調(diào)控雞胚肝臟組織抗氧化功能差異基因的篩選

李春暉, 何程實(shí), 吳建鑫, 韋張其, 楊少華, 劉國(guó)慶

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

雞胚在孵化過(guò)程中是以半封閉形式進(jìn)行,其代謝產(chǎn)物只能依靠自身進(jìn)行分解,如在生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中呼吸作用產(chǎn)生的自由基。雞胚在發(fā)育過(guò)程中需要大量的氧氣提供能量以維持機(jī)體的快速代謝等生命活動(dòng),從而導(dǎo)致產(chǎn)生更多的活性氧,而高水平的活性氧會(huì)造成蛋白質(zhì)、脂質(zhì)過(guò)氧化以及 DNA損傷[1]。因此存在于雞胚內(nèi)部的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSH-Px)、過(guò)氧化物酶(POD)等酶發(fā)揮作用清除活性氧,以保證發(fā)育過(guò)程中的氧化應(yīng)激平衡。已有研究表明,在雞胚的發(fā)育過(guò)程中,不同組織中的相應(yīng)抗氧化酶是不斷變化的[2-4],其中肝臟組織是雞胚中發(fā)揮抗氧化作用最顯著的器官。然而關(guān)于這些抗氧化相關(guān)的mRNAs研究卻報(bào)道不多,因此基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)篩選抗氧化相關(guān)的mRNAs并對(duì)其進(jìn)行功能分析具有重要的研究意義。

近年來(lái),隨著新一代轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-seq)技術(shù)逐漸成為大規(guī)模研究轉(zhuǎn)錄組的一種新的且更為有效的方法[5]。RNA-seq技術(shù)是利用大規(guī)模測(cè)序技術(shù)直接對(duì)cDNA序列進(jìn)行測(cè)序,產(chǎn)生數(shù)以千萬(wàn)計(jì)的測(cè)序序列數(shù)量,從而使得一段特殊的基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄水平可以直接通過(guò)比對(duì)到該基因組區(qū)域的測(cè)序序列數(shù)量來(lái)衡量[6]。文獻(xiàn)[7]研究表明不同發(fā)育時(shí)期牛胚胎的轉(zhuǎn)錄本與牛的基因組對(duì)比后發(fā)現(xiàn)了1 785個(gè)新的轉(zhuǎn)錄本;文獻(xiàn)[8]研究表明禽白血病病毒感染汶上蘆花雞和正常汶上蘆花雞肝臟轉(zhuǎn)錄組對(duì)比得到了1 446個(gè)新基因,其中1 058個(gè)新基因功能得到注釋;文獻(xiàn)[9]研究表明小尾寒羊和多賽特羊脂肪組織的轉(zhuǎn)錄組對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)了2個(gè)樣本之間存在602個(gè)差異表達(dá)基因。

目前,RNA-seq技術(shù)已經(jīng)用于研究魚[10-11]、小鼠[12]等各種類型的轉(zhuǎn)錄組,但對(duì)于雞胚轉(zhuǎn)錄組研究報(bào)道較少?；诳寡趸瘷C(jī)制在雞胚發(fā)育過(guò)程中的重要作用,本研究以黑山雞胚肝臟組織作為研究對(duì)象,對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行篩選及富集功能分析,從而揭示在雞胚發(fā)育過(guò)程中調(diào)控抗氧化酶活力的關(guān)鍵候選基因。

1 材料與方法

1.1 主要材料

孵化至12、13、14、15、16、17、18 d的黑山雞胚蛋,每天的樣品做3次重復(fù)。

1.2 主要試劑與儀器

蛋白定量檢測(cè)試劑盒,超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒,谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒,組織勻漿機(jī),酶標(biāo)儀,臺(tái)式高速冷凍離心機(jī),實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀,Nanodrop核酸蛋白檢測(cè)儀,凝膠成像系統(tǒng),電泳儀,反轉(zhuǎn)錄試劑盒,DNA Marker,核酸染料等。

