陳香型鐵觀音陳化過程中特征有機酸變化分析

莫潤明，林海燕，陳金發(fā)，秦丹，3，陳成聰，張志旭，6*

（1.湖南農業(yè)大學食品科技學院，湖南長沙410128；2.湖南農業(yè)大學園藝學院，湖南長沙410128；3.湖南植物功能成分利用協同創(chuàng)新中心，湖南長沙410128；4.國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南長沙410128；5.國家茶葉質量安全工程技術研究中心，福建泉州362000；6.國家中醫(yī)藥管理局亞健康干預技術實驗室，湖南長沙410128）

陳香型鐵觀音是成品茶經過5年以上陳化，具有陳香特征的鐵觀音[1]，近年來由于陳香型鐵觀音獨特的風味，越來越多的消費者關注陳香型鐵觀音，掀起了一股陳香型鐵觀音的收藏熱潮[2-3]。鐵觀音制成茶后，再經過高溫烘焙和長時間自然陳化，茶質由青澀轉甘醇，酸味由強烈轉柔和。陳化后的鐵觀音梅酸香濃，陳香細膩，是區(qū)別于其他陳茶的特征之一[2，4-6]。

有機酸作為茶葉酸味產生的物質基礎，一般僅占茶葉干重3%。但它與其他滋味物質存在互作關系，同時又作為一些水解和氧化反應過程中碳氫化合物分解的中間產物，影響茶的風味品質[7-8]。目前對鐵觀音陳化中有機酸的研究僅集中在沒食子酸（gallic acid，GA）的積累上。沒有進一步探究其他有機酸的變化規(guī)律，故本文選取當年新制茶和存放 6、9、13、18、25、30年的陳茶，利用高效液相色譜法測定其中常見的10種有機酸含量，分析其在陳化過程中的變化規(guī)律。同時計算各有機酸的滋味活力值（taste activity value，TAV），考察各酸的酸味貢獻度。以期為陳香型鐵觀音的年份鑒別和風味品質評價提供參考，為建立陳香型鐵觀音陳化品質監(jiān)控體系提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鐵觀音茶樣選取新制濃香型鐵觀音成品茶（新茶）與自然陳放 6、9、13、18、25、30 年后的濃香型鐵觀音成品茶（陳茶），產地為福建省泉州市安溪縣，7個茶樣均以鐵觀音茶樹新梢為原料，于當年秋季采摘，由福建安溪鐵觀音集團采用同一加工工藝制作。

L-蘋果酸、檸檬酸、DL-酒石酸、琥珀酸、抗壞血酸、富馬酸、乙酸（純度均≥99%）、甲酸、草酸（純度≥98%）、乳酸（純度 89.98%）：Aladdin公司；磷酸（色譜純）：天津市科密歐化學試劑公司；乙腈（色譜純）：德國默克公司；試驗用水均為超純水。

1.2 儀器

Agilent 1260型液相色譜系統(tǒng) [包括四元泵（G1311B）、自動進樣器（G1329B）、柱溫箱（G13416A）和二極陣列管檢測器（G1315D）]：美國Agilent公司；AS系列超純水儀制備儀：深圳市宏森環(huán)?？萍加邢薰荆籏Q-5200B超聲清洗機：昆山美美超聲儀器有限公司。

1.3 茶樣的處理

稱取磨碎過30目篩后的茶樣1 g（精確至0.001 g）于燒杯中，加入50 mL沸水，搖勻，沸水浴浸提45 min，每隔10 min晃動一次。對提取液進行抽濾，冷卻后定容至50 mL，搖勻，0.45 μm濾膜過濾，用于上機測定。試驗重復3次。

1.4 有機酸的檢測方法

參照王麗麗等[9]對茶葉有機酸測定方法。Prevail C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm）。流動相：0.10%磷酸水溶液（A相）和50%乙腈水溶液（B相）。線性洗脫程序為：100%A（0 min）-100%A（12 min）-0%A（17 min）-0%A（25 min）-100%A（30 min）-100%A（35 min）；柱溫40℃；流速1 mL/min；二極管陣列檢測器同時在210 nm和245 nm波長下檢測抗壞血酸，在210 nm波長下檢測其他9種有機酸。

