響應(yīng)面優(yōu)化微波輔助提取白鬼筆多糖及其抗氧化和抗糖化能力

宋笛

（長(zhǎng)春職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物學(xué)院，吉林長(zhǎng)春130033）

白鬼筆（Phallus impudicus）是鬼筆科、鬼筆屬的一種藥用真菌，其主要分布在我國(guó)山西、山東、貴州等地[1-2]。白鬼筆是亞洲和北歐的一種傳統(tǒng)醫(yī)藥，含有多糖、不飽和脂肪酸等生物活性物質(zhì)，具有抗腫瘤、抗氧化和免疫刺激特性等效果[3-7]。目前，在文獻(xiàn)中對(duì)于白鬼筆多糖的報(bào)道比較少，僅見(jiàn)其具有良好的煙草保潤(rùn)效果、免疫調(diào)節(jié)功能和促進(jìn)傷口愈合的特性[8-9]，還未見(jiàn)對(duì)白鬼筆多糖的提取工藝研究及體外抗氧化和抗糖化活性研究。對(duì)于多糖的提取，目前常使用高溫水浴提取、超聲輔助提取、微波輔助提取、高壓輔助提取和酶提取等技術(shù)，高溫水浴提取多糖提取率低，輔助提取方法可以高效提取多糖并且能改善多糖的生物活性，是更優(yōu)異的高效提取方法[10]。微波是一種非離子的電磁輻射，細(xì)胞壁在電磁波作用下容易發(fā)生裂解，使胞內(nèi)物質(zhì)更易被提取出來(lái)[11]。本試驗(yàn)采用微波輔助提取白鬼筆多糖，以抗氧化能力及抗糖化能力為指標(biāo)研究其生物活性，旨在為白鬼筆深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白鬼筆：貴州省都勻市，用清水洗去表面泥土后切片，在50℃烘箱中烘至恒重，粉碎，過(guò)60目篩后儲(chǔ)存在干燥器中。

D-葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、L-抗壞血酸（Vitamin C，VC）、氨基胍、人血清蛋白（human serum protein，HSA）：北京索萊寶科技有限公司；三氯乙酸、無(wú)水乙醇、鐵氰化鉀：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；苯酚：天津市北辰方正試劑廠；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2，2’-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸 [2，2’-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS]：上海阿拉丁生化科技股分有限公司；以上試劑均為分析純。

1.2 儀器

BHS-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋：上海凌科實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；PT-3502C型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：北京普天新橋技術(shù)有限公司；DP-CW-2000型微波萃取儀：北京亞歐德鵬科技有限公司；RE2002真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海越眾儀器設(shè)備有限公司；PH-5型精密便攜式酸度計(jì)：廣州瑞彬科技有限公司；ZKT-50EB型真空干燥箱：南京百夫諾機(jī)械設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 白鬼筆多糖的提取

精確稱取20 g白鬼筆，設(shè)計(jì)特定的提取條件提取白鬼筆多糖，離心取上清液，加入10%三氯乙酸溶液，并用濃鹽酸調(diào)節(jié)上清液pH3.0左右，后于4℃冷藏過(guò)夜，10 000 r/min，離心5 min取上清液。上清液在50℃，0.1 MPa下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至1/10體積后，加入無(wú)水乙醇使上清液中乙醇含量為95%，4℃冷藏過(guò)夜，5 000 r/min離心10 min取沉淀，將沉淀用無(wú)水乙醚、丙酮洗滌去除脂類、色素等物質(zhì)后，于0.1 MPa，45℃真空干燥至恒重，制得白鬼筆多糖。

1.3.2 白鬼筆多糖的提取率

采用苯酚-硫酸法測(cè)定白鬼筆多糖含量[12]，以D-葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品作標(biāo)準(zhǔn)曲線，C/（mg/L）=（A-0.002 4）/4.12（R2=0.999，式中 A 為吸光值；C 為濃度，mg/L），按式（1）計(jì)算白鬼筆多糖的提取率。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.3.1 微波溫度對(duì)白鬼筆多糖提取率的影響

