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    扶正透邪方對(duì)耐藥銅綠假單胞菌肺炎大鼠晚期炎癥反應(yīng)的影響

    2021-11-07 11:05:00張迪晏軍錢瑩姚興偉付躍峰郭楠劉清泉孔令博
    環(huán)球中醫(yī)藥 2021年10期
    關(guān)鍵詞:伏邪扶正耐藥

    張迪 晏軍 錢瑩 姚興偉 付躍峰 郭楠 劉清泉 孔令博

    銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa,PA)是醫(yī)院環(huán)境中最主要的病原菌,PA引起的院內(nèi)肺炎占到院內(nèi)肺炎病例的18%以上,最新研究顯示,院內(nèi)肺炎的死亡率已經(jīng)到了13%~50%[1-2]。高遷移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)是一種重要的晚期炎性介質(zhì),受到PA刺激后,單核巨噬細(xì)胞將其分泌到細(xì)胞外環(huán)境發(fā)揮促炎作用。HMGB1通過促進(jìn)核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)核轉(zhuǎn)位釋放炎癥細(xì)胞因子,如白細(xì)胞介素6(interleukin-6,IL-6),炎癥細(xì)胞因子進(jìn)一步促進(jìn)HMGB1的釋放,形成一個(gè)正反饋回路,放大炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[3-5]。耐藥PA肺炎在感染途徑、發(fā)病特點(diǎn)和病機(jī)上與中醫(yī)學(xué)伏邪理論存在高度的一致性。扶正透邪方扶正以助透邪,透邪以助扶正,針對(duì)耐藥PA肺炎有益氣養(yǎng)血、透邪外出之功。前期研究證明扶正透邪方在早期可升高體內(nèi)白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)水平,刺激促炎因子釋放,幫助清除細(xì)菌和毒素[6],但對(duì)后期的炎癥反應(yīng)研究不足。本實(shí)驗(yàn)通過觀察扶正透邪方對(duì)耐藥PA肺炎HMGB1水平的影響,及NF-κB和IL-6等相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá),進(jìn)一步探討扶正透邪方對(duì)耐藥PA肺炎的作用機(jī)制,為臨床應(yīng)用提供依據(jù),同時(shí)豐富伏邪理論的科學(xué)內(nèi)涵。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

    扶正透邪方組成:黃芪60 g、當(dāng)歸15 g、金銀花15 g、青蒿10 g、虎杖10 g,以上藥物均為中藥全成分免煎顆粒,由北京康仁堂藥業(yè)有限公司提供。

    1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

    耐藥銅綠假單胞菌臨床分離株,樣本號(hào):20PXSP1925,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院細(xì)菌室進(jìn)行菌種鑒定與藥敏檢測(cè)。

    1.3 試劑與儀器

    HMGB-1(批號(hào):SEA399Ra)、IL-6 ELISA(批號(hào):SEA079Ra)檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司;UltraPure Agarose(批號(hào):16500100)、SuperScript III RT 逆轉(zhuǎn)錄kit(批號(hào):11752050)、Sybr qpcr mix(批號(hào):4472920),均購(gòu)自美國(guó)ABI-invitrogen;HMGB1抗體(批號(hào):Ab79823)、NF-κB抗體(批號(hào):Ab76311),購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。酶標(biāo)儀Microplate reader,ELx808,美國(guó)Biotek;熒光定量PCR儀,StepOne Software,美國(guó)Applied biosystems;SDS-PAGE電泳系統(tǒng),Mini-PROTEAN?Tetra Cell with Mini Trans-Blot?Module And PowerPacTMUniversal Power Supply,美國(guó)BIO-Rad;凝膠成像系統(tǒng),GelDoc-It310,美國(guó)UVP;ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng),170-8280,美國(guó)BIO-Rad。

