高效液相色譜法測定枸杞中9種酚酸化合物含量

楊春霞

（寧夏農(nóng)產(chǎn)品質量標準與檢測技術研究所，寧夏銀川750002）

枸杞是我國傳統(tǒng)的名貴中藥材，被廣泛用于醫(yī)藥、食療、養(yǎng)生、保健等領域，其化學成分類型豐富，主要包括多糖類[1]、蛋白質氨基酸類[2]、黃酮類[3]、生物堿類[4]、類胡蘿卜素[5]、甾醇類、萜類等多種類型化學成分，被國家衛(wèi)生部規(guī)定為藥食同源的品種[6]。隨著人們的保健意識和食品安全意識增強，其生理作用和營養(yǎng)價值越來越被人們追捧。研究表明：枸杞有抑菌、抗突變、清除自由基、抗氧化、降血糖、降血脂、調節(jié)免疫、調節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)等作用[7]。枸杞之所以具有這些生理活性可能與其中的酚類成分有著一定關系。

枸杞多糖、黃酮等成分的研究已有大量報道[8-10]。近幾年，研究者對枸杞功能營養(yǎng)成分總酚[11]、黑果枸杞汁中酚酸[12]、黑果枸杞花青素成分[13-14]展開了研究，比較了寧夏、新疆、青海、甘肅地區(qū)種植的枸杞總酚含量，研究枸杞總酚含量呈現(xiàn)的種植區(qū)域化[15]。張自萍等[16]、楊文等[17]采用高效液相色譜法測定了寧夏枸杞中綠原酸的含量。譚亮等[18]對青海產(chǎn)的不同品種枸杞中5種酚酸含量進行測定，同時比較了內(nèi)蒙古、甘肅、新疆及寧夏產(chǎn)枸杞中酚酸含量。劉少靜等[19]建立了同時測定黑果枸杞中綠原酸、咖啡酸、表兒茶素和阿魏酸含量的反相高效液相色譜法。楊春霞等[20]重點對寧夏4個產(chǎn)區(qū)種植的寧杞1號、5號、7號、9號中總酚含量進行分析，比較了各產(chǎn)區(qū)、每個品種間夏果枸杞與秋果枸杞中總酚含量的差異性。本試驗選取與枸杞藥理學作用有關的沒食子酸、香豆酸、原兒茶醛、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、阿魏酸為目標物，以30%～40%的乙醇作提取劑，通過冷凝回流、鹽酸酸化、乙酸乙酯萃取提取枸杞中酚酸成分，建立了高效液相色譜法同時測定枸杞中9種酚酸化合物的方法，以期為枸杞的質量控制提供技術支撐和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枸杞：中寧枸杞種植基地，采集成熟的寧杞1號、5號、7號和9號鮮果，樣品用液氮冷凍研磨后保存待用。

乙腈（色譜純）：Fisher Scientic公司；無水乙醇（優(yōu)級純）、磷酸溶液（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸、香豆酸、原兒茶醛、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、阿魏酸（標準品，純度≥98%）：北京世紀奧科生物技術有限公司；試驗用水為超純水（電導率小于 18.2 μs/cm）。

1.2 儀器與設備

LC-20AD高效液相色譜儀（配SPD-20A紫外檢測器）：日本島津公司；U3900紫外分光光度計：日本日立公司；KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；LD5-2A型高速冷凍離心機：北京醫(yī)用離心機廠；CHA-S恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；Milli-Q型超純水機：美國密理博公司；

1.3 試驗方法

1.3.1 標準溶液的配制

準確稱取沒食子酸、香豆酸、原兒茶醛、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、丁香酸、阿魏酸各5.0mg，用甲醇溶解，定容到10.00mL容量瓶中，濃度分別為0.5mg/mL。

用甲醇將對照品母液按不同倍數(shù)稀釋，制備系列混合對照品溶液，9種酚酸的濃度依次為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、5.0、10.0、20.0、30.0 mg/L。4 ℃條件下冷藏備用。

