兩種不同胚胎培養(yǎng)基對體外受精/卵胞漿內(nèi)單精子注射胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局的影響

李朋粉,竇倩,張樂,張丹,項(xiàng)云改,譚麗

優(yōu)質(zhì)胚胎是成功妊娠必不可少的條件之一，因此胚胎體外培養(yǎng)是輔助生殖技術(shù)中至關(guān)重要的一環(huán)。體外培養(yǎng)過程中能量代謝等相關(guān)需求對胚胎發(fā)育舉足輕重，有研究表明胚胎培養(yǎng)過程中所需培養(yǎng)基可能會影響體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer,IVF- ET)治療周期的胚胎質(zhì)量，進(jìn)而可能影響臨床妊娠率[1-3]。有研究則表明不同培養(yǎng)基對IVF-ET妊娠結(jié)局無顯著影響[4]。我中心自2018年5月開始逐漸投入使用G-series系列培養(yǎng)基(在此之前使用Quinn’s advantageTM序貫培養(yǎng)基)，發(fā)現(xiàn)臨床妊娠率有所提高，臨床結(jié)局的改善與更換培養(yǎng)基有關(guān)，還是與臨床治療方案的改進(jìn)有關(guān)，本研究限定了研究人群的年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、降調(diào)節(jié)方案等，回顧性分析比較本中心使用Quinn’s advantageTM序貫培養(yǎng)基和G-series系列培養(yǎng)基對IVF-ET過程中胚胎發(fā)育和妊娠結(jié)局的影響，探討不同培養(yǎng)基是否會影響IVF-ET治療結(jié)局。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性分析2015年1月至2020年9月在鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心進(jìn)行IVF/ICSI-ET助孕并進(jìn)行新鮮周期移植患者的臨床資料，在此期間我中心使用兩種不同的培養(yǎng)基，2015年1月至2018年4月期間使用Quinn’s advantageTM序貫培養(yǎng)基(SAGE公司，美國)，2018年5月后逐漸投入使用G-series系列培養(yǎng)基(Vitrolife公司，瑞典)。只納入使用單一一種培養(yǎng)基進(jìn)行胚胎培養(yǎng)的患者資料。

納入標(biāo)準(zhǔn)：① 女方年齡<35歲；② 采用短效長方案；③ BMI(18.5～24.9)kg/m2；④ 獲卵數(shù)8～15個(gè)；⑤ 移植日內(nèi)膜厚度≥8 mm；⑥ 僅進(jìn)行IVF/ICSI受精；⑦ 移植D3卵裂期胚胎，均為優(yōu)質(zhì)胚胎，且移植胚胎數(shù)不超過2個(gè)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：① 使用兩種培養(yǎng)基的患者；② 供精周期；③ 贈卵周期；④ 子宮畸形、內(nèi)膜息肉、宮腔積液、粘連、子宮肌瘤、子宮腺肌病者；⑤ 夫妻雙方任一方染色體異常者；⑥ 受精失敗進(jìn)行早補(bǔ)救或晚補(bǔ)救ICSI者；⑦ 輸卵管造影或陰超顯示單側(cè)或雙側(cè)輸卵管積水者；⑧ 反復(fù)種植失敗患者；⑨ 高泌乳素血癥或合并甲狀腺、腎上腺等其他內(nèi)分泌疾病者。

1.2 方法

1.2.1 分組 按照不同受精方式和培養(yǎng)基進(jìn)行分組：采用IVF周期分為：Quinn’s組(n=289)和Vitrolife組(n=99)；采用ICSI周期分為：Quinn’s組(n=161)和Vitrolife組(n=60)。

1.2.2 控制性超排卵方案 采用標(biāo)準(zhǔn)長方案進(jìn)行垂體降調(diào)[5]，黃體中期給予促性腺激素釋放激素激動劑(gonadotropin-releasing hormone agonist,GnRh-a，曲普瑞林，德國Ferring公司)進(jìn)行垂體降調(diào)節(jié)，達(dá)到降調(diào)標(biāo)準(zhǔn)后給予促性腺激素(gonadotropin，Gn)，Gn均為尿促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH,麗申寶，上海麗珠制藥公司)。根據(jù)患者年齡、竇卵泡數(shù)、基礎(chǔ)FSH、BMI等，啟動劑量為150～225 IU/d。促排卵監(jiān)測過程中參考卵泡大小、血清激素水平調(diào)整促排藥物劑量。目標(biāo)卵泡直徑達(dá)18 mm以上，給予人絨毛膜促性腺激素(human choionic gonadotophin,hCG)10 000 IU進(jìn)行扳機(jī)，36 h取卵。