精確稱取20 g白鬼筆，加入700 mL去離子水[料液比 1∶35（g/mL）]，分別在 40、50、60、70、80、90 ℃的溫度下，300 W微波輔助提取10 min。

1.3.3.2 微波時(shí)間對(duì)白鬼筆多糖提取率的影響

精確稱取20 g白鬼筆，加入700 mL去離子水[料液比 1∶35（g/mL）]，在 50 ℃下，300 W 微波輔助提取 5、10、15、20、25、30 min。

1.3.3.3 微波功率對(duì)白鬼筆多糖提取率的影響

精確稱取20 g白鬼筆，加入700 mL去離子水[料液比 1∶35（g/mL）]，在 50 ℃下，分別在 0、100、200、300、400、500 W功率下微波輔助提取10 min。

1.3.3.4 料液比對(duì)白鬼筆多糖提取率的影響

精確稱取 20g 白鬼筆，分別以料液比 1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45（g/mL）加入去離子水，在 50 ℃下，300 W微波輔助提取10 min。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

依據(jù)單因素試驗(yàn)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法，將微波溫度、微波時(shí)間和微波功率設(shè)為自變量，白鬼筆多糖提取率設(shè)為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)因素和水平試驗(yàn)均重復(fù)3次。優(yōu)化試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1。

表1 中心組合試驗(yàn)Box-Behnken方案設(shè)計(jì)的因素及水平編碼Table 1 Independent variables and levels used for central composite rotatable design

1.3.5 白鬼筆多糖抗氧化能力測(cè)定

以鐵還原力、DPPH自由基清除能力和ABTS+自由基清除能力模型來(lái)評(píng)價(jià)白鬼筆多糖抗氧化能力，分別參考文獻(xiàn)[13-15]的方法進(jìn)行測(cè)定，以同等質(zhì)量濃度的VC溶液作為對(duì)照品。

1.3.6 白鬼筆多糖抗糖化能力測(cè)定

參考Gutierrez等[16]的方法來(lái)評(píng)價(jià)白鬼筆多糖抗糖化能力，以同等質(zhì)量濃度的氨基胍溶液作為對(duì)照品，采用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定晚期糖基化終產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）含量。按照公式（2）計(jì)算AGEs抑制率。

式中：F0為陰性對(duì)照組的熒光值；F為樣品組和對(duì)照組的熒光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)處理與分析均采用SPSS 22.0進(jìn)行，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。響應(yīng)面優(yōu)化采用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 微波溫度對(duì)白鬼筆多糖提取率的影響微波溫度對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 微波溫度對(duì)多糖提取率的影響Fig.1 Effect of microwave temperature on extraction rate of polysaccharides

由圖1可知，白鬼筆多糖提取率隨著微波溫度的升高呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)微波溫度70℃時(shí)，多糖提取率最大，可能是由于溫度的升高使得溶液的黏度與表面張力降低，加速傳質(zhì)過(guò)程，使多糖更易溶出。但微波溫度超70℃時(shí)，多糖提取率反而下降，可能是由于過(guò)高的微波溫度造成了多糖的降解，因此導(dǎo)致白鬼筆多糖提取率降低[17-18]。因而響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的微波溫度選擇60、70、80℃。

2.1.2 微波時(shí)間對(duì)白鬼筆多糖提取率的影響

微波時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 微波時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響Fig.2 Effect of microwave time on extraction rate of polysaccharides

由圖2可知，隨著微波時(shí)間的升高，白鬼筆多糖提取率呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)微波時(shí)間達(dá)到10 min時(shí)，多糖提取率最大。微波輻射能有效地促進(jìn)白鬼筆多糖溶解，5 min～10 min期間提取率增大，但微波時(shí)間越長(zhǎng)（10 min以上），增加了白鬼筆多糖提取液的熱量的積累，引發(fā)多糖降解從而導(dǎo)致提取率降低[19]。因而響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的微波時(shí)間選擇5、10、15 min。