1.3.2 枸杞樣品處理

稱取一定量的枸杞粉末，加入30%～40%乙醇溶液，料液比 1∶10（g/mL），在 25 ℃條件下振蕩 2 h，然后于水浴中回流2 h，回流后的液體過濾后進行減壓蒸餾，蒸餾后用鹽酸調節(jié)pH值為2.5～3.0，得到酸化液。酸化液中加入20 mL乙酸乙酯萃取，分離有機溶劑層，然后減壓濃縮去除殘留的乙酸乙酯，用無水乙醇復溶后過微孔濾膜，樣液供上機測定。

1.3.3 色譜條件

2 結果及分析

2.1 色譜條件優(yōu)化

2.1.1 檢測波長的選擇

在波長200 nm～400 nm對沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、阿魏酸、香豆酸、原兒茶醛對照品溶液進行紫外光譜掃描，各標準品的最強吸收峰出現(xiàn)在240 nm～320 nm，綜合考慮，選取280 nm作為測定波長為宜。

2.1.2 流動相的優(yōu)化選擇

在酚酸的分離中，由于酚羥基和羧基在水溶液中容易發(fā)生電離，極性增強，在固定相表面形成雙重保留，色譜峰拖尾嚴重，如果加入酸性調節(jié)劑，可使酚酸的電離受到抑制，以中性分子的形態(tài)存在，極性減弱，有利于增強在固定相上的保留，使分離效果和峰形得到改善。試驗采用不同配比的乙腈-水、甲醇-水為流動相，流動相的pH值通過不同的酸來調節(jié)。試驗結果表明：選用甲醇-0.1%甲酸水溶液和80%甲醇-0.1%甲酸水溶液作流動相，分析時間長，分離效果不理想。采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作為流動相，乙腈的體積分數(shù)由5%變化到30%的梯度條件下分離效果最佳，9種酚酸在46 min內(nèi)可完全分離。

2.1.3 流速對分離度的影響

本研究設計了0.8、1.0、1.2mL/min3個流速，通過優(yōu)化出峰時間、分析時間和分離度，發(fā)現(xiàn)3個流速均能滿足9種酚酸同時分析，出峰效果均較好?？紤]到樣品中雜質會干擾目標峰的確定，試驗最終確定流速為1.0 mL/min。

2.1.4 溫度對分離度的影響

試驗設定30、35、40℃3個柱溫進行試驗，通過優(yōu)化出峰時間、分析時間和分離度，發(fā)現(xiàn)柱溫30℃以上時分離度均能達到要求，試驗最終選擇30℃為分析溫度。

2.1.5 酚酸的色譜保留行為

在最優(yōu)的色譜分離條件下對沒食子酸、香豆酸、原兒茶醛、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、阿魏酸進行分離，結果見圖1。

圖1 9種酚酸化合物標準色譜分離圖Fig.1 The chromatogram of a mixture of nine phenolic acid standards

由圖1可知，9種酚酸化合物在46 min內(nèi)完全分離，出峰先后順序依次為沒食子酸、香豆酸、原兒茶醛、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、阿魏酸，分離效果良好。

2.2 標準品重復性試驗

平行進樣5次，對沒食子酸、香豆酸、原兒茶醛、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、阿魏酸標樣進行重復性測定，考察保留時間、峰面積和峰高的相對標準偏差（relative standard deviations，RSD）的重現(xiàn)性，結果見表1。

由表1可知，不同酚酸的保留時間的RSD均≤1.04%，峰面積的RSD均≤0.91%，峰高的RSD均≤2.71%，試驗條件下9種酚酸標準對照品都具有良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

表1 酚酸標準樣品保留時間、峰面積和峰高的相對標準偏差（n=5）Table 1 RSD of retention time，peak area and peak height of phenolic acid standards（n=5）