1.5 有機酸標準曲線繪制

分別精密稱取或移取一定量L-蘋果酸、檸檬酸、DL-酒石酸、琥珀酸、抗壞血酸、富馬酸、乙酸、甲酸、草酸、乳酸，用超純水溶解并定容至10個容量瓶中，配制成單標母液，質量濃度分別為 5、2.5、2.5、20、2、0.05、5、10、10、100 mg/mL；各取一定量單標母液，用超純水稀釋成系列濃度梯度的混合標準溶液。按1.4中的檢測方法，根據保留時間定性，分別以混標液中10種有機酸的質量濃度和其峰面積作出標準曲線。

1.6 數據分析

用Excel 2016對數據進行編輯，采用SPSS 26軟件對數據進行方差分析，若方差齊則用邦弗倫尼（Bonferroni）進行組間檢驗，若方差不齊則使用蓋姆斯-豪厄爾（Games-Howell）進行組間檢驗。

2 結果與分析

2.1 有機酸的總體積累特征

試驗采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）對當年新茶（陳化年份記為0年）和陳化年份分別為 6、9、13、18、25、30年的鐵觀音陳茶中的10種有機酸含量進行測定。有機酸混合標準品色譜圖如圖1所示，各有機酸工作曲線回歸方程見表1。

圖1 有機酸混合標準品色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standards of organic acid

表1 有機酸標準品回歸方程Table 1 Regression equation of standards of organic acid

將7個茶樣測得的有機酸峰面積代入各自標準曲線方程，計算其在茶葉中的含量，結果如表2所示。

由表2可知，10種有機酸總量為100.24 mg/g～177.49 mg/g。30年陳化期里，有機酸總量上下波動，先在第6年出現峰值，隨后快速下降，在第25年達到谷值，又小幅上升，但始終比新茶含量高。其中6、30年陳茶的總酸含量分別高出新茶77.2%、30.5%，而25年陳茶僅比新茶高出9.4%。

乳酸（44.6%～54.5%）和琥珀酸（24.8%～37.1%）始終為茶葉主要有機酸，兩者的波動一定程度上決定了總酸含量的變化趨勢。而DL-酒石酸和富馬酸含量極少，兩者之和僅占總酸的0.08%～0.42%，抗壞血酸也始終沒有檢出。

總酸含量所呈現的“先升后降，再逐漸平緩”的趨勢，進一步解釋陳茶陳化中存在pH值下降的現象[6，10]。同時說明陳茶的酸變現象不僅是大量表沒食兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）轉化成沒食子酸（gallic acid，GA），其余有機酸的積累同樣提供了酸味[10-11]。而有文獻[6]提到鐵觀音陳化后期，pH值又開始緩慢上升，從23年～39年，pH值從4.66升至5.29。這與有機酸組分即使在陳化后期仍處于小幅波動的狀態(tài)有關。從表2也可以看出，25年后的陳茶總酸含量又開始小幅增加。蔡怡婷等[6]對不同年份的鐵觀音進行感官評價，發(fā)現陳化期短于13年的茶葉帶有令人不適的強烈酸味，而長于17年的陳茶酸味逐漸轉醇，陳香、果香愈發(fā)明顯。這說明鐵觀音陳化期間有機酸組分的動態(tài)累積對滋味的形成至關重要。所以優(yōu)質鐵觀音老茶的風味并非部分消費者所認為的只是酸味強、陳味重，應是具有合適的酸度，且陳香細膩。

表2 各貯藏年份陳香型鐵觀音中10種有機酸含量Table 2 Comparison of content of 10 organic acids in 7 old Tieguanyin teas mg/g

2.2 有機酸各組分變化特征

陳香型鐵觀音陳化中9種有機酸變化特征見圖2。

圖2 陳香型鐵觀音陳化中9種有機酸變化特征Fig.2 The variation characteristics of each 9 organic acids of old Tieguanyin tea during the aging process