2.1.3 微波功率對(duì)白鬼筆多糖提取率的影響

微波功率對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 微波功率對(duì)多糖提取率的影響Fig.3 Effect of microwave power on extraction rate of polysaccharide

由圖3可知，隨著微波功率升高，白鬼筆多糖提取率先增大后減小，當(dāng)微波功率達(dá)到300 W時(shí)，多糖提取率最大。當(dāng)微波功率超過(guò)300 W時(shí)，多糖提取率開始下降，可能是由于高功率造成了多糖的降解[19]。因而響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)的微波功率選擇200、300、400 W。

2.1.4 料液比對(duì)白鬼筆多糖提取率的影響

料液比對(duì)多糖提取率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 料液比對(duì)多糖提取率的影響Fig.4 Effect of material-to-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides

由圖4可知，白鬼筆多糖提取率隨著溶劑體積的增大呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為1∶30（g/mL）時(shí)，多糖提取率達(dá)到最大。當(dāng)溶劑體積繼續(xù)增大，多糖提取率呈下降趨勢(shì)，可能是由于溶劑體積過(guò)高，造成白鬼筆基質(zhì)中非多糖類雜質(zhì)過(guò)多溶出，并且微波能量被溶劑大量地吸收，從而導(dǎo)致多糖提取率降低[20]。大量溶劑的使用也會(huì)造成后期溶劑回收或濃縮時(shí)所需的熱量過(guò)高，從而導(dǎo)致成本增加，因此料液比最優(yōu)水平為1∶30（g/mL），該因素后續(xù)不再進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Box-Behnken design and experiment results

利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合分析，得到多糖提取率對(duì)自變量的方程為：Y=9.14-0.25A+0.054B-0.26C+0.24AB+0.043AC-0.16BC-0.35A2-0.38B2-0.63C2。方差分析結(jié)果如表3所示。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

該回歸方程模型P＜0.000 1極顯著，失擬項(xiàng)P=0.978 2＞0.05不顯著，R2=0.994 2，CV=0.68%，表明白鬼筆多糖提取率回歸方程模型十分可靠，實(shí)際值與理論值之間高度擬合。因此該回歸方程可以用來(lái)分析和預(yù)測(cè)白鬼筆多糖提取工藝。在影響因素中，微波功率和微波溫度對(duì)多糖提取率的影響極顯著（P＜0.01），微波時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響顯著（P＜0.05），各因素對(duì)多糖提取率的影響力排序?yàn)槲⒉üβ剩疚⒉囟龋疚⒉〞r(shí)間。

2.2.2 各因素之間的交互作用

微波溫度、微波功率、微波時(shí)間三者之間交互作用可依據(jù)響應(yīng)曲面的陡度及等高線的形狀來(lái)判定影響是否顯著，結(jié)果如圖5～圖7所示。

圖5 微波溫度和微波時(shí)間對(duì)多糖提取率的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface and contour plot of the effect of microwave temperature and microwave time on extraction rate of polysaccharides

圖6 微波時(shí)間和微波功率對(duì)多糖提取率的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface and contour plot of the effect of microwave power and microwave time on extraction rate of polysaccharides

圖7 微波溫度和微波功率對(duì)多糖提取率的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface and contour plot of the effect of microwave temperature and microwave power on extraction rate of polysaccharides

由圖5～圖7可知，微波溫度和微波時(shí)間、微波時(shí)間和微波功率的等高線的形狀為橢圓形且等高線曲面的陡度更高，此現(xiàn)象說(shuō)明了微波溫度和微波時(shí)間、微波時(shí)間和微波功率之間交互作用顯著，與方差分析結(jié)果一致。

