辨率小動物超聲系統(tǒng)(加拿大VisualSonics公司,Vevo770),電泳儀(Bio-Rad公司,Mi-PROTEAN Tetra)等。

    1.3 實驗造模

    適應(yīng)性喂養(yǎng)3天后,對實驗動物進(jìn)行稱重,選擇體質(zhì)量(200±20) g的35只大鼠進(jìn)行造模。大鼠心肌梗死模型的制備采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支(left anterior descending,LAD)的方法進(jìn)行[6]。麻醉用藥選擇1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)、麻醉方式為腹腔注射;麻醉后對手術(shù)區(qū)進(jìn)行備皮、消毒,并進(jìn)行氣管插管;逐層剪開3~4 肋間皮膚并消毒,為避免出血,肌層采取鈍性分離;經(jīng)氣管插管連接小動物呼吸機,鈍性分離3、4肋間肌肉開放胸腔,將心臟從心包膜中暴漏,使用 5/0 無菌帶線縫合針在左心耳與肺動脈圓錐間下2 mm 處結(jié)扎LAD及其伴行血管;結(jié)扎后心臟迅速復(fù)位,清理出血及排空氣體后閉合胸腔,逐層消毒并縫合,待大鼠恢復(fù)自主呼吸后拔掉氣管插管。假手術(shù)與造模手術(shù)操作大致相同,但假手術(shù)只進(jìn)行穿線而不進(jìn)行結(jié)扎。為防止感染,術(shù)后青霉素鈉預(yù)防用藥,每只 20 萬單位/天,連續(xù)用藥3天。對35只大鼠進(jìn)行造模手術(shù),術(shù)中術(shù)后死亡6只,24只大鼠造模成功。10只進(jìn)行假手術(shù),術(shù)中死亡2只。

    1.4 實驗分組及給藥

    術(shù)后第二天,對存活大鼠行心電圖檢查,觀察并計數(shù)大鼠心電圖Ⅰ導(dǎo)聯(lián)、aVL導(dǎo)聯(lián)及V1-V6導(dǎo)聯(lián)中的病理性Q波,病理性Q波計數(shù)在5個以上視為造模成功[7]。獲得24只心梗大鼠進(jìn)行隨機分配,將其分別分配到模型組、培哚普利組及益氣活血組,每組8只。并利用8只假手術(shù)大鼠作為對照組。術(shù)后第二天進(jìn)行給藥,連續(xù)灌胃給藥28天。給藥劑量按照臨床等效劑量進(jìn)行換算,其中益氣活血組每天給藥8.2 g/(kg·d)、培哚普利組每天給藥劑量0.4 mg/(kg·d)。假手術(shù)組和模型組每天給予等量蒸餾水灌胃。

    1.5 指標(biāo)檢測

    1.5.1 超聲心動檢測大鼠左室功能 給藥28天后,對各組大鼠左心室功能進(jìn)行超聲心動檢測,觀察藥物對左室功能的影響。檢測時利用高頻探頭RMV716進(jìn)行定位,通過M模式對心室功能分析評價,采集3個連續(xù)的心動周期取平均值。主要檢測指標(biāo)包括左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter,LVIDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular internal dimension systole,LVIDs)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)及左室短軸率(left ventricular fractional shortening,LVFS)。

    1.5.2 大鼠血液和心肌組織取材 超聲結(jié)束后,對大鼠進(jìn)行腹主動脈取血,然后進(jìn)行心臟組織取材。血液樣本4℃狀態(tài)下自然沉淀凝固30分鐘,3000 r/min離心15分鐘,取上清-80℃保存用于酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA);心肌組織一部分4%多聚甲醛溶液固定處理后用于石蠟包埋切片,其余部分分離梗死邊緣區(qū),-80℃保存用于蛋白免疫印跡檢測(Western Blot,WB)。