    1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

    清潔級(jí)SD大鼠12只,雄性,體重(200±20) g,購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,動(dòng)物合格證號(hào):SYXK(京)2020-0013。購(gòu)入后置于微生物免疫動(dòng)物室動(dòng)物潔凈飼養(yǎng)。隨機(jī)分為空白組、模型組和扶正透邪組,共3組。每組各4只,各組按于7天后留取標(biāo)本。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京盈科瑞生物醫(yī)藥研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)IACUC-YKRSW-2021-D001)。

    1.5 模型制備、藥物干預(yù)

    1.5.1 模型制備 大鼠予腹腔注射10%水合氯醛溶液,4 g/kg,待大鼠完全麻醉后,用皮筋將其固定于木板上,用鑷子輕輕拉出大鼠舌頭,打開照明燈對(duì)準(zhǔn)大鼠頸部,調(diào)整大鼠頭部位置,直到通過口腔可以看到聲門裂。用微量進(jìn)液器抽50 μL菌液,緩慢將微量進(jìn)液器針頭送入聲門裂,向氣管內(nèi)緩慢滴注菌液。滴注菌液后迅速將大鼠從鼠板上取下,雙手握住大鼠上肢,使大鼠直立,并左右搖擺,使菌液均勻分布于大鼠左右兩肺[7]??瞻捉M按上述方法在大鼠氣管內(nèi)注入等量的無菌生理鹽水。造模過程中大鼠無死亡。

    1.5.2 藥物干預(yù) 空白組予蒸餾水灌胃;模型組在感染后予蒸餾水灌胃;扶正透邪組在感染后予扶正透邪全方水煎劑灌胃,各組灌胃每日2次,每次2 mL。扶正透邪方組成:黃芪60 g、當(dāng)歸15 g、金銀花15 g、青蒿10 g、虎杖10 g,根據(jù)Meeh-Rubner計(jì)算實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體表面積公式換算,每只大鼠使用藥物為黃芪1.15 g、當(dāng)歸0.3 g、金銀花0.3 g、青蒿0.2 g、虎杖0.2 g,相當(dāng)于臨床成人用量的0.019倍[8]。

    1.6 檢測(cè)指標(biāo)及方法

    樣本制備:予腹腔注射10%水合氯醛溶液,4 g/kg,麻醉后,常規(guī)消毒大鼠腹部皮膚,打開腹腔,分離腹主動(dòng)脈,予一次性無菌采血針接5 mL空白采血管,進(jìn)行取血,并留取肺組織。采血完畢后,空白采血管室溫放置1小時(shí),再4℃放置1小時(shí),離心,2500 r/min,20分鐘,分離血清,分裝后-70℃保存。將肺組織切成小塊,放入離心管中,置于-70℃保存。

    1.6.1 病理切片 將肺組織制作石蠟切片,切片厚度4 μm,蘇木精—伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)染色后,顯微鏡下觀察肺組織病理形態(tài)變化。

    1.6.2 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 嚴(yán)格按照酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒說明書操作,檢測(cè)血清中HMGB1、IL-6的OD450吸光度值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)平濃度-吸光度值曲線折算出實(shí)際濃度。

    1.6.3 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè) 取待檢測(cè)樣品,按照Trizol試劑盒說明書步驟提取總RNA,純化后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript III說明書使其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,隨后按照實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)體系進(jìn)行引物擴(kuò)增。擴(kuò)增完畢后,使用2-ΔΔCt法計(jì)算HMGB1、NF-κB mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

    1.6.4 蛋白質(zhì)印跡法(western blot,WB)檢測(cè) 肺組織勻漿提取蛋白,稀釋后測(cè)定蛋白濃度上樣,進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),電泳完成后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理。隨后將膜在室溫下封閉2小時(shí),之后加入一抗抗體孵育1.5小時(shí)。一抗孵育完成后洗膜3次,再加入二抗抗體孵育2小時(shí)。最后將膜放至在顯影儀中避光顯影、拍照。

