魚鱗魚皮制備膠原蛋白肽研究進(jìn)展

鉏曉艷，趙雅靜，，李海藍(lán)，孔秀琴，廖濤，熊光權(quán)*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北武漢430064；2.蘭州理工大學(xué)石油化工學(xué)院，甘肅蘭州730000）

我國(guó)是世界第一漁業(yè)大國(guó)[1]，也是魚鱗魚皮等副產(chǎn)物產(chǎn)出大國(guó)。2019年我國(guó)水產(chǎn)品總產(chǎn)量為6 480.36萬(wàn)噸，水產(chǎn)品加工企業(yè)達(dá)9323家，加工總量達(dá)2171.41萬(wàn)噸[2]。魚鱗魚皮按魚體總重的10%～12%計(jì)，年產(chǎn)量預(yù)估可達(dá)200萬(wàn)噸以上。目前，水產(chǎn)品加工企業(yè)的魚鱗魚皮一般用于制作魚飼料，價(jià)格低廉、加工利用率低、生物資源浪費(fèi)嚴(yán)重[3-4]，因此亟需對(duì)其進(jìn)行高值化轉(zhuǎn)化和利用。魚鱗魚皮中富含高品質(zhì)膠原蛋白，可用于食品、保健品、護(hù)膚品當(dāng)中[5]。以魚鱗魚皮為原料制備膠原蛋白肽，不僅能夠充分利用資源，提高其附加值，而且可以減少環(huán)境污染，對(duì)水產(chǎn)品加工業(yè)健康持續(xù)發(fā)展具有重要意義[6-7]。

目前，市場(chǎng)上膠原蛋白肽產(chǎn)品種類繁多，分子量在500 Da～2 500 Da不等[8]。傳統(tǒng)的膠原蛋白肽主要從陸生動(dòng)物的皮或骨骼中提取，如豬皮、牛皮。但由于一些人畜共患病、原料成本高、產(chǎn)品分子量大等原因，該來(lái)源的膠原蛋白肽已逐漸失去市場(chǎng)優(yōu)勢(shì)。魚源肽具有來(lái)源安全、分子量小、易吸收、相容性好、刺激性小等優(yōu)點(diǎn)[9]，逐漸成為食品、保健品、護(hù)膚品等市場(chǎng)中炙手可熱的產(chǎn)品。其中，用魚鱗魚皮制備的生物活性肽，由于原料價(jià)格低廉、工藝簡(jiǎn)單可控、產(chǎn)品品質(zhì)高等優(yōu)勢(shì)，成為魚源肽加工的首選。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)膠原蛋白肽的相關(guān)研究主要集中在提取制備、結(jié)構(gòu)鑒定和功能表征等方面，因此本文主要綜述了魚鱗魚皮肽的制備方法、肽分離鑒定及生物活性等方面的研究進(jìn)展，并對(duì)其市場(chǎng)前景進(jìn)行了分析和展望。

1 魚鱗魚皮肽的提取方法

從魚鱗魚皮中提取膠原蛋白肽的方法主要包括酸法、堿法、酶法、熱水法等。酸堿提取法是通過提取介質(zhì)改變蛋白質(zhì)的酸堿性，進(jìn)而破壞其結(jié)構(gòu)將肽提取出來(lái)[10]。酶法是通過酶切位點(diǎn)破壞被提取物原有結(jié)構(gòu)進(jìn)行提取。熱水法是將原料經(jīng)過前處理后在熱水中進(jìn)行提取的方法。魚鱗前處理中需要注意灰分（羥基磷灰石）的脫除，魚皮則需要注意脂肪的脫除[11]。

魚鱗魚皮膠原蛋白肽的主要提取方法見表1。

表1 魚鱗魚皮膠原蛋白肽的提取方法Table 1 Extraction methods of collagen peptide from fish scales and skins

由表1可知，酸法中常用鹽酸、醋酸、檸檬酸等作為提取介質(zhì)。王信蘇等[12]研究表明，利用不同類型的酸提取草魚魚鱗膠原蛋白肽，提取效果由高到低分別為檸檬酸＞乳酸＞醋酸。酶法制備中常采用植物蛋白酶（木瓜蛋白酶、菠蘿皮蛋白酶等）、堿性蛋白酶、胰蛋白酶等，該方法對(duì)工藝中的溫度、pH值、酶濃度等條件要求嚴(yán)格。楊貴蘭等[13]利用胰蛋白酶酶解阿拉斯加鱈魚皮制備降血壓肽，獲得最優(yōu)酶解條件為溫度40℃，酶與底物質(zhì)量比 3%，料液比 1∶7（g/mL），pH7，酶解時(shí)間2 h。目前，魚鱗魚皮肽在實(shí)際生產(chǎn)中多采用復(fù)合提取的方式，即先利用酸對(duì)魚鱗魚皮進(jìn)行脫鈣脫雜，再利用堿使魚鱗魚皮脫腥脫臭并使其結(jié)構(gòu)疏松，最后采用酶法酶解獲得膠原蛋白肽。

