LC-ESI-MS/MS結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)鑒定野菜鼠曲草中的黃酮類化合物

石青浩，李榮，李書啟，姜子濤，*

（1.天津天獅學(xué)院食品工程學(xué)院，天津300710；2.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津300134）

鼠曲草（Gnaphalium affine）是菊科擬鼠麴草屬草本植物，別名擬鼠麹草、鼠麹草、清明菜、田艾等，是民間喜愛的時(shí)令野生蔬菜。鼠曲草全草富含黃酮、氨基酸、揮發(fā)油及礦物質(zhì)等多種功能性成分，營養(yǎng)價(jià)值高[1-5]。此外，鼠曲草全草可入藥，現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)鼠曲草具有顯著的抗菌、抗病毒、抗氧化、抑制酶活性、鎮(zhèn)咳和祛痰等作用[6-10]，可用于治療急性支氣管炎、慢性支氣管炎、支氣管哮喘、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病，有很高的藥用價(jià)值。

黃酮類化合物是野菜鼠曲草中的重要生物活性成分，Morimoto等[11]發(fā)現(xiàn)鼠曲草中的甲氧基黃酮具有明顯的昆蟲拒食活性，可以保護(hù)鼠曲草免受昆蟲的噬咬。田彩云[12]采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）方法建立了同時(shí)測定鼠曲草中6種黃酮類成分含量的方法。高俊斌等[13]和盧曉藝等[14]通過HPLC法發(fā)現(xiàn)鼠曲草因產(chǎn)地不同及葉莖根等部位不同其黃酮類化合物含量存在較大差異。謝建祥等[15]、李勝華[16]和白麗明等[17]均采用多種色譜技術(shù)對(duì)鼠曲草的乙醇提取物進(jìn)行純化，從提取物中分別鑒定出多種黃酮成分，均發(fā)現(xiàn)有芹菜素和木犀草素的存在，說明不同純化方法和純化條件對(duì)成分鑒定的影響較大。Lin等[18]從鼠曲草中分離出了木犀草素和木犀草素-4’-O-葡萄糖苷，并證實(shí)其有較高的藥用價(jià)值。

本課題組前期研究了鼠曲草黃酮的微波輔助提取條件，并對(duì)提取的鼠曲草黃酮與常見的抗氧化劑維生素C進(jìn)行了體外抗氧化性能的比較研究[19]。本研究采用微波法輔助提取得到鼠曲草黃酮，利用大孔樹脂進(jìn)行了純化，并通過高效液相色譜電噴霧離子化串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry，LC-ESI-MS/MS）結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比法，對(duì)鼠曲草黃酮成分進(jìn)行了系統(tǒng)分析，為鼠曲草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鼠曲草：安徽誠信藥家有限公司，產(chǎn)地安徽省，烘箱干燥后粉碎，過40目篩備用。

AB-8大孔樹脂：南開大學(xué)化工廠；木犀草苷、金絲桃苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、毛地黃黃酮、槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品：上海順勃有限公司；綠原酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?、奎寧酸標(biāo)準(zhǔn)品：成都德天生物科技有限公司；甲醇（色譜純）：德國Mallinckrodt Baker公司；甲酸（色譜純）：美國Columbus Chemical Industries公司。

1.2 主要儀器

G6410A LC-MSD QQQ液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)機(jī)：美國Agilent Technologies公司；MAS-Ⅰ型微波快速制樣系統(tǒng)：上海新儀微波化學(xué)科技有限公司；U-3900 UV-Vis分光光度計(jì)：日本Hitachi High-Technologies公司；LGJ-10冷凍干燥機(jī)：北京松源華興科技發(fā)展有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品液的制備

