金線蓮多糖純化工藝及其抗氧化活性研究

趙丹潔，唐鵬，田冬梅，付禮亞，劉鑫，鐘小燕，黃毅嵐*

（1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川瀘州646000；2.成都市雙流區(qū)第一人民醫(yī)院藥劑科，四川成都610000；3.成都大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科，四川成都610000；4.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院藥學(xué)部，四川瀘州646000）

植物多糖是自然界廣泛存在的一類天然有機大分子物質(zhì)，也是機體的主要能量物質(zhì)，具有較為重要的生物學(xué)功能，因其獨特功效和低副作用而成為研究熱點之一[1]。傳統(tǒng)中藥金線蓮用于治療高血壓、糖尿病、心臟病、肺炎、急慢性肝炎、腎炎等疾病[2]。而多糖是金線蓮的主要成分，研究顯示，金線蓮多糖（Anoectochilus roxburghii polysaccharides，ARPs）具有抗氧化[3-4]、提高免疫力[5-7]、調(diào)脂保肝[8-9]、降血糖[10-12]及抗腫瘤[13-15]等多種療效，在醫(yī)藥保健品、化妝品、食品等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。因此，金線蓮多糖潛在的保健功能受到越來越多學(xué)者關(guān)注。

目前對金線蓮多糖的研究主要在提取工藝方面，而純化方面的研究較少。已報道的純化方法有高效逆流色譜法（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）[16-17]、超濾純化法[18]和葡聚糖凝膠 G-100 柱層析法[19]等。這些方法效果雖好，但操作繁瑣困難、成本較高，會使多糖損失較多，所以目前還未實現(xiàn)金線蓮多糖的大規(guī)模純化生產(chǎn)。大孔樹脂是一種具有多孔微球立體結(jié)構(gòu)的常見吸附材料，具有選擇性好、吸附速度快、洗脫條件溫和、干擾因素少、使用周期長、處理量大、穩(wěn)定性高、可重復(fù)利用和節(jié)省費用等特點，被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的分離與純化[20]。一般情況下，物質(zhì)的種類、大小及表面電性以及大孔樹脂理化性質(zhì)的差異會造成其吸附能力的不同。研究表示X-5、AB-8、HPD-400、D101等不同極性大孔樹脂對多糖的分離純化具有良好效果[20-23]，如陳琛等[23]采用D101大孔樹脂優(yōu)化天麻多糖純化工藝，使其多糖含量提高到65.7%。采用大孔樹脂純化金線蓮粗多糖的工藝研究還未見相關(guān)報道。本研究從8種不同極性大孔樹脂中篩選出最優(yōu)大孔樹脂，用其富集純化金線蓮粗多糖，探究最佳純化工藝，并考察純化前后金線蓮多糖的抗氧化活性，以期為金線蓮多糖的開發(fā)利用提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金線蓮全草：四川天植中藥股份有限公司，產(chǎn)地福建；HPD-600、NKA-9、DM130、ADS-17、HPD-400、AB-8、D101、X-5大孔樹脂（純凈級）：滄州寶恩吸附材料有限公司；無水乙醇、苯酚、濃硫酸（分析純）：北京化工廠有限責(zé)任公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品：成都曼斯特生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EYELAN-1300V-W旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、FDU-2110冷凍干燥機：上海愛朗儀器有限公司；A560紫外分光光度計：翱藝儀器上海有限公司；ROTOFIX 32A型離心機：德國Hettich；Φ1.5 cm×30 cm層析柱：無錫華盛色譜科技有限公司；SY-88B型水浴恒溫振蕩器：常州國宇儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 金線蓮預(yù)處理