以新茶（第0年）為對照，將檢出的9種酸含量隨年份的變化率特征歸為3組，分別為小幅度變化組（a）、中等幅度變化組（b）、大幅度變化組（c）?？梢钥闯?，a組中4種酸陳化前期變化規(guī)律雖不同（乳酸和草酸前期含量先增后減，甲酸和L-蘋果酸前期含量先減后增），但在第13年后，各酸變化率逐漸趨穩(wěn)，不再出現大幅變化。后期變化的相對平穩(wěn)，使4種酸最終保持在約±50%變化率內，是9種酸中變化相對溫和的4種。b組中3種酸（琥珀酸、檸檬酸、富馬酸）同樣是前期波動較大而后期趨緩，但因前期的變化幅度比a組大，使后期最終保持在約±50%～±100%的變化率（其中富馬酸第13年時，已無法檢出）。不同于前兩組的c組，乙酸和DL-酒石酸在經歷了前期的波動后并沒有趨緩，而是再次大幅度波動。其中乙酸在第9年達到峰值（變化率255.7%），隨后快速下降，25年達到谷值（變化率-84.2%）后又開始回升；DL-酒石酸在前期先升后降，在含量降至無法檢出后，又開始回升并一直保持增長勢頭，在第30年時變化率達到173.2%。

如此看來，9種有機酸在鐵觀音陳化前期（0～13年），其含量都有較大的波動。第6年除L-蘋果酸和甲酸有小幅減少及原本含量就很少的富馬酸大幅下降外，其余有機酸均大幅增加，致使第6年陳茶總酸含量最高；進入第9年，各酸的含量均不同程度地回落。13年后，各酸總體變化趨緩，除了乙酸和DL-酒石酸外，其他7種酸含量不再大幅變化。因而總酸含量的變化曲線表現出先升后降，逐漸平穩(wěn)。但由于乳酸、琥珀酸和乙酸在25年后再次增加，使第30年陳茶的總酸含量小幅攀升。這一方面說明了有機酸在陳化中的動態(tài)累積是鐵觀音“由酸轉醇，越陳越香”的物質基礎。因而只有陳化超過15年甚至20年以上的鐵觀音，待酸度回落，有機酸各組分大體趨穩(wěn)后，才能得到品質上乘的陳茶。同時也可以推斷，陳香型鐵觀音在陳化后期風味品質雖已成形，繼續(xù)延長陳化時間并不會使茶的香型、口感發(fā)生很大轉變。但一些內含物仍處在不斷轉化中，因此在陳化后期里，陳茶仍能在不同階段給品飲者不一樣的風味體驗。

而陳化前，鐵觀音新茶中有機酸總量為100.24 mg/g，大大高于其他茶葉。謝嬌枚[12]分析了黑茶在近一年半陳化中8種有機酸（草酸、酒石酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸）的變化特征，發(fā)現其總酸占茶葉1.7%～2.2%，陳化過程中含量波動變化無明顯規(guī)律。相比之下，陳香型鐵觀音有機酸組分豐度高，濃厚適口的酸味便成為其主要特征。而且不同于黑茶的陳化，鐵觀音陳化中有機酸組分變化特征性更強，具有潛在的變化規(guī)律。

鐵觀音在長期陳化中，除總灰分較為穩(wěn)定外，水浸出物、茶氨酸、茶多酚和游離氨基酸總量均不同程度地下降[13]。故有機酸組分的特征性累積，應與一些大分子物質降解有關。其實質便是微生物參與茶葉陳化，將碳氫化合物代謝生成有機酸及各種小分子物質。陳化中微生物新陳代謝產生有機酸影響茶葉pH值，期間茶葉又通過反復烘烤再陳放維持相對穩(wěn)定的含水量。這些陳化環(huán)境因子的變化又反過來影響微生物的生長發(fā)育及其種群的更迭。因此可以推測陳化前期產酸類微生物處于優(yōu)勢地位，大量生成有機酸；中期產酸類微生物代謝活動受到抑制，有機酸的降解速度大于生成速度，總酸含量下降；后期有機酸生成與降解處于相對平衡，總酸含量變化幅度不大。

2.3 各有機酸的酸味貢獻度

計算鐵觀音陳化中有機酸的滋味活力值，考察各酸對茶湯酸味的貢獻度，結果見表3。

當滋味活力值（TAV=呈味物質濃度/閾值）小于1，則說明可能無法在茶湯中嘗出該物質的滋味。相反，呈味物質的TAV越大，說明其越有可能成為特征風味物質[15]。從表3可以看出，鐵觀音中9種有機酸之間滋味活力值差異較大。各年份中僅乳酸、琥珀酸、甲酸、乙酸和L-蘋果酸的TAV出現大于1的情況，而其中僅有琥珀酸TAV始終大于1，占總酸含量最多的乳酸TAV卻僅在第6年大于1。草酸、DL-酒石酸和富馬酸在各年份中TAV都較小，其中富馬酸TAV相對較低。若僅以TAV考量，9種酸中，琥珀酸在酸味的貢獻度上占據主導。