1.2.3 胚胎培養(yǎng) 取卵當(dāng)日收集卵子-放射冠-卵丘復(fù)合物(oocyte-corona-cumulus complex，OCCCs)，放入卵母細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4 h后，卵母細(xì)胞進(jìn)行IVF或ICSI受精[Quinn’s組：Quinn’s AdvantageTMFertilization Medium 1020，加10%人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)；Vitrolife組：G-IVFTMPLUS含10%HSA]，受精后移入卵裂期培養(yǎng)液(Quinn’s組 ：Quinn’s AdvantageTMCleavage Medium 1026，加5%HSA；Vitrolife組 ：G-1TMPLUS含5%HSA)中。受精后第3天除移植和冷凍的胚胎外，剩余胚胎均進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，移入囊胚培養(yǎng)基(Quinn’s組：Quinn’s AdvantageTMBlastocyst Medium 1029，加5%HSA；Vitrolife組 ：G-2TMPLUS含5%HSA)，取卵后第5～6天觀察囊胚發(fā)育情況。

1.2.4 胚胎評估 胚胎評分參照Peter評分系統(tǒng)[6]，囊胚評分參照Gardner評分系統(tǒng)[7]， D3優(yōu)質(zhì)胚胎：來源于2PN，且受精后第3天胚胎細(xì)胞數(shù)為7～9個(gè)，碎片≤10%的胚胎。囊胚形成數(shù)：2期及2期以上。優(yōu)質(zhì)囊胚：3BB以上的囊胚。總優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)：2PN來源的D2的4細(xì)胞/5細(xì)胞，D3的6細(xì)胞以上(包含6細(xì)胞)的I級、II級胚胎+優(yōu)質(zhì)囊胚(3BB以上)。

1.2.5 胚胎移植及臨床妊娠評估 取卵后第3天B超引導(dǎo)下進(jìn)行胚胎移植，移植胚胎數(shù)≤2個(gè)，均為優(yōu)質(zhì)胚胎。移植后30天彩超提示見孕囊者為臨床妊娠。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 患者一般臨床資料比較

分別比較IVF/ICSI周期中不同培養(yǎng)基患者年齡、BMI、不孕年限、平均獲卵數(shù)、移植日內(nèi)膜厚度、D3移植胚胎數(shù)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表1。

表1 患者一般臨床資料比較

2.2 同一受精方式下不同培養(yǎng)基對胚胎發(fā)育的影響

不論IVF/ICSI周期，Vitrolife組囊胚形成率、總優(yōu)質(zhì)胚胎率均高于Quinn’s組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。IVF周期中Vitrolife組D3優(yōu)質(zhì)胚胎率高于Quinn’s組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組2PN受精率、2PN卵裂率相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 不同培養(yǎng)基對胚胎發(fā)育的影響[%(例)]

2.3 同一受精方式下不同培養(yǎng)基對臨床結(jié)局的影響

不論IVF/ICSI周期，Vitrolife組臨床妊娠率均高于Quinn’s組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。ICSI周期中，Vitrolife組胚胎植入率高于Quinn’s組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而IVF周期中，與Quinn’s組相比，Vitrolife組胚胎植入率有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。兩組早期流產(chǎn)率、異位妊娠率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表3。

表3 不同培養(yǎng)基對臨床結(jié)局的影響[%(例)]

2.4 Logistic回歸分析

將潛在混雜因素如女方年齡、BMI、不孕年限、獲卵數(shù)、移植日內(nèi)膜厚度、D3移植胚胎數(shù)、受精方式、不同培養(yǎng)基納入Logistic回歸，以是否臨床妊娠為因變量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示：不同培養(yǎng)基(OR=0.539,95%CI0.363-0.801，P=0.002)和移植胚胎數(shù)(OR=4.784,95%CI1.715-13.349，P=0.003)是影響臨床妊娠的因素，詳見表4。

表4 Logistic回歸分析結(jié)果

3 討論

目前關(guān)于培養(yǎng)基是否影響IVF-ET治療結(jié)局尚有爭議，有研究數(shù)據(jù)表明培養(yǎng)基可能會影響胚胎發(fā)育、IVF-ET妊娠結(jié)局，甚至對新生兒健康造成影響[1,8-9]，這可能與不同培養(yǎng)基中的成分不同有關(guān)。Tarahomi M等[10]納入了15種用于IVF實(shí)驗(yàn)室的商品化培養(yǎng)基(包括Vitrolife和Quinn’s培養(yǎng)基)，比較分析不同培養(yǎng)基中葡萄糖、乳酸、丙氨酸、21種氨基酸等37種成分的濃度，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基之間的組成不同，沒有兩種培養(yǎng)基具有相同的成分濃度。