鼠曲草黃酮的提取按照文獻(xiàn)[19]方法，以50%的乙醇為溶劑進(jìn)行微波輔助提取。得到的提取液經(jīng)石油醚萃取，減壓濃縮，再經(jīng)冷凍干燥得到鼠曲草黃酮粗提物粉末。取粗提物粉末0.25 g，用5 mL無水乙醇溶解，并用蒸餾水定容至250 mL，即得濃度為1.0 mg/mL上樣液。上樣液經(jīng)過填充有AB-8大孔樹脂的15 cm層析柱進(jìn)行純化，吸附解吸參數(shù)：吸附流速2倍柱體積/h；上樣液pH4.0；以4倍柱體積的50%乙醇作為洗脫劑；解吸流速為2 BV/h。收集洗脫液，經(jīng)減壓濃縮及冷凍干燥制得純化后的鼠曲草黃酮。取適量的純化后鼠曲草黃酮粉末，用50%甲醇配制成0.05 mg/mL樣品液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，供LC-ESI-MS/MS分析用。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品奎寧酸、綠原酸、3，5-二咖啡?？鼘幩帷⒛鞠蒈?、金絲桃苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素和毛地黃黃酮各0.0100g，用50mL50%甲醇溶解后，得到濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。然后用50%的甲醇將儲(chǔ)備液稀釋成10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，將標(biāo)準(zhǔn)品溶液過0.22 μm的微孔濾膜，貯存于4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 LC-MS/MS分析

色譜條件：采用ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）硅膠色譜柱，柱溫為30℃。流動(dòng)相為甲醇-水體系（水相中含0.1%甲酸），采用梯度洗脫的方式：0～10min，甲醇由50%勻速升高至72%，然后保持該體積分?jǐn)?shù)繼續(xù)運(yùn)行12 min，流動(dòng)相流速為0.3 mL/min。鼠曲草黃酮樣品溶液進(jìn)樣量為8 μL，黃酮標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)樣量為5 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧ESI負(fù)離子源，霧化氣體為N2，噴霧電壓3 842 V，霧化氣流速10 L/min，霧化氣壓力35psi（1psi=6.895kPa），離子源溫度350℃，碰撞氣壓力0.15 MPa，碰撞氣體為高純 N2，m/z掃描范圍，100 amu～1 000 amu。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠曲草黃酮的定性分析

鼠曲草黃酮樣品和黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的LC-ESI-MS/MS總離子流圖如圖1所示。

圖1 鼠曲草黃酮和標(biāo)準(zhǔn)品的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of flavonoids from Gnaphalium affine and standards

如圖 1 所示，鼠曲草黃酮樣品 1、2、3、4、6、7、8、9 和11號(hào)化合物與9種黃酮標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間一致，可初步斷定樣品液中這9種成分與標(biāo)準(zhǔn)品是相同化合物。

對(duì)鼠曲草黃酮樣品液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液中每一個(gè)準(zhǔn)分子離子[M-H]-進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，以得到具有特征信息的碎片離子，根據(jù)待測物質(zhì)一級(jí)質(zhì)譜的準(zhǔn)分子離子的質(zhì)荷比（m/z）、保留時(shí)間及二級(jí)質(zhì)譜的主要子離子的m/z與標(biāo)準(zhǔn)品相比較，結(jié)果見表1，并參考相關(guān)的文獻(xiàn)[20-23]，對(duì)鼠曲草黃酮樣品液中的11種物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。

表1 樣品和標(biāo)準(zhǔn)品中各化合物的保留時(shí)間和碎片離子Table 1 The retention time and fragment ions of each compound in sample and standards

通過對(duì)比可以進(jìn)一步確定 1、2、3、4、6、7、8、9、11號(hào)化合物分別為奎寧酸、綠原酸、3，5-二咖啡?？鼘幩帷⒛鞠蒈?、金絲桃苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、毛地黃黃酮，其結(jié)構(gòu)式見圖2。

化合物5的二級(jí)質(zhì)譜見圖3。

圖 2 化合物 1、2、3、4、6、7、8、9、11 的結(jié)構(gòu)式Fig.2 The structural formula of compound 1，2，3，4，6，7，8,9 and 11