1.3 雞胚肝臟組織制備及其酶活測(cè)定

取出孵化至一定天數(shù)的雞胚蛋,消毒后置于無(wú)菌操作臺(tái)中取出肝臟組織,清洗,轉(zhuǎn)移至凍存管中,置于-80 ℃環(huán)境中保存,作為待測(cè)樣品。

制成10%組織勻漿,按照超氧化物歧化酶(SOD)檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行測(cè)定。

1.4 RNA提取及質(zhì)量檢測(cè)

使用TRIZOL法提取12、16 d雞胚肝臟組織總RNA,在1%瓊脂糖凝膠上檢測(cè)RNA降解和污染。RNA純度采用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定,以O(shè)D260、OD280、OD320值表示RNA純度。使用生物分析儀2100系統(tǒng)檢查完整度,測(cè)序要求動(dòng)物樣品RNA完整值均需大于7,且電泳條帶中有清晰的28S和18S條帶,28S/18S大于1。

1.5 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和測(cè)序

樣本RNA經(jīng)過(guò)質(zhì)量檢測(cè)合格后,取3 μg作為cDNA文庫(kù)構(gòu)建的輸入材料。采用專門用于Illmina測(cè)序系統(tǒng)建庫(kù)。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

獲得差異表達(dá)基因后,從中隨機(jī)挑選5個(gè)基因,從NCBI上下載對(duì)應(yīng)基因的cDNA序列,進(jìn)行引物設(shè)計(jì),同時(shí)使用GAPDH作為內(nèi)參基因,引物設(shè)計(jì)使用軟件Primer5.0進(jìn)行。引物設(shè)計(jì)完成后委托聯(lián)川生物有限公司合成。采用SYBR GREEN Ⅰ檢測(cè)樣品中靶標(biāo)基因的表達(dá)量。

1.7 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析

1.7.1 數(shù)據(jù)產(chǎn)出情況分析

高通量測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件經(jīng)CASAVA堿基識(shí)別(base calling)分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列(sequenced reads),即為原始測(cè)序序列(raw reads),其中包含測(cè)序序列(reads)的序列信息以及對(duì)應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量信息。為了保證后續(xù)數(shù)據(jù)分析的質(zhì)量,需要將原始測(cè)序序列(raw reads)中帶接頭的、堿基信息無(wú)法確定率大于10%的以及低質(zhì)量的測(cè)序序列(reads)進(jìn)行過(guò)濾,得到的序列信息為過(guò)濾后測(cè)序序列(clean reads),繼而在過(guò)濾后測(cè)序序列(clean reads)基礎(chǔ)上進(jìn)行差異表達(dá)基因鑒定以及功能富集分析。

1.7.2 差異表達(dá)基因的鑒定

測(cè)序數(shù)據(jù)通過(guò)DESeq R軟件包進(jìn)行差異分析,達(dá)到精確對(duì)比測(cè)序樣本間的差異表達(dá)。使用Benjamini和Hochberg的方法調(diào)整所得的P值以控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率。

1.7.3 差異表達(dá)基因的功能富集分析

GO富集可分為分子功能(molecular function)、生物過(guò)程(biological process)和細(xì)胞組成(cellular component)3個(gè)部分。GO富集分析原理為超幾何分布,根據(jù)挑選出的差異基因計(jì)算這些差異基因與GO分類中某幾個(gè)特定的分支的超幾何分布關(guān)系,通過(guò)假設(shè)驗(yàn)證得到一個(gè)特定P值,進(jìn)而判斷差異基因是否在該GO中出現(xiàn)了富集。篩選差異表達(dá)基因后,通過(guò)GO功能富集分析能確定差異表達(dá)基因行使的主要生物學(xué)功能。以P≤0.05為閾值,篩選滿足此閾值的差異表達(dá)基因顯著富集的GO條目。