表3 各貯藏年份陳香型鐵觀音9種有機酸滋味活力值Table 3 The taste activity values of 9 organic acids in each old Tieguanyin teas

一般酸味物質是通過H+刺激味蕾中的酸味感受器，形成傳導電流，最終使大腦發(fā)出“酸”的信號。但感官接收的酸味強弱并不總是和pH值呈正比。酸味劑的陰離子對酸味強度和自身的風味都有重要影響，如大多數有機酸都具有清鮮、爽快的酸味，而當其濃度低到某種程度時，就變成了一種甜美味[16]。而且，無論是酸味還是其他滋味都不是簡單的線性疊加，除了滋味物質因具有多個滋味屬性而具有不同識別閾值外，滋味物質間的交互作用也尤為重要[8]。即茶湯中的酸味可通過與其他滋味（甜、苦、澀、鮮）物質間的互作關系，最終體現為滋味協同、滋味加和、滋味抑制[8]。而當各種滋味物質形成混合物時，即使其濃度比其閾值還要低，它們的閾值也會相互減少為原來閾值的1/n，最終使其敏感度升高[15]。因此，盡管陳茶有機酸組分中只有琥珀酸TAV一直大于1，卻不能認為其他有機酸對滋味貢獻不大。相反，正是不同TAV的各酸在長時間陳化中此消彼長，才形成了鐵觀音陳茶的獨特風味。

毛世紅[8]在研究中用偏最小二乘回歸（partial least squares regression，PLSR）對工夫紅茶中的關鍵滋味組分篩選后發(fā)現：乳酸、乙酸、有機酸總量與5個滋味屬性（甜、酸、苦、鮮、澀）均有一定程度相關性。其中乳酸與5個滋味都呈正相關，而乙酸與苦味、酸味、鮮味呈正相關，與澀味、甜味呈負相關。并且進一步認為有機酸含量變化可能對工夫紅茶整體滋味品質產生巨大影響，因為有機酸一方面通過自身酸味調節(jié)口腔對其他滋味的感知，另一方面又通過影響茶湯體系中的pH值來調控滋味物質之間的交互作用。而呂海鵬等[17]在研究中通過對普洱茶滋味得分與其重要滋味化學物質間的相關性分析后發(fā)現，酒石酸、檸檬酸、有機酸總量均與其滋味得分呈顯著性負相關（P＜0.05）。如此看來，有機酸組分是構成茶葉良好品質的重要一環(huán)，而其對不同茶類的滋味的影響結果也迥然不同。作為陳香型鐵觀音風味形成的關鍵物質，有機酸組分與感官屬性的關聯還待做進一步的研究。

3 結論

國家標準[1]中把陳化5年作為區(qū)別陳香型鐵觀音與其他香型鐵觀音的時間節(jié)點，但僅從本試驗的結果及相關文獻[6]的描述來看，5年恰好處在茶湯酸味較重、陳香未顯的陳化前期。這使得部分消費者形成了酸味強、陳味悶味重才是陳香型鐵觀音的固有印象。優(yōu)質的陳茶應是陳化15年甚至20年以上，其酸度下降轉柔和，且陳香濃厚。而由于目前還缺乏對鐵觀音陳期的統(tǒng)一鑒定標準，導致消費者難以明辨不同年份的鐵觀音，這都不利于陳香型鐵觀音的開發(fā)和推廣。鐵觀音陳化中有機酸組分累積潛在規(guī)律性的揭示，既解釋了陳茶酸度變化的原因，也進一步完善了各年份陳香型鐵觀音化學組分識別體系，為陳茶年份認定提供了一種簡便可行的方法。各酸滋味活力值分析也表明：陳茶酸甘細膩的獨特風味是由于不同滋味活力值的有機酸的非線性疊加效應以及各滋味物質的交互效應的結果。而鐵觀音有機酸組分在陳化中動態(tài)累積生成的機理以及其與感官屬性的聯系還有待進一步探究。