粉碎金線蓮全草，過60目篩，于50℃烘干。稱取30 g，加入ddH2O1500mL，于70℃水浴提取3h，抽濾、取濾渣繼續(xù)加水提取，重復(fù)3次，合并各次濾液，過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至100 mL，加入無水乙醇400 mL，4℃放置過夜，3 000 r/min離心20 min得多糖沉淀，用水復(fù)溶為一定體積后，冷凍干燥后得粗多糖[19]。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用苯酚-硫酸[23-26]法測定多糖含量，準(zhǔn)確配制1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精確移取1 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液 0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 mL于8個10 mL容量瓶中，dd H2O定容。再加入濃度為5%的苯酚1mL，混合均勻后迅速加入濃硫酸5 mL，搖勻后置沸水浴中15 min，冷卻至室溫（20℃），在490 nm下測吸光度[27]，以葡萄糖濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

樣品多糖含量計算公式如式（1）所示。

式中：Y為多糖含量，%；W為金線蓮粉末的質(zhì)量，g；C為待測液多糖濃度，μg/mL；V0為反應(yīng)體系總體積，mL；V1為多糖溶液的體積，mL；V2為顯色步驟中所加多糖樣液的體積，mL。

1.3.3 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用考馬斯亮藍(lán)染色法[28]測定多糖中蛋白質(zhì)含量，取牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)確配制濃度為1mg/mL的牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別取 0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12 mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液依次加入試管中，分別加入dd H2O補足至1 mL，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)試劑，充分混合后靜置15 min，待蛋白被充分染色后，于595 nm波長下用紫外可見分光光度計測量吸光度。用dd H2O作為空白對照，并以595 nm處的吸光度為縱坐標(biāo)，以牛血清白蛋白濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測定純化前后樣品蛋白含量。計算蛋白去除率，計算公式如式（2）所示。

式中：P2為蛋白去除率，%；Ce為純化后樣品溶液中的蛋白濃度，μg/mL；C0為純化前樣品溶液中的蛋白濃度，μg/mL。

1.3.4 色素含量測定

因色素成分復(fù)雜，種類難以確定，使得含量測定較為困難，故采用全波長掃描法，在200 nm～800 nm波長范圍內(nèi)[20，29]掃描多糖溶液測定吸光度。選取最大吸收峰處波長λ0為檢測波長，測此波長下吸光度，作為多糖溶液中色素的檢測值，平行測定3次。計算樣品多糖色素去除率，計算公式如式（3）所示。

式中：P3為色素去除率，%；Ae為純化后樣品溶液在λ0下的吸光度；A0為純化前樣品溶液在λ0下的吸光度。

1.3.5 大孔樹脂篩選

選取8種大孔樹脂，通過對多糖吸附率、解吸率、蛋白去除率、色素去除率等方面的比較，篩選最優(yōu)大孔樹脂；測定吸附率、解吸率計算公式如式（4）、（5）所示。

式中：R1為吸附率，%；R2為解吸率，%；C0為吸附前母液多糖濃度，mg/mL；C1為流出液多糖濃度，mg/mL；V0為上樣液體積，mL；V1為流出液體積，mL；C2為解吸液多糖濃度，mg/mL。

1.3.6 動態(tài)單因素試驗

采用單因素試驗，篩選出金線蓮多糖最佳純化工藝，并進(jìn)行驗證。

1.3.6.1 上樣濃度對多糖動態(tài)吸附的影響

選取最優(yōu)大孔樹脂5份（10 cm3）裝入柱中，用適量dd H2O沖洗至柱中無氣泡，分別加入20 mL濃度為1、2、3、4、5 mg/mL 的樣品溶液，以 2 BV/h 的流速上樣。收集流出液，測定流出液中多糖的含量，計算吸附率。

1.3.6.2 上樣流速對多糖動態(tài)吸附的影響

選取最優(yōu)大孔樹脂5份（10 cm3）裝入柱中，沖洗后，分別加入20 mL濃度為4 mg/mL樣品溶液，以1、2、3、4、5 BV/h的上樣流速通過層析柱，收集流出液，測定流出液中多糖的含量，計算吸附率。

