3M MDS沙門氏菌分子檢測(cè)試劑盒的評(píng)價(jià)

林 杰，徐 珊，鄭 晶，柯 璐，陳 彬，張溫玲，曾維楊

(福州海關(guān)技術(shù)中心//福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003)

沙門氏菌是一群形態(tài)、培養(yǎng)、生化反應(yīng)和抗原構(gòu)造相類似的革蘭氏陰性桿菌，迄今已發(fā)現(xiàn)的沙門氏菌有2 000多個(gè)種(或型)，我國發(fā)現(xiàn)200多種菌型。沙門氏菌是食品中常見的主要腸道桿菌，能夠引起急性胃腸炎、傷寒、食源性動(dòng)物敗血癥[1-3]。沙門氏菌感染人的途徑大多直接或間接地與動(dòng)物性食品有關(guān)，沙門氏菌很容易在自然環(huán)境及動(dòng)物體內(nèi)存活和增殖，因此準(zhǔn)確快速地檢測(cè)食品中的沙門氏菌，對(duì)于保護(hù)人畜健康有著十分重要的意義[4-5]。由于商品化試劑盒方法具有簡便快速、靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，可以節(jié)約大量培養(yǎng)基配制和操作時(shí)間，因此近年來得到廣泛應(yīng)用，相關(guān)產(chǎn)品也有不少[6-10]。3M MDS分子檢測(cè)試劑盒采用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)來快速擴(kuò)增，結(jié)合使用生物發(fā)光特性來檢測(cè)擴(kuò)增，實(shí)時(shí)報(bào)告陽性結(jié)果，陰性結(jié)果將在60 min內(nèi)得到。該方法具有高特異性和高敏感性的特點(diǎn)，并且檢測(cè)快速、易于操作。為了更加科學(xué)規(guī)范的使用試劑盒，根據(jù)SN/T 3256—2012《食品微生物檢驗(yàn)方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》[11]和SN/T 2775—2011《商品化食品檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)方法》[12]的要求，對(duì)3M MDS分子檢測(cè)試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià)試驗(yàn)，評(píng)估其在食品中沙門氏菌檢測(cè)的準(zhǔn)確性和適用性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

菌株：腸炎沙門氏菌，ATCC13076；大腸埃希氏菌，ATCC25922，均購自上海漢尼生物技術(shù)有限公司。

試劑：緩沖蛋白胨水，3M MDS沙門氏菌分子檢測(cè)試劑盒，亞硒酸鹽胱氨酸(SC)增菌液，沙門氏菌顯色板，營養(yǎng)瓊脂平板。

1.2 儀器與設(shè)備

KD-TBC-300M電子天平，福建科迪技術(shù)有限公司；Stomacher3500拍擊式均質(zhì)器，英國SEWARD；恒溫培養(yǎng)箱，德國BINDER；3M分子檢測(cè)儀器，美國3M公司；VITEKⅡ微生物鑒定儀，法國梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)菌株及菌懸液的制備

將標(biāo)準(zhǔn)菌株腸炎沙門氏菌(ATCC13076)復(fù)活后，接種于營養(yǎng)瓊脂，36℃培養(yǎng) 18 h 備用。

1.3.2兩種方法對(duì)比靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度

根據(jù)SN/T 3256—2012《食品微生物檢驗(yàn)方法確認(rèn)技術(shù)規(guī)范》和SN/T 2775—2011《商品化食品檢測(cè)試劑盒評(píng)價(jià)方法》的要求，選擇5類15種樣品進(jìn)行試驗(yàn)。每種食品基體需要有3個(gè)樣品(標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)試組分為25 g)，其中一個(gè)未污染、一個(gè)樣品的污染水平為1～9 CFU/25 g、一個(gè)樣品的污染水平為10～99 CFU/25 g。對(duì)于低和高的污染水平，分別進(jìn)行16次平行測(cè)試；未接種的樣品進(jìn)行5平行測(cè)試。添加菌為腸炎沙門氏菌(ATCC13076)。每種樣品同時(shí)按照3M MDS分子檢測(cè)試劑盒方法和GB 4789.4—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌測(cè)定》[13]進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見表1。靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度統(tǒng)計(jì)分析見表2。