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)是一個(gè)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)。可借助KEGG 通路進(jìn)行分析基因功能及表達(dá)信息,進(jìn)而作為一個(gè)整體網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。通路顯著性富集分析應(yīng)用超幾何檢驗(yàn),找出與整個(gè)基因組背景相比,在差異表達(dá)基因中顯著性富集的通路。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 雞胚肝臟組織中抗氧化酶活性測(cè)定結(jié)果

2.1.1 SOD測(cè)定結(jié)果

對(duì)孵化至各天數(shù)的黑山雞胚肝臟組織按照試劑盒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖1所示。圖1中,a、b、c表示顯著性差異，相同字母表示無(wú)顯著性差異，下同。

圖1 SOD活力測(cè)定結(jié)果

從圖1可以看出,雞胚在孵化后期肝臟組織中的SOD酶活性差異性變化趨勢(shì)。在雞胚基本成型的12 d時(shí),達(dá)到(424.41±24.24) U/mg,后期逐漸下降,在孵化至16 d時(shí)達(dá)到最小值(329.48±11.22) U/mg。

2.1.2 GSH-Px測(cè)定結(jié)果

對(duì)孵化至各天數(shù)的黑山雞胚肝臟組織按照試劑盒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果如圖2所示。

圖2 GSH-Px活力測(cè)定結(jié)果

從圖2可以看出,雞胚在孵化后期肝臟組織中的GSH-Px活性呈現(xiàn)出差異性變化趨勢(shì)，孵化至12 d時(shí)酶活達(dá)到(33.44±2.65) U/mg,且與后期各天均具有顯著差異(P<0.05),16 d的雞胚肝臟組織GSH-Px酶活性最小,達(dá)到(18.19±2.09)U/mg。

酶活測(cè)定結(jié)果表明,12、16 d 的SOD酶活性與GSH-Px酶活性顯著差異,具有明顯表型極端值。因此,選取孵化至12、16 d雞胚肝臟組織作為后期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)對(duì)象最合理。

2.2 總RNA檢測(cè)結(jié)果

TRIZOL法提取12、16 d各3個(gè)樣品(編號(hào)為1～6)的總RNA,使用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行降解和污染程度檢測(cè),結(jié)果如圖3所示，圖3中,M代表Marker;1～6分別代表Day12-1、Day12-2、Day12-3、Day16-1、Day16-2、Day16-3。

圖3 1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果

圖3中的6個(gè)樣品均有2條清晰條帶,即28S和18S條帶,6個(gè)樣品的OD260/OD280值均大于1.9、OD260/OD230值均大于2.1,RNA完整值均大于9.5,表明總RNA完整性好、總RNA純度高,總RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果見表1所列,檢測(cè)結(jié)果合格,能達(dá)到建庫(kù)要求。

表1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

2.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

通過(guò)Illumina測(cè)序平臺(tái)對(duì)6個(gè)樣品進(jìn)行深度轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估,包括測(cè)序錯(cuò)誤率分布檢查、A/T/G/C含量分布檢查。將原始數(shù)據(jù)序列中含有帶接頭、低質(zhì)量的測(cè)序序列等進(jìn)行過(guò)濾獲得過(guò)濾后測(cè)序序列。測(cè)序結(jié)果見表2所列。

本次測(cè)序每個(gè)樣本獲得了90 699 174～106 556 962個(gè)配對(duì)測(cè)序序列,去除帶接頭的、堿基信息無(wú)法確定率大于10%的以及低質(zhì)量的測(cè)序序列后,獲得了594 016 590個(gè)過(guò)濾后測(cè)序序列,6個(gè)樣品的總讀取長(zhǎng)度為89.1×109堿基。

表2 樣品的基本測(cè)序數(shù)據(jù)

2.4 差異基因表達(dá)分析

將P≤0.05作為篩選差異基因的標(biāo)準(zhǔn),檢查了12、16 d 2個(gè)樣本之間的差異表達(dá)基因表達(dá)譜。2組樣本間共獲得216個(gè)差異表達(dá)基因,其中81個(gè)上調(diào)基因,135個(gè)下調(diào)基因。部分顯著差異基因結(jié)果見表3所列。