2 魚鱗魚皮肽的膜分離

膜分離是以膜兩側(cè)壓力差為驅(qū)動(dòng)力的一種篩分過程[16]，在工業(yè)生產(chǎn)中可用于脫雜、除菌、除酶、脫鹽、產(chǎn)品分級(jí)等。與傳統(tǒng)的分離工藝相比，膜分離技術(shù)具有分離效率高、能耗小、選擇性高等優(yōu)勢(shì)，可應(yīng)用于蛋白肽的分離、提純和濃縮。膜分離在工業(yè)化生產(chǎn)中一般采用多級(jí)耦聯(lián)的模式，以達(dá)到連續(xù)除雜、分級(jí)和脫鹽的效果。根據(jù)膜孔徑或傳質(zhì)驅(qū)動(dòng)力的不同，膜分離方式可以分為微濾、超濾、納濾、反滲透等，其主要分類及用途見表2。

表2 分離膜的種類及用途Table 2 Types and uses of separation membrane

膜分離主要用于目標(biāo)物質(zhì)的分離截留和功能驗(yàn)證。Sonklin等[17]利用超濾技術(shù)對(duì)粗分離的綠豆粕蛋白水解肽MMPH進(jìn)行分級(jí)分離，得到4個(gè)部分，其中分子量小于1 kDa的F4表現(xiàn)出最高的DPPH自由基、超氧化物及羥基自由基清除活性和金屬螯合活性。膜分離也可以和液相色譜技術(shù)結(jié)合，用于目標(biāo)物質(zhì)的篩選和鑒定。Wang等[18]對(duì)蒼耳果實(shí)提取物利用超濾-高效液相色譜篩選出3種具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制酪氨酸酶的物質(zhì)。Li等[19]利用超濾-液相質(zhì)譜法篩選和鑒定人參提取物α-葡萄糖苷酶抑制劑。

3 魚鱗魚皮肽的序列鑒定及結(jié)構(gòu)解析

3.1 序列鑒定

肽的鑒定可使用正交加速電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法（quadrupole-time of flight，Q-TOF）。測(cè)定過程中質(zhì)譜條件常選用Ar作碰撞氣體，N2作霧化氣體。將需要鑒定的肽進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，得到電噴霧電離質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS） 圖，再?gòu)腅SI-MS圖中選出待測(cè)離子進(jìn)行ESI-MS/MS分析，最后根據(jù)分析結(jié)果推導(dǎo)出肽段的氨基酸序列[20]。周明等[21]利用Q-TOF進(jìn)行了12個(gè)組分峰的肽序列鑒定，其中，YGPQ、LSPY、AYPQ和AYLQQQ這4個(gè)肽段的總抗氧化能力比玉米低聚肽強(qiáng)。

3.2 二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定

肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定可采用遠(yuǎn)紫外圓二色譜法[22]。先將選取的目標(biāo)肽加熱到指定溫度后進(jìn)行恒溫保持，然后進(jìn)行紫外波長(zhǎng)（190 nm～250 nm）掃描，該方法要求每個(gè)肽至少重復(fù)掃描兩次，求其平均值，再利用Pro-Date Viewer、CDNN 等軟件測(cè)定構(gòu)象[23-24]。

3.3 表面結(jié)構(gòu)觀察

肽表面結(jié)構(gòu)的觀察可使用原子力顯微鏡觀察（atomic force microscope，AFM），AFM 可以直接測(cè)試物體表面，得到清晰度高、分辨率高的物體表面圖像[25]。由于AFM不受樣品導(dǎo)電性能的影響，測(cè)試過程中對(duì)樣品表面無(wú)損害，同時(shí)還可以獲得樣品顆粒厚度等信息，多用于觀測(cè)粉末狀樣品的表面結(jié)構(gòu)[26]。AFM鏡檢可采用接觸模式、非接觸模式、輕敲模式及相位移模式觀察[27]。Tinazli等[28]先利用接觸模式AFM探針將已經(jīng)吸附的蛋白質(zhì)部分刮除得到圖案化模板，再在模板上附著另外一種蛋白質(zhì)，制備出功能性多蛋白復(fù)合體。甘田生[29]利用AFM對(duì)大腸桿菌外膜孔蛋白OmpF三聚體脂質(zhì)膜表面進(jìn)行觀察，觀察到表面小突起是連接到β鏈上的短肽環(huán)（含有2個(gè)～3個(gè)氨基酸）。

3.4 空間結(jié)構(gòu)解析

肽空間結(jié)構(gòu)的解析多采用核磁共振法。Roch等[30]利用核磁共振對(duì)抗菌肽Mytilin B結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果表明，Mytilin B分子結(jié)構(gòu)是由4對(duì)二硫鍵將1段α-螺旋和2段β-折疊片穩(wěn)定的特殊空間結(jié)構(gòu)。此外，二維核磁共振（2D nuclear magnetic resonance，2DNMR）可將核磁共振中譜線強(qiáng)度、耦合常數(shù)及化學(xué)位移等參數(shù)表現(xiàn)在二維平面上，避免一維核磁中的信號(hào)重疊并且可以提供自旋核之間相互作用的信息，從分子水平分析肽的功能活性位點(diǎn)[31]。