    1.6.5 免疫組化檢測(cè) 將各組肺組織,以HMGB1、NF-κB一抗和山羊抗兔的二抗進(jìn)行常規(guī)免疫組化染色。

    1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果

    2.1 大鼠HE結(jié)果

    空白組支氣管壁光滑完整,上皮細(xì)胞排列整齊,少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);模型組氣管壁充血水腫、管腔狹窄,肺泡腔縮小,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),上皮細(xì)胞排列紊亂、脫落;扶正透邪組管壁較模型組光滑,氣管壁腫脹、管腔狹窄和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量較模型組明顯減輕。見圖1。

    注:A為空白組;B為模型組;C為扶正透邪組

    2.2 各組大鼠外周血HMGB1、IL-6含量比較

    ELISA結(jié)果示:模型組外周血中HMGB1和IL-6的含量均明顯高于空白組(P<0.05),扶正透邪組外周血中HMGB1和IL-6的含量均明顯低于模型組(P<0.05)。見表1。

    表1 各組大鼠外周血HMGB1、IL-6含量比較

    2.3 大鼠肺組織HMGB1和NF-κB的mRNA表達(dá)

    模型組肺組織中HMGB1、NF-κB mRNA表達(dá)量明顯高于空白組(P<0.05),扶正透邪組HMGB1、NF-κB mRNA明顯低于模型組(P<0.05)。見表2。

    表2 大鼠肺組織HMGB1和NF-κB的mRNA表達(dá)

    2.4 大鼠肺組織HMGB1和NF-κB的蛋白表達(dá)

    模型組肺組織中HMGB1、NF-κB蛋白表達(dá)量明顯高于空白組(P<0.05),扶正透邪組HMGB1、NF-κB蛋白表達(dá)量明顯低于模型組(P<0.05)。見表3、圖2。

    表3 大鼠肺組織HMGB1和NF-κB的蛋白表達(dá)

    圖2 大鼠肺組織HMGB1和NF-κB的蛋白表達(dá)

    2.5 免疫組化

    空白組HMGB1表達(dá)較弱,模型組HMGB1表達(dá)較強(qiáng),扶正透邪組HMGB1表達(dá)較模型組減弱,深棕色為HMGB1表達(dá)陽性細(xì)胞,見圖3??瞻捉MNF-κB表達(dá)較弱,模型組NF-κB表達(dá)較強(qiáng),扶正透邪組NF-κB表達(dá)較模型組減弱,深棕色為NF-κB表達(dá)陽性細(xì)胞,見圖4。

    注:A為空白組;B為模型組;C為扶正透邪組(深棕色為HMGB1表達(dá)陽性細(xì)胞)

    注:A為空白組;B為模型組;C為扶正透邪組(深棕色為NF-κB表達(dá)陽性細(xì)胞)