圖3 化合物5的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.3 MS2spectrum of compound 5

由圖3可見該化合物準(zhǔn)分子離子m/z為461；子離子m/z為285，是野黃芩苷的特征峰。其準(zhǔn)分子離子和子離子與文獻(xiàn)中報(bào)道的野黃芩苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的質(zhì)譜碎片相同[20-21]。減少的m/z為176的殘基是由化合物5在裂解過程中脫去一分子的葡萄糖醛酸碎片產(chǎn)生的。結(jié)合文獻(xiàn)[22]判斷化合物5為野黃芩苷，其裂解過程見圖4。

圖4 野黃芩苷的裂解過程Fig.4 The fragmentation process of scutellarin

化合物10的二級(jí)質(zhì)譜信息見圖5。

由圖5可見該化合物準(zhǔn)分子離子的m/z為625；子離子m/z為301，是槲皮素的特征離子。減少的質(zhì)量數(shù)為324的殘基是化合物11在裂解過程中脫去兩分子的葡萄糖的結(jié)果。結(jié)合文獻(xiàn)[23]，可推斷該化合物為槲皮素-3-O-槐糖苷。其裂解過程見圖6。

圖5 化合物10的二級(jí)質(zhì)譜圖Fig.5 MS2spectrum of compound 10

圖6 槲皮素-3-O-槐糖苷的裂解過程Fig.6 The fragmentation process of quercetin-3-O-sophorside

在鑒定出的11種化合物中，綠原酸、3，5-二咖啡酰奎寧酸、木犀草苷、野黃芩苷、金絲桃苷、槲皮素、毛地黃黃酮在相關(guān)文獻(xiàn)中已有報(bào)道[8,12-16，22]。但奎寧酸、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素-3-O-槐糖苷幾種化合物是在鼠曲草中首次發(fā)現(xiàn)。

2.2 樣品中化合物的定量分析

利用多重反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM），通過對(duì)鼠曲草提取液中化合物的特征碎片離子的監(jiān)測來進(jìn)行定量分析，以倍數(shù)稀釋法將標(biāo)準(zhǔn)品溶液稀釋成不同濃度，然后進(jìn)行質(zhì)譜測定。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到每一種黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，分別以信噪比S/N=3時(shí)各對(duì)照品的含量作為檢出限。其中有標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照的9種化合物采用外標(biāo)法進(jìn)行定量，5號(hào)化合物和10號(hào)化合物分別以木犀草苷和毛地黃黃酮為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行定量，結(jié)果見表2。

由表2可見，在一定的濃度范圍內(nèi)，9種標(biāo)準(zhǔn)品的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)在0.997 4～0.999 8之間，檢出限介于1.35 ng/mL～15.9 ng/mL，添加回收率范圍在97.2%～102.5%，可見此方法具有較高的靈敏度、精密度和準(zhǔn)確度。

表2 鼠曲草中化合物的含量Table 2 Contents of components in Gnaphalium affine

3 結(jié)論

利用LC-ESI-MS/MS技術(shù)結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比法，對(duì)鼠曲草乙醇提取物進(jìn)行了成分分析鑒定，結(jié)果顯示鼠曲草中存在11種成分，分別為奎寧酸、綠原酸、3，5-二咖啡?？鼘幩?、木犀草苷、野黃芩苷、金絲桃苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素、槲皮素-3-O-槐糖苷和毛地黃黃酮。其中奎寧酸、綠原酸、3，5-二咖啡酰奎寧酸含量最高，為酚酸類成分。其余為黃酮類成分，含量較高的為毛地黃黃酮、紫云英苷、金絲桃苷?？鼘幩?、芹菜素-7-葡萄糖苷、紫云英苷、槲皮素-3-O-槐糖苷在該植物中為首次發(fā)現(xiàn)。