1.3.6.3 上樣體積對多糖動態(tài)吸附的影響

選取最優(yōu)大孔樹脂1份（10 cm3）裝入柱中，沖洗后，加入4 mg/mL的樣品溶液，以2 BV/h的流速上樣，總上樣量為10 BV（100 mL），并分別在上樣體積為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 BV 時測每個相應(yīng)柱體積流出液中多糖的含量，計算吸附率。

1.3.6.4 洗脫劑濃度對多糖解吸率的影響

選取最優(yōu)大孔樹脂5份（10 cm3）裝入柱中，沖洗后，分別加入4 mg/mL的樣品溶液40 mL，以2 BV/h通過層析柱，分別加入40 mL dd H2O及濃度為20%、40%、60%、80%的乙醇溶液，以2 BV/h進(jìn)行洗脫，收集洗脫液，測定每瓶洗脫液中多糖的含量，計算解吸率。

1.3.6.5 洗脫速度對多糖解吸率的影響

選取最優(yōu)大孔樹脂5份（10 cm3）裝入柱中，沖洗后，分別加入4 mg/mL的樣品溶液40 mL，以2 BV/h通過層析柱，吸附完全后，少量蒸餾水洗滌，再用40%乙醇溶液分別以 1、2、3、4、5 BV/h 的流速進(jìn)行洗脫，并測定流出液中多糖的含量，計算解吸率。

1.3.6.6 洗脫體積對多糖解吸率的影響

選取最優(yōu)大孔樹脂5份（10 cm3）裝入柱中，沖洗后，分別加入4 mg/mL的樣品溶液40 mL，以2 BV/h通過層析柱，吸附完全后，用40%乙醇溶液以2BV/h的速度進(jìn)行洗脫，前5BV（50mL）流出液每隔5mL檢測一次多糖含量，后5 BV每隔10 mL檢測一次，計算解吸率。

1.3.6.7 驗證性試驗

在上述單因素試驗最佳條件下，以金線蓮多糖的回收率、蛋白去除率和色素去除率為考察指標(biāo)，進(jìn)行3次平行試驗。計算平均值和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值。

1.3.7 金線蓮多糖純度的測定

將純化后的金線蓮多糖溶液冷凍干燥后，測定金線蓮多糖含量，計算公式如式（6）所示。

式中：M為多糖含量，%；Ce為洗脫液的多糖濃度，mg/mL；Ve為洗脫液的體積，mL；Qe為洗脫液干燥后的多糖質(zhì)量，g。

1.3.8 抗氧化活性研究

根據(jù)馬黃璜等[30]，唐楠楠等[31]的方法，分別配制濃度為 0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mg/mL 樣品溶液，以VC作為對照組，分別在517 nm和510 nm波長處測定其吸光度，分析純化前后金線蓮多糖對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH·）和羥基自由基（·OH）的清除作用來探究其抗氧化活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

各理化指標(biāo)測定3次，求取平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。使用Origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理和繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

如圖1所示，曲線的回歸方程：y=1.38x，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4，在0～0.7 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，適用于多糖含量的測定。

2.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

如圖2所示，曲線的回歸方程：y=5.38x+0.561，R2=0.999 5，在0.02 mg/mL～0.12 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，適用于多糖中蛋白質(zhì)含量測定。

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of protein

2.3 色素檢測波長的確定

金線蓮多糖色素檢測全波長掃描見圖3。

圖3 金線蓮多糖色素檢測全波長掃描圖Fig.3 Full-wavelength scanning image of polysaccharide pigment detection of ARPs

由圖3可知，多糖所含色素在415 nm處有最大吸收波長，且周圍圓滑對稱，故選用415 nm為檢測波長，用來測定多糖中色素含量。

2.4 大孔樹脂的篩選

大孔樹脂的篩選結(jié)果見圖4。

圖4 不同類型樹脂處理后的多糖吸附率、多糖解吸率、色素去除率和蛋白去除率Fig.4 Polysaccharides adsorption rate，polysaccharides desorption rate，pigment removal rate and protein removal rate after treatment with different types of resin