4 魚鱗魚皮肽的生物學(xué)功能

4.1 魚鱗魚皮肽對(duì)黑色素的抑制

利用B16小鼠黑色瘤細(xì)胞可以驗(yàn)證魚鱗魚皮肽對(duì)黑色素的抑制情況[32]。將B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞接種于含雙抗的達(dá)爾伯克（氏）改良伊格爾（氏）（dulbecco’s modified eagle’s medium，DMEM）培養(yǎng)基，并置于二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、消化傳代。待細(xì)胞附著后，進(jìn)行黑色素含量、酪氨酸酶活性等測(cè)定。高雅倩等[33]在對(duì)α-促黑素誘導(dǎo)B16細(xì)胞模型中表明，棕櫚酰三肽-5可以通過抑制酪氨酸酶活性降低黑色素水平。

4.2 魚鱗魚皮肽保濕功能的測(cè)定

成纖維細(xì)胞細(xì)胞增殖率、細(xì)胞透明質(zhì)酸含量、膠原蛋白含量等指標(biāo)能反映魚鱗魚皮肽的保濕功能。Sun等[34]從羅非魚皮中鑒定出3個(gè)關(guān)鍵肽段GYTGL、LGATGL和VLGL，該肽段可以有效降低膠原蛋白的降解并能抑制紫外誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶 1（matrix metallopeptidase 1，MMP-1）活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）活性，促進(jìn)人體成纖維細(xì)胞增值。Okawa等[35]水解膠原蛋白后得到Pro-Hyp、Cys-Thr-Gly兩種寡肽，該肽段具有明顯提高成纖維細(xì)胞中透明質(zhì)酸合成的作用。邵茜等[36]通過MTT法比較了濃度為 10 μg/mL～1 000 μg/mL 的鱈魚皮膠原肽、海蜇膠原肽、牛骨膠原肽對(duì)光老化皮膚成纖維細(xì)胞的影響。結(jié)果表明，鱈魚皮膠原肽組成纖維細(xì)胞的增殖率要高于海蜇膠原肽組和牛骨膠原肽組。

4.3 魚鱗魚皮肽對(duì)皮膚的改善作用

通過對(duì)大鼠皮膚彈性、蛋白質(zhì)含量、羥脯氨酸（Hyp）含量、皮膚含水量、皮膚組織中MMP-1含量等進(jìn)行測(cè)定，表明羥脯氨酸的含量可直接反映真皮內(nèi)纖維含量，與皮膚衰老狀況呈正相關(guān)[37-38]。紫外線照射下皮膚中MMP-1含量升高導(dǎo)致膠原纖維合成受阻，膠原蛋白快速降解，皮膚彈性下降[39-40]。Chen等[41]通過小鼠實(shí)驗(yàn)得到平均分子量為1 200 Da的鱈魚皮膠原蛋白肽可以抑制MMP-1的活性，有改善小鼠皮膚的作用。

5 魚鱗魚皮肽的應(yīng)用前景與展望

本文對(duì)魚鱗魚皮肽的提取方法、分離提純、序列鑒定、結(jié)構(gòu)解析及其生物學(xué)功能進(jìn)行了系統(tǒng)分析。目前魚鱗魚皮肽已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品、食品、日用化學(xué)品等領(lǐng)域，但仍存在高價(jià)值轉(zhuǎn)化水平不高，產(chǎn)品單一，規(guī)模化智能化生產(chǎn)技術(shù)不夠成熟等問題。在提取工藝方面，可應(yīng)用一些新型提取工藝（超聲波、超臨界萃取、高壓脈沖電場(chǎng)技術(shù)等）相互結(jié)合提高魚鱗魚皮肽提取率和工業(yè)化程度。此外，市場(chǎng)上肽的開發(fā)聚焦于分子量小于500 Da可被腸道直接吸收的小肽上，其產(chǎn)品功能性受到諸多質(zhì)疑，可以考慮開發(fā)分子量3 000 Da～10 000 Da具有實(shí)際生物學(xué)活性的多肽。目前我國(guó)大健康產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，蛋白質(zhì)與肽類產(chǎn)品或?qū)⒊蔀樾枨罅孔畲蟮漠a(chǎn)品類型，確定肽的生產(chǎn)工藝與配方，集成產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)技術(shù)，進(jìn)行目標(biāo)生物活性肽的生產(chǎn)是極具市場(chǎng)前景的。因此，利用我國(guó)豐富的魚鱗魚皮資源，深入研究魚鱗魚皮肽的提取工藝和生物學(xué)功能，擴(kuò)大應(yīng)用范圍，有利于改善我國(guó)魚類副產(chǎn)物加工現(xiàn)狀，促進(jìn)我國(guó)魚鱗魚皮肽的產(chǎn)業(yè)發(fā)展。