表3 部分顯著差異基因

12、16 d 2個(gè)樣本之間的差異表達(dá)火山圖如圖4所示。

圖4 差異表達(dá)基因的火山圖

2.5 差異基因GO富集和KEGG通路分析

為了進(jìn)一步評(píng)估差異表達(dá)基因的功能,進(jìn)行差異基因GO富集功能分析。在列出的216個(gè)差異表達(dá)基因中,GO分析結(jié)果表明，3 140個(gè)GO terms里有421個(gè)GO terms顯著富集,可按照細(xì)胞成分、生物過(guò)程、分子功能分類,在這些GO terms中,與抗氧化有關(guān)的20個(gè)GO生物過(guò)程項(xiàng)顯著富集(P≤0.05)。其中包括:氧轉(zhuǎn)運(yùn)體活性(GO:0005344)、氧氣輸送(GO:0015671)、氧結(jié)合(GO:0019825)、單加氧酶活性(GO:0004497)、氧化還原酶活性(GO:0016712)、氧化還原酶活性,作用于成對(duì)供體,與分子氧結(jié)合或還原(GO:0016705)、氧化還原法(GO:0055114)、氧化還原酶活性(GO:0016491)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性(GO:0004364)等。部分通路詳細(xì)信息見表4所列。

表4 差異表達(dá)基因的GO分析

同時(shí)對(duì)KEGG通路進(jìn)行分析,對(duì)富集情況以散點(diǎn)圖表示,如圖5所示。得到的71個(gè)通路中有8個(gè)通路被顯著富集(P≤0.05),其中包括“藥物代謝細(xì)胞色素p450”(gga00982)、“谷胱甘肽代謝”(gga00480)、“細(xì)胞色素p450對(duì)外源物質(zhì)代謝的影響”(gga00980)等通路與抗氧化酶活性相關(guān)。

2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定

從測(cè)序結(jié)果篩選出的216個(gè)差異表達(dá)基因中隨機(jī)挑選5個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定,以驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，結(jié)果如圖6所示。

圖6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證差異基因表達(dá)

從圖6可以看出,實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)得的基因表達(dá)水平與RNA-seq得到的基因表達(dá)水平一致,從而證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)得到的數(shù)據(jù)是準(zhǔn)確的。

3 討 論

本研究的目的是通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)尋找影響雞胚發(fā)育過(guò)程中抗氧化酶活性變化的關(guān)鍵候選基因。本文以雞胚肝臟組織作為研究對(duì)象,選取孵化至12、16 d的雞胚為研究材料,提取RNA,建立cDNA文庫(kù),對(duì)轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行深度測(cè)序,并進(jìn)行差異分析、功能分析，獲得了216個(gè)顯著差異表達(dá)基因,而一些基因具有已知的功能,例如HMOX2、CYP1A4、MAOA、GSTA、TTPA、MAT1A、GSTA3、MGST3等,也有研究報(bào)道這些基因與抗氧化酶活性有關(guān)[13-16]。在這些差異表達(dá)基因中,GSTA3(明顯下調(diào))、GSTA(明顯下調(diào))、TTPA(明顯上調(diào))、MGST3(明顯下調(diào))、HMOX2(明顯上調(diào))等被認(rèn)為是影響雞胚發(fā)育過(guò)程中抗氧化酶活力的關(guān)鍵候選基因。