    3 討論

    伏邪是指感受邪氣,即時(shí)不發(fā),伏藏于體內(nèi),逾時(shí)而發(fā)。研究伏邪理論發(fā)現(xiàn)耐藥菌感染在感染途徑、發(fā)病特點(diǎn)和病機(jī)上存在高度一致性[9]。伏邪的祛除強(qiáng)調(diào)“透邪”,透邪主要有兩層含義:一是要用透的方法給邪以出路,透達(dá)邪氣[10];二是祛邪要除透、除盡,避免未除之邪繼續(xù)伏留體內(nèi),耗傷正氣。在伏邪的治療上,扶正亦是關(guān)鍵??股囟鄬俸疀觯又鞍l(fā)病多有發(fā)熱,苦寒之藥的使用,都會(huì)損傷人體陽氣,因此在治療上溫陽助陽就顯得尤為重要。正如柳寶詒的《惜余醫(yī)案》所說:“若惟取其陰而不鼓動(dòng)其陰中之陽,恐邪機(jī)仍冰伏不出。擬于大劑養(yǎng)陰托邪之中,佐以鼓蕩陽氣之意,俾邪機(jī)得以外達(dá)三陽為吉[11]。”因此伏邪的治療以扶正透邪為主,扶正以助透邪,透邪以助扶正。劉清泉教授經(jīng)過幾十年臨床實(shí)踐和對(duì)伏邪理論的深入研究,博采眾方,提出以扶正透邪方治療耐藥銅綠假單胞菌肺部感染,為臨床耐藥菌感染治療拓寬了思路[12]。方中以黃芪、當(dāng)歸、金銀花為主藥,黃芪健脾補(bǔ)中,升陽舉陷,其扶正助氣功效可使邪熱外透、托毒外達(dá),因此劑量最大;金銀花散熱解毒,善于透血分熱邪于外轉(zhuǎn)入氣分;當(dāng)歸補(bǔ)血活血,兼能行血;青蒿清透虛熱、涼血除蒸,可治療病邪在氣分、血分之病,虎杖清熱化瘀。大劑量黃芪與當(dāng)歸相配,如《內(nèi)傷外辨惑論》的當(dāng)歸補(bǔ)血湯,是經(jīng)典的氣血雙補(bǔ)之方,方中重在黃芪大補(bǔ)肺脾以資氣血生化之源,配以當(dāng)歸以補(bǔ)氣生血,令血?dú)獬溆?,陰平陽秘,可針?duì)熱病日久,耗氣及血而致氣虛血虧、氣滯血瘀之證,并可退虛熱;黃芪與金銀花相配為外科瘡瘍方中常用配伍,意在益氣和營(yíng)清熱,兩藥相配性甘味稍涼,即免苦寒耗損氣陰,又可透邪外出。當(dāng)歸、金銀花取自四妙勇安湯,有通利血脈、活血補(bǔ)血、透邪外出之意。全方補(bǔ)而不膩,給邪以出路,從而達(dá)到益氣養(yǎng)血,透邪外出之功。

    耐藥銅綠假單胞菌感染引起的炎癥反應(yīng)分為早期和晚期,早期反應(yīng)以促炎為主,主要促炎因子有TNF-α、IL-1β等。研究發(fā)現(xiàn),扶正透邪方在早期可升高體內(nèi)IL-1β水平,刺激促炎因子釋放,幫助清除細(xì)菌和毒素[6]。但對(duì)晚期炎癥因子的研究較少,晚期如果炎癥得不到控制,啟動(dòng)炎癥信號(hào)級(jí)聯(lián)傳遞,會(huì)導(dǎo)致病情加重,死亡率升高。HMGB1是一種高度保守的非組蛋白染色體蛋白,在細(xì)胞內(nèi)、外微環(huán)境中起著不同的作用,是典型的炎性反應(yīng)晚期調(diào)節(jié)因子[13]。研究發(fā)現(xiàn),PA感染的COPD患者HMGB1呈高表達(dá)水平,且隨感染加重肺功能損傷進(jìn)一步加重,血清中HMGB1水平也隨之增高[14]。升高的HMGB1可以和PA的膜成份LPS結(jié)合,同時(shí)作為轉(zhuǎn)移分子將二者復(fù)合物帶到CD14和TLR4,作用于TLR4下游信號(hào)通路,導(dǎo)致NF-κB激活,促進(jìn)TNF-α、IL-1β等炎癥基因轉(zhuǎn)錄,引起炎癥反應(yīng)[15- 16]。丁軍穎等[17]觀察PA肺炎大鼠免疫功能時(shí)發(fā)現(xiàn)PA肺炎大鼠HMGB1及效應(yīng)分子IL-1β、TNF-α均明顯升高,對(duì)PA感染大鼠使用HMGB1拮抗劑可明顯減少TNF-α、IL-1β等炎癥因子的釋放[18]。HMGB1還可損害巨噬細(xì)胞的吞噬能力,增加感染PA小鼠的死亡率,GTS-21可以抑制HMGB1釋放從而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的功能,提高細(xì)菌清除率,減少肺損傷[19]。以上研究表明HMGB1在PA肺炎中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),與空白組比較,模型組HMGB1基因和蛋白表達(dá)水平均升高,同時(shí)伴有肺組織損傷,與以上結(jié)果相一致。在此基礎(chǔ)上,扶正透邪方可降低HMGB1基因和蛋白的表達(dá),改善肺組織損傷情況,說明扶正透邪方可減輕PA感染晚期炎癥反應(yīng),保護(hù)肺組織。