    1.5.3 蘇木精—伊紅染色(hematoxylin-eosin staining,HE染色) 4%多聚甲醛固定心肌組織,進(jìn)行包埋切片并進(jìn)行HE染色,全景掃描顯微鏡下觀察病理切片并采集圖像。

    1.5.4 WB檢測TLR4、NF-κB蛋白表達(dá) 取梗死邊緣區(qū)組織50 mg在RIPA裂解液中充分裂解、勻漿,4℃離心取上清后采用BCA法進(jìn)行蛋白定量,SDS-PAGE蛋白質(zhì)電泳,PVDF轉(zhuǎn)膜,室溫封閉及一抗二抗孵育后曝光,最后對膠片進(jìn)行掃描后Quantity One圖像分析軟件對蛋白條帶進(jìn)行光密度值分析,β-actin作為內(nèi)參。TLR4、NF-κB的相對表達(dá)量利用TLR4、NF-κB條帶與β-actin的光密度值的比值表示。觀察給藥28天后各組心梗大鼠梗死邊緣區(qū)心肌組織中TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)及藥物影響。

    1.5.5 ELISA檢測TNF-α、MCP-1、IL-6含量 ELISA法測定血清TNF-α、MCP-1、IL-6的變化,依據(jù)試劑盒說明進(jìn)行操作。觀察給藥28天后各組心梗大鼠血清中炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-6含量變化及藥物影響。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠左室功能比較

    給藥28天后,超聲心動圖檢測各組大鼠左室功能。模型組較假手術(shù)組:LVIDd、LVIDs均顯著升高(P<0.05),LVEF、LVFS均顯著降低(P<0.05);給藥組較模型組:LVIDs顯著性降低(P<0.05)、LVEF、LVFS均顯著性升高(P<0.05)、LVIDd無明顯變化;益氣活血組與培哚普利組比較: LVIDd、LVIDs、LVEF、LVFS,各指標(biāo)變化均無統(tǒng)計學(xué)差異。見表1。

    表1 給藥28天后各組心梗大鼠左心室功能變化

    2.2 各組大鼠梗死邊緣區(qū)心肌組織HE染色結(jié)果

    給藥28天后,梗死邊緣區(qū)HE染色發(fā)現(xiàn):假手術(shù)組心肌纖維排列規(guī)整,結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞形態(tài)無明顯改變,少見炎性細(xì)胞侵潤;模型組心肌纖維排列散亂,結(jié)構(gòu)模糊,細(xì)胞形態(tài)明顯改變、呈現(xiàn)不規(guī)則形狀,間隙明顯增寬,細(xì)胞核游移散亂,細(xì)胞間質(zhì)出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤;培哚普利組和益氣活血組心肌纖維排列較為規(guī)整,結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞形態(tài)較為規(guī)則,細(xì)胞間隙稍有增寬,可見部分炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

    注:A:假手術(shù)組;B:模型組;C:培哚普利組;D:益氣活血藥組

    2.3 各組大鼠梗死邊緣區(qū)心肌組織中TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)情況

    給藥28天后,檢測各組梗死邊緣區(qū)心肌組織中TLR4、NF-κB蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示:模型組中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)較假手術(shù)組顯著性升高(P<0.05);培哚普利組和益氣活血組中TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)較模型組顯著性降低(P<0.05);給藥組組間,TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)情況無統(tǒng)計學(xué)差異。見表2,圖2。

    表2 各組大鼠梗死邊緣區(qū)TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)結(jié)果

    注:A:假手術(shù)組; B:模型組; C:培哚普利組; D:益氣活血藥組

    2.4 各組大鼠血清炎癥因子含量變化

    給藥28天后,檢測各組大鼠血清中TNF-α、MCP-1及IL-6的含量,結(jié)果顯示:模型組血清中TNF-α、MCP-1及IL-6的含量較假手術(shù)組顯著性升高(P<0.05);培哚普利組和益氣活血藥組血清中TNF-α、MCP-1及IL-6的含量較模型組顯著性降低(P<0.05);在用藥組間,血清中TNF-α、MCP-1及IL-6的含量變化無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表3。