由圖4可知，HPD-400的多糖解吸率高達(dá)99%，但吸附率太低，使樹脂用量增加導(dǎo)致成本升高。大孔樹脂X-5的多糖吸附率最高，解吸率也高于90%。因此，根據(jù)各項指標(biāo)結(jié)果，選擇X-5大孔樹脂為純化多糖的最佳樹脂。

2.5 大孔樹脂動態(tài)吸附多糖單因素的影響結(jié)果

2.5.1 上樣濃度對多糖動態(tài)吸附的影響

上樣濃度對多糖動態(tài)吸附影響見圖5。

圖5 上樣濃度對多糖動態(tài)吸附的影響Fig.5 Effect of loading concentration on dynamic adsorption of resin

由圖5可知，上樣濃度對多糖吸附率影響較大，吸附率隨上樣濃度增大呈先升高后下降的趨勢，上樣濃度為4 mg/mL時吸附率最高，為74.02%；之后吸附率下降，可能是由于多糖中雜質(zhì)增多，與多糖競爭吸附多糖位點。故最佳上樣濃度為4 mg/mL。

2.5.2 上樣流速對多糖動態(tài)吸附的影響

上樣流速對多糖動態(tài)吸附影響見圖6。

圖6 上樣流速對多糖動態(tài)吸附的影響Fig.6 Effect of loading velocity on dynamic adsorption of resin

由圖6可知，上樣流速對多糖吸附率的影響較大，上樣流速越大，多糖的吸附率越小。上樣流速過快，多糖未被充分吸附就流出層析柱，使吸附率減少；而流速較慢時，多糖可被充分吸附，使吸附率增加，但導(dǎo)致時間成本增加。由圖6可知，2 BV/h的吸附率與1BV/h相差不大，都在80%以上，故上樣流速為2 BV/h較適宜。

2.5.3 上樣體積對多糖動態(tài)吸附的影響

上樣體積對多糖動態(tài)吸附見圖7。

圖7 上樣體積對多糖動態(tài)吸附的影響Fig.7 Effect of loading volume on dynamic adsorption of resin

由圖7可知，隨著上樣體積增大，每個相應(yīng)柱體積的多糖吸附率逐漸降低并趨于平穩(wěn)，上樣量為1 BV時，吸附率最高，但樹脂對多糖的吸附量較少（僅32mg）；上樣量為4BV時，樹脂對多糖的吸附量較高（110.76mg）；上樣量大于4 BV時，雖然樹脂會增加多糖的吸附量但其吸附率較低且趨于穩(wěn)定，會使多糖損失量增加，由于原藥材價格較高，從整個吸附量和成本考慮，上樣量為4 BV時較為合適。

2.5.4 洗脫劑濃度對多糖解吸率的影響

洗脫劑濃度對多糖解吸率影響見圖8。

圖8 洗脫劑濃度對多糖解吸率的影響Fig.8 Effect of ethanol concentration on dynamic desorption of resin

由圖8可知，解吸的多糖主要集中在20%、40%、60%乙醇溶液中，且隨著乙醇濃度的升高，解吸率出現(xiàn)先升高后下降的趨勢，可能是由于高濃度乙醇會減弱多糖與樹脂之間的作用力。當(dāng)乙醇溶液為40%時，解吸率最大，為77.89%，故最佳洗脫劑濃度為40%乙醇溶液。

2.5.5 洗脫劑流速對多糖解吸率的影響

洗脫劑流速對多糖解吸率影響見圖9。

圖9 洗脫劑流速對多糖解吸率的影響Fig.9 Effect of elution velocity on dynamic desorption of resin

由圖9可知，洗脫流速與多糖解吸率成反比，洗脫流速過快，導(dǎo)致洗脫液不能充分接觸樹脂使解吸率降低。在1 BV/h和2 BV/h洗脫流速下，兩者解吸率在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異，考慮到流速過慢會延長純化周期而增加成本；故洗脫流速為2 BV/h較適宜。