血紅素加氧酶(HO)是唯一已知的催化血紅素降解和一氧化碳(一種氣體信號(hào)分子)的哺乳動(dòng)物酶[17]。血紅素代謝對(duì)于細(xì)胞來(lái)說(shuō)至關(guān)重要,血紅素是許多氧轉(zhuǎn)運(yùn)和氧化還原酶的蛋白質(zhì)的必要假體基因[18]。血紅素加氧酶有HO-1、HO-2和HO-3 3種同工型血紅素加氧酶2(HMOX2)在氧化還原、氧化還原酶活性、氧酸代謝等GO中都存在富集,且表達(dá)量明顯上調(diào)。在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下,血紅素加氧酶發(fā)揮著重要作用,HO基因缺失的個(gè)體不能正常發(fā)育并且會(huì)增加對(duì)氧化損傷的敏感性[19]。 HO-1和HO-2具有相似的物理和動(dòng)力學(xué)特性,但具有不同的生理作用和組織分布。HO-1是一種抗氧化和細(xì)胞保護(hù)酶[20],與缺少半胱氨酸殘基的HO-1不同,HO-2包含3個(gè)Cys-Pro標(biāo)記,稱為血紅素調(diào)節(jié)基序(HRM),已知這些特征可控制細(xì)菌和人類有機(jī)體中鐵和氧化代謝有關(guān)的過(guò)程[21]。

谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTA)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶3(GSTA3)是谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GSTs)家族的成員,在谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶活性、氧酸代謝過(guò)程等GO存在富集,參與抗氧化功能調(diào)節(jié)。GSTA編碼屬于α類的谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶,為肝臟和腎臟中細(xì)胞抗氧化劑防御機(jī)制的重要組成部分[22]。GSTA在使反應(yīng)性親電試劑和脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物解毒中起重要的細(xì)胞保護(hù)作用[23],包括GSTA在內(nèi)的GST先前已被確定為應(yīng)激激酶的活性抑制劑,最著名的是c-Jun N端激酶[24]。GSTA3被稱為抗氧化蛋白酶,文獻(xiàn)[25]指出GSTA3敲除小鼠表現(xiàn)出增加的氧化損傷,并且一般認(rèn)為GSTA3在體內(nèi)表現(xiàn)出氫過(guò)氧化物酶活性,其表達(dá)量的下調(diào)隨氧化應(yīng)激水平而變化。

在微粒體谷光甘肽硫轉(zhuǎn)移酶,MGST作為膜結(jié)合蛋白之一，具有谷光甘肽轉(zhuǎn)移酶和過(guò)氧化物酶活性在細(xì)胞及細(xì)胞器的抗氧化脅迫中扮演著重要角色[26]。微粒體谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶3(MGST3)屬于MGST家族,主要是催化外源性物質(zhì)及其活性親電子代謝產(chǎn)物與GSH親核巰基結(jié)合，起到解毒及保護(hù)機(jī)體的重要作用,并且可作為GSH-Px通過(guò)還原膜脂質(zhì)氫化物起到抗脂質(zhì)過(guò)氧化的作用[27]。

α生育酚轉(zhuǎn)移蛋白(TTPA)是一種約32 kDa的胞質(zhì)蛋白,具有明顯的配體特異性并選擇性識(shí)別α生育酚,后者是維生素E的最活躍形式[28],維生素E是大多數(shù)動(dòng)物中主要的脂溶性抗氧化劑。有研究表明,永生化的人類肝細(xì)胞中TTPA基因的轉(zhuǎn)錄是由氧化應(yīng)激和缺氧,核受體PPARα和RXR的激動(dòng)劑以及cAMP水平升高引起的[29]。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)RNA-seq技術(shù)對(duì)孵化至12、16 d的雞胚蛋肝臟組織進(jìn)行深度測(cè)序,獲得大量原始測(cè)序序列數(shù)據(jù),再對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、處理、篩選,共找出216個(gè)顯著差異表達(dá)基因。通過(guò)綜合分析差異表達(dá)基因、通路分析和基因功能分析,最后確定GSTA3、GSTA、TTPA、MGST3、HMOX2、GSTA1、ODC1、MAOA和GST可能是影響雞胚發(fā)育過(guò)程中抗氧化酶活力的候選基因,為后期的研究提供了一定的理論依據(jù)。