本中心自2018年5月投入使用G-series系列培養(yǎng)基后臨床妊娠率有所提高。為探討是由于更換培養(yǎng)基還是臨床方案的改進(jìn)造成妊娠結(jié)局改善，限定了納入研究人群，回顧性分析比較Quinn’s advantageTM序貫培養(yǎng)基和G-series系列培養(yǎng)基對胚胎發(fā)育和IVF-ET妊娠結(jié)局的影響。結(jié)果表明與Quinn’s advantageTM序貫培養(yǎng)基相比，使用G-series系列培養(yǎng)基進(jìn)行體外培養(yǎng)，得到的優(yōu)質(zhì)胚胎更多，臨床妊娠率也明顯提高，推測胚胎發(fā)育和臨床結(jié)局的改善可能與兩種培養(yǎng)基中所含有的成分不同或成分含量不同有關(guān)。

胚胎發(fā)育早期階段對能量代謝需求低，主要依靠三羧酸循環(huán)和磷酸化氧化產(chǎn)生能量，以乳酸、丙酮酸、谷氨酰胺為底物[11-12]，胚胎發(fā)育至桑椹胚期對葡萄糖需求增加[13]。Chu D等[14]在受精延遲6 h小鼠胚胎中添加5 mM葡萄糖可改善胚胎發(fā)育潛力。Gardner DK等[15]研究結(jié)果表明在最終形成囊胚的胚胎中，形成評分高的囊胚，葡萄糖的攝入量最大，提示葡萄糖是囊胚發(fā)育所需的更為重要的營養(yǎng)。此外，氨基酸在配子發(fā)生、受精、胚胎著床、胎盤植入、胎兒生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用[16]。其中，丙氨酸和谷氨酰胺攝取可能與囊胚發(fā)育有關(guān)[11]。谷氨酰胺是植入前胚胎所需的重要非必需氨基酸，在體外發(fā)育過程中，約70%谷氨酰胺參與三羧酸循環(huán)，為植入前胚胎發(fā)育提供能量底物，還參與谷氨酸和α-戊酮二酸的合成，同時(shí)具有抗氧化作用、能夠清除自由基，有益于哺乳動物早期胚胎的生長發(fā)育[17]。Devreker F等[18]將138個(gè)正常受精胚胎隨機(jī)分配到含有或沒有1 mm谷氨酰胺的無葡萄糖培養(yǎng)基中，含有谷氨酰胺培養(yǎng)的胚胎達(dá)到桑葚期和囊胚期比例高于不含谷氨酰胺的，提示向培養(yǎng)基中添加谷氨酰胺有利于植入前胚胎發(fā)育，增加了發(fā)育到桑葚期和囊胚期胚胎的比例。

本研究結(jié)果顯示：與Quinn’s組相比，Vitrolife組囊胚形成率、總優(yōu)質(zhì)胚胎率均顯著性升高。推測這可能與Vitrolife培養(yǎng)基中葡萄糖、乳酸含量均高于Quinn’s 培養(yǎng)基[葡萄糖：卵裂期(0.5±0)mmoL vs 0、囊胚期(3.28±0.03)mmoL vs (2.27±0.03)mmoL；乳酸：卵裂期(10.7±0.1)mmoL vs (4.3±0)mmoL、囊胚期(6.02±0.01)mmoL vs (4.16±0.06)mmoL]，以及Vitrolife培養(yǎng)基中含有丙氨酸和谷氨酰胺，而Quinn’s 培養(yǎng)基中丙氨酸含量低于檢測極限(<1 μmol/L)，且未檢測到谷氨酰胺有關(guān)[10]。

本研究結(jié)果提示G-series系列培養(yǎng)基比Quinn’s advantageTM序貫培養(yǎng)基可能更有利于胚胎的發(fā)育，能夠提高臨床妊娠率，為輔助生殖中心選用商品化培養(yǎng)基提供一個(gè)參考。為了減少影響妊娠結(jié)局的混雜因素，本研究納入35歲以下、獲卵數(shù)8～15個(gè)的卵巢正常反應(yīng)的患者，采用黃體期降調(diào)節(jié)方案，這樣比較兩種培養(yǎng)基的差別有一定的參考價(jià)值。但納入人群可能存在局限性，后續(xù)會比較不同培養(yǎng)液對不同用藥方案、不同年齡、不同卵巢反應(yīng)患者的胚胎發(fā)育情況，期望有大樣本前瞻性的研究為臨床提供更有利于胚胎發(fā)育的商品化培養(yǎng)液。