2.3 線性關系

配制酚酸的標準溶液在0.1 mg/L～30.0 mg/L，以質量濃度x（mg/L）為橫坐標，以相應的響應峰面積y為縱坐標繪制標準曲線，獲得標準曲線方程，結果見表2。

由表2可知，各酚酸的峰面積與進樣濃度呈良好的線性關系，相關系數(shù)在0.993 7～0.999 1之間，據(jù)此確定在試驗范圍內(nèi)儀器響應信號與進樣量呈良好的線性關系。以3倍信噪比計算方法的檢出限（detection limit，LOD），沒食子酸、香豆酸、原兒茶醛、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、丁香酸、表兒茶素、阿魏酸的LOD值分別為 0.07、0.10、0.10、0.12、0.08、0.09、0.10、0.10、0.10，方法檢出限低，能滿足分析要求。

表2 9種酚酸線性回歸方程及檢出限Table 2 Linear regression equations and detection limit of nine phenolic acids

2.4 方法準確度與精密度試驗

對枸杞樣進行添加回收試驗，準確稱取2.00 g樣品，通過添加不同水平的酚酸標準儲備液，使最終濃度分別為5.0、10.0、20.0 mg/L。分別計算樣品的回收率，對方法的準確度和精密度進行驗證，結果見表3。

表3 9種酚酸回收率和精密度（n=5）Table 3 Recoveries of 9 phenolic acids and precision of the method（n=5）

從表3可以看出，沒食子酸的平均回收率為73.5%～85.1%，相對標準偏差為3.6%～5.8%，香豆酸的平均回收率為80.3%～88.8%，相對標準偏差為3.8%～6.1%，原兒茶醛的平均回收率為77.9%～99.8%，相對標準偏差為4.2%～6.7%，兒茶素的平均回收率為75.7%～81.0%，相對標準偏差為5.0%～7.8%，綠原酸的平均回收率為63.6%～75.9%，相對標準偏差為5.6%～6.9%，咖啡酸的平均回收率為76.2%～92.5%，相對標準偏差為5.2%～7.9%，丁香酸的平均回收率為77.9%～79.4%，相對標準偏差為4.6%～6.3%，表兒茶素的平均回收率為74.4%～84.8%，相對標準偏差為3.6%～6.1%，阿魏酸的平均回收率為70.5%～81.6%，相對標準偏差為2.8%～4.3%。樣品的回收率、精密度均能滿足檢測要求，表明方法的準確度高、精密度好，基本能滿足枸杞中9種酚酸的檢測要求。

2.5 枸杞中酚酸含量

依據(jù)建立的方法，對枸杞樣品中酚酸組分及含量檢測分析，結果見表4。

表4 枸杞中酚酸含量Table 4 Content of phenolic acid contents in Lycium barbarum L．mg/kg

由表4數(shù)據(jù)可知，寧杞1號、5號、7號、9號中沒食子酸、原兒茶醛、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、阿魏酸均被檢出，以沒食子酸和阿魏酸含量較高，其含量分別在 68.2 mg/kg～340.0 mg/kg、94.3 mg/kg～1 086.0 mg/kg，咖啡酸次之，含量在48.0 mg/kg～62.0 mg/kg，原兒茶醛、兒茶素和綠原酸的含量均很低，香豆酸、丁香酸和表兒茶素均未檢出。枸杞樣品及添加回收色譜圖見圖2。

圖2 枸杞樣品及添加回收色譜圖Fig.2 Sample and add recovery chromatography of the Lycium barbarum L．

3 結論

建立了9種酚酸同時分析的高效液相色譜法。通過方法學驗證，兒茶素測定的線性范圍在0.2 mg/L～30.0 mg/L，其余8種酚酸測定的線性范圍在0.1 mg/L～30.0 mg/L，相關系數(shù)大于0.990 0，各酚酸的平均回收率為63.6%～99.8%，RSD小于8%。方法準確度高、精密度好，能滿足枸杞中9種酚酸同時分析的要求。