    NF-κB是目前研究最多的炎癥相關(guān)通路之一,NF-κB信號(hào)通路活化與機(jī)體炎癥因子分泌密切相關(guān)。研究表明,給予肺上皮細(xì)胞銅綠假單胞菌LPS處理后,可以明顯活化NF-κB信號(hào)通路,表明NF-κB是引起機(jī)體炎癥反應(yīng)的重要原因[20]。HMGB1分泌到細(xì)胞外環(huán)境中后可結(jié)合多種受體激活NF-κB信號(hào)通路,如HMGB1與RAGE結(jié)合后,引發(fā)Ras、PI3K和Rho的激活,并成為下游NF-κB激活的主要信號(hào)分子[21]。HMGB1也可與TLR4結(jié)合,激活NF-κB,引起下游的炎癥介質(zhì)釋放[22-23]。HMGB1也可與TLR9相互作用,通過與TLR9結(jié)合引導(dǎo)MyD88和NF-κB的下游途徑發(fā)出信號(hào),促進(jìn)細(xì)胞因子的釋放[24]。因此,HMGB1可以通過與多種受體結(jié)合激活NF-κB,進(jìn)而轉(zhuǎn)錄促炎基因,如IL-1、IL-6和TNF-α等,發(fā)揮促炎作用[25]。IL-6在感染性病變中產(chǎn)生,并向全身發(fā)出警告信號(hào)。HMGB1被PRR識(shí)別后刺激包括NF-kB在內(nèi)的一系列信號(hào)通路,并增強(qiáng)IL-6等炎性細(xì)胞因子mRNA的轉(zhuǎn)錄[26]。使用HMGB1抑制劑甘草酸,或使用HMGB1小干擾RNA(siRNA)可以有效地抑制HMGB1介導(dǎo)的TLR4/NF-kB途徑[27-30]。雖然關(guān)于PA肺炎與HMGB1的研究很少,但在PA感染角膜炎的小鼠中使用siRNA沉默HMGB1后,可以降低NF-κB及下游炎癥因子的表達(dá)[31],說明HMGB1/NF-κB/IL-6通路可能是PA肺炎后期炎癥反應(yīng)的重要通路。本研究發(fā)現(xiàn),與空白組相比較,模型組HMGB1、NF-κB的基因和蛋白表達(dá)量均升高,同時(shí)IL-6水平也升高,說明HMGB1/NF-κB/IL-6通路可能是大鼠晚期炎癥反應(yīng)的通路之一。扶正透邪方可以降低PA肺炎大鼠HMGB1、NF-κB基因和蛋白表達(dá),同時(shí)降低IL-6水平,在炎癥的晚期發(fā)揮作用。

    本研究從動(dòng)物實(shí)驗(yàn)出發(fā),探討了扶正透邪方對(duì)耐藥PA肺炎大鼠晚期炎癥反應(yīng)的影響,表明扶正透邪方可以減少PA肺炎晚期炎癥因子的釋放,保護(hù)肺組織。由于HMGB1的受體較多,因此對(duì)于HMGB1作用于NF-κB及NF-κB后續(xù)調(diào)控IL-6釋放等過程研究不足,有待進(jìn)一步的研究。

    綜上所述,扶正透邪方可以減少HMGB1釋放來抑制NF-κB的核轉(zhuǎn)位,進(jìn)而抑制IL-6的釋放,可能通過HMGB1/NF-κB/IL-6通路起到控制晚期炎癥反應(yīng)水平,保護(hù)肺組織的作用。提示扶正透邪方可以有效調(diào)節(jié)機(jī)體的晚期炎性免疫應(yīng)答,進(jìn)一步闡釋了扶正透邪方作用機(jī)制,豐富了伏邪理論,但具體反饋調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步的研究揭示。

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