2.2.3 響應(yīng)面模型驗(yàn)證

由回歸擬合方程可以得到白鬼筆多糖最佳提取工藝參數(shù)為微波溫度66.52℃，微波時(shí)間10.03 min，微波功率279.09 W，在此條件下白鬼筆多糖提取率為9.21%。為了驗(yàn)證工藝參數(shù)的可靠性，結(jié)合實(shí)際操作的方便性，將工藝參數(shù)調(diào)整為微波溫度65℃，微波時(shí)間10 min，微波功率 280 W，并在固定料液比 1∶30（g/mL）的條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，測(cè)得白鬼筆多糖提取率為9.03%，與該模型預(yù)測(cè)的理論值9.21%的相對(duì)誤差小于2%，說(shuō)明由此回歸擬合方程得到最佳工藝參數(shù)具有高度的可靠性。

2.3 白鬼筆多糖抗氧化能力測(cè)定

由于鐵還原力可以直接反映總抗氧化能力的大小，抗氧化活性物質(zhì)可使得DPPH溶液和ABTS溶液發(fā)生褪色反應(yīng)，因此采用這3種方法評(píng)價(jià)白鬼筆多糖抗氧化能力[21-23]。其抗氧化能力結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 多糖及VC的抗氧化能力Table 4 Comparison of antioxidation ability of polyasccharides and vitamin C

由表4可知，1 g/L白鬼筆多糖溶液的3種抗氧化能力雖然均不及同等質(zhì)量濃度的VC，但白鬼筆多糖對(duì)ABTS+自由基清除率為86.21%，說(shuō)明其具有較強(qiáng)的抗氧化能力。根據(jù)3種抗氧化能力指標(biāo)的IC50值，可發(fā)現(xiàn)白鬼筆多糖具有較好的抗氧化能力。

2.4 白鬼筆多糖抗糖化能力測(cè)定

還原糖的羰基和自由氨基可生成AGEs，其會(huì)誘發(fā)糖尿病等疾病，具有較強(qiáng)生理毒性[24]。多糖和氨基胍的AGEs抑制率見(jiàn)圖8。

圖8 多糖和氨基胍的AGEs抑制率Fig.8 Inhibition rate of AGEs of polysaccharides and aminoguanidine

由圖8可知，相同濃度下白鬼筆多糖的抗糖化能力均高于氨基胍。白鬼筆多糖濃度達(dá)到0.2 g/L時(shí)，AGEs抑制率達(dá)到最大，為83.23%，表明白鬼筆多糖具有較強(qiáng)的抗糖化能力。AGEs抑制率與濃度在一定范圍內(nèi)呈線性相關(guān)。白鬼筆多糖在0.10 g/L～0.15 g/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，方程為Y1=409.14X1+7.16（R2=0.937 9），由此方程可得IC50值為0.105 g/L；氨基胍在0.10 g/L～0.25 g/L呈線性關(guān)系，方程為Y2=256.92X2+9.896（R2=0.979 4），由此方程可得IC50值為0.156 g/L。由白鬼筆多糖及氨基胍的IC50值，可發(fā)現(xiàn)白鬼筆多糖具有較強(qiáng)的抗糖化能力，高于氨基胍。

3 結(jié)論

以白鬼筆為原料，去離子水作為溶媒，通過(guò)單因素試驗(yàn)考察了微波溫度、微波時(shí)間、微波功率和料液比對(duì)白鬼筆多糖微波輔助提取工藝的影響，選擇微波溫度、微波時(shí)間和微波功率3個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，最終得到最佳的白鬼筆多糖微波輔助提取工藝條件：微波溫度65℃，微波時(shí)間10 min，微波功率280 W，料液比 1∶30（g/mL），在此條件下白鬼筆多糖最高提取率為9.03%。采用了3種體外抗氧化模型和體外模擬人體環(huán)境生成的AGEs抑制率來(lái)評(píng)價(jià)白鬼筆多糖的抗氧化能力和抗糖化能力。結(jié)果表明白鬼筆多糖具有較強(qiáng)的抗氧化活性和抗糖化活性。本試驗(yàn)為白鬼筆多糖提取工藝及抗氧化活性和抗糖化活性研究奠定了基礎(chǔ)，表明白鬼筆多糖是一種天然食源性抗氧化劑和抗糖化劑。