2.5.6 洗脫體積對多糖解吸率的影響

洗脫體積對解吸率影響見圖10。

圖10 洗脫體積對解吸率的影響Fig.10 Effect of elution dose on dynamic desorption of resin

圖10所示，隨洗脫體積增加，多糖解吸率逐漸增加并趨于平穩(wěn)；解吸的多糖主要集中在前5 BV（50 mL）的洗脫液中，5 BV時解吸率達(dá)到91.17%，多糖基本被完全洗脫下來；當(dāng)洗脫體積大于5 BV時，與前5 BV的解吸率在統(tǒng)計學(xué)上無顯著性差異（P＞0.05），且會造成溶劑浪費并增加洗脫時間，故洗脫體積為5 BV較適宜。

2.6 驗證性試驗

按照上述最佳條件純化后，多糖回收率分別為66.05%、67.25%、65.24%，平均值為66.18%，RSD值為1.53%；蛋白去除率分別為71.01%、68.72%、69.43%，平均值為69.72%，RSD值為1.68%；色素去除率分別為57.41%，54.68%和56.41%，平均值為56.16%，RSD值為2.45%；表明重復(fù)性較好。

2.7 金線蓮多糖含量的測定

經(jīng)X-5大孔樹脂純化后，金線蓮多糖含量由27.88%提高到76.07%。

2.8 抗氧化活性研究

2.8.1 純化前后金線蓮多糖對DPPH·清除能力的影響

金線蓮多糖對DPPH·清除率影響見圖11。

圖11 金線蓮多糖對DPPH·清除率的影響Fig.11 Polysaccharides from Anoectochilus roxburghii for scavenging effect of DPPH·

由圖11所示，純化前后的多糖對DPPH·有不同的清除能力，在質(zhì)量濃度0.05 mg/mL～0.6 mg/mL范圍內(nèi)，多糖和VC隨質(zhì)量濃度的增加，對DPPH·清除能力先增強后趨于穩(wěn)定。其中，純化后多糖對DPPH·清除率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于純化前，略低于VC；當(dāng)純化后多糖質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL時，純化后多糖對DPPH·清除率為86.24%，基本趨于穩(wěn)定。

2.8.2 純化前后金線蓮多糖對·OH清除能力的影響

金線蓮多糖對·OH清除率影響見圖12。

圖12 金線蓮多糖對·OH清除率的影響Fig.12 Polysaccharides from Anoectochilus roxburghii for scavenging effect of·OH

由圖12所示，VC對·OH清除能力最強，且隨濃度上升清除能力變化較小，多糖在質(zhì)量濃度0.05 mg/mL～0.6 mg/mL范圍內(nèi)隨濃度增加，對·OH的清除能力逐漸增強；當(dāng)多糖的質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL，純化后多糖對·OH清除率為88.63%，遠(yuǎn)高于純化前，略低于VC，純化后效果明顯。

3 結(jié)論

本研究利用大孔樹脂對色素、蛋白質(zhì)、多糖吸附的差異，再通過洗脫達(dá)到純化多糖的目的；通過靜態(tài)吸附-解吸試驗得出X-5為分離純化金線蓮多糖的最佳大孔樹脂；純化后金線蓮多糖顏色由深褐色變?yōu)闇\棕色，粉末也更加均勻，含量從27.88%提高到76.07%。此外，抗氧化活性結(jié)果還表明，金線蓮多糖對DPPH·和·OH有一定的清除能力，雖不及VC，但純化后的金線蓮多糖清除能力顯著增加：當(dāng)濃度為0.6 mg/mL時，對DPPH·的清除率從57.27%提高至86.24%，對·OH的清除率從60.12%提高至88.63%，抗氧化活性明顯提高。

經(jīng)大孔樹脂純化后，金線蓮多糖的含量雖有較大提高，但仍是總多糖，還需進(jìn)一步探究在提高金線蓮多糖含量的基礎(chǔ)上如何分離出具有明確結(jié)構(gòu)的單成分多糖。