    表3 各組大鼠血清TNF-α、MCP-1及IL-6含量變化

    3 討論

    中醫(yī)認(rèn)為心主血脈,脈為血府,以氣為本。MI在中醫(yī)上屬于“胸痹”“真心痛”范疇,病機多屬“本虛標(biāo)實”,陽虛、氣虛為本,血瘀為標(biāo)[8]。針對氣虛血瘀的病機,臨床上多采用益氣活血的組方進(jìn)行治療。本研究中益氣活血藥以黃芪、當(dāng)歸、生曬參、川芎、三七等藥進(jìn)行配伍組方,發(fā)揮益氣活血、通補兼施的功效,對MI氣虛血瘀證具有重要的應(yīng)用價值。前期研究發(fā)現(xiàn),益氣活血藥通過調(diào)節(jié)MI后心室重構(gòu)、心肌纖維化及心肌細(xì)胞凋亡[9-11]對心室功能發(fā)揮保護(hù)作用。

    TLR4/NF-κB信號通路介導(dǎo)的慢性炎癥反應(yīng)在多種疾病的進(jìn)程中起到重要的調(diào)節(jié)作用。作為經(jīng)典的炎癥調(diào)節(jié)通路,在MI的相關(guān)研究中,TLR4/NF-κB通過調(diào)節(jié)炎癥因子的表達(dá)介導(dǎo)心肌炎癥損傷和心肌重塑,這些炎癥因子包括TNF-α、MCP-1及IL-6等[12-14]。在對MI后心力衰竭的相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)通過抑制TLR4/NF-κB信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),能夠改善心肌缺血后心室功能的進(jìn)展性障礙,降低心力衰竭的風(fēng)險[15-16]。Yang等[17]利用分離出的紫草素作用心臟損傷模型,發(fā)現(xiàn)其通過抑制膠原聚集、TLR4/NF-κB等途徑,顯著改善心肌損傷后的心功能,減少心肌纖維化、抑制炎癥、減輕細(xì)胞凋亡和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,緩解體內(nèi)心力衰竭。HU等[18]通過敲除小鼠TLR4基因研究高脂飲食所致的心功能不全,發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)在其中起重要作用,TLR4基因敲除可能通過NF-κB/JNK調(diào)節(jié)自噬,抑制炎癥和活性氧自由基,改善心肌收縮功能和Ca2+異常,減輕心肌重塑和收縮功能障礙的發(fā)生和發(fā)展。

    本研究基于TLR4/NF-κB信號通路,從炎癥反應(yīng)的角度出發(fā),研究益氣活血藥對MI后心室功能的調(diào)節(jié)作用。研究結(jié)果表明,益氣活血藥能夠顯著改善心梗大鼠左室功能,抑制TLR4、NF-κB蛋白在梗死邊緣區(qū)心肌組織中的表達(dá),降低心梗大鼠血清組織中TNF-α、MCP-1、IL-6等炎癥因子的含量,減輕心梗大鼠MI后持續(xù)的炎癥反應(yīng)。提示益氣活血藥可能通過TLR4/NF-κB信號通路,抑制心梗大鼠的炎癥反應(yīng),阻止心室功能的進(jìn)展性障礙,從而發(fā)揮保護(hù)心梗大鼠心室功能的作用。

    綜上所述,心室功能的進(jìn)展性障礙作為影響MI預(yù)后的重要因素,研究其病理基礎(chǔ)和藥物對其進(jìn)行防治的作用機制具有重要意義。益氣活血藥在阻止MI后心室功能的進(jìn)展性障礙方面能夠發(fā)揮重要的作用,TLR4/NF-κB信號通路作為潛在的作用途徑,可能通過抑制慢性炎癥反應(yīng)保護(hù)心臟功能。

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