1.3.3試劑盒耐變性

耐變性是指對(duì)同一樣品用一個(gè)分析方法，在各種正常檢測(cè)條件下進(jìn)行分析，保證該分析方法的可行性。耐變性評(píng)價(jià)由以下步驟組成：確定可能影響檢測(cè)結(jié)果的因素、對(duì)每一種因素稍作改變、采用合適的方法進(jìn)行耐變性檢驗(yàn)。確定需要評(píng)價(jià)的變量3個(gè)：裂解時(shí)間(13 min,17 min)和裂解體積(18 μl,22 μl),反應(yīng)體積(18 μl,22 μl),每個(gè)變量取兩個(gè)不同的水平。采用純培養(yǎng)的1株目標(biāo)菌(腸炎沙門氏菌，ATCC13076)與1株非目標(biāo)菌(大腸埃希氏菌，ATCC25922)進(jìn)行耐變性實(shí)驗(yàn)。目標(biāo)菌的濃度在1～9 CFU/25 g的水平，非目標(biāo)菌濃度在10～99 CFU/25 g的水平。目標(biāo)菌和非目標(biāo)菌均采用檢測(cè)方法所要求的培養(yǎng)基，采用試劑盒方法進(jìn)行分析。結(jié)果見表3。

1.3.4試劑盒批間變異

為了驗(yàn)證試劑盒的穩(wěn)定性，取3個(gè)不同批號(hào)試劑盒進(jìn)行批間變異實(shí)驗(yàn)，采用純培養(yǎng)的1株目標(biāo)菌(腸炎沙門氏菌，ATCC13076)與1株非目標(biāo)菌(大腸埃希氏菌，ATCC25922)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。目標(biāo)菌的濃度在1～9 CFU/25 g的水平，非目標(biāo)菌濃度在10～99 CFU/25 g的水平。結(jié)果見表4。

1.3.5試劑盒包容性和排他性

包容性是指確定某一檢測(cè)方法從眾多菌中檢測(cè)到目標(biāo)菌的能力。排他性是指某一檢測(cè)方法對(duì)可能引起交叉反應(yīng)的相關(guān)非目標(biāo)菌株的抗干擾能力。包容性：選擇100株沙門氏菌的純化菌株，用3M測(cè)試方法進(jìn)行測(cè)試。排他性：選擇30株非沙門氏菌的純化菌株，用3M測(cè)試方法進(jìn)行測(cè)試。

1.3.6實(shí)驗(yàn)室間協(xié)同試驗(yàn)

選擇牛奶樣品，添加腸炎沙門氏菌(ATCC13076)，制備未接種(L0)、低(L1)、高(L2)三個(gè)接種水平樣品，每一水平8個(gè)平行樣品。同時(shí)用3M測(cè)試方法和參考方法進(jìn)行測(cè)試，7家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同實(shí)驗(yàn)。檢測(cè)結(jié)果見表5，數(shù)據(jù)分析見表6。

2 結(jié)果和分析

2.1 靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度

15個(gè)食品類型的試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 15個(gè)食品類型的試驗(yàn)結(jié)果(+/-)

試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析見表2。

表2 試驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

式中，F(xiàn)P為假陽性的測(cè)試數(shù)；N為未接種樣品L0的總測(cè)試數(shù)。

式中，TP為陽性的測(cè)試數(shù)；N為低濃度(L1)和高濃度(L2)樣品的總測(cè)試數(shù)。

式中，PA為兩種方法相同的陽性測(cè)試數(shù)；NA為兩種方法相同的陰性測(cè)試數(shù)；N為所有樣品的總測(cè)試數(shù)。

該試劑盒用作檢測(cè)沙門氏菌時(shí)，在5個(gè)食品種類，15個(gè)食品類型的樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，該試劑盒相對(duì)靈敏度高、假陰性率低，相對(duì)特異性好假陽性率低，相對(duì)準(zhǔn)確度高。兩種方法標(biāo)準(zhǔn)偏差S為0，說明兩種方法在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著性差異。

2.2 試劑盒耐變性

耐變性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 耐變性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(+/-)

目標(biāo)菌在3變量10平行檢測(cè)均檢出，非目標(biāo)菌在3變量10平行檢測(cè)均未檢出。檢測(cè)結(jié)果表明，其它變量無顯著性差異。

2.3 試劑盒批間變異

批間差異實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 批間差異實(shí)驗(yàn)結(jié)果(+/-)

目標(biāo)菌腸炎沙門氏菌在3批次10平行檢測(cè)均檢出，非目標(biāo)菌大腸埃希氏菌在3批次10平行檢測(cè)均未檢出。檢測(cè)結(jié)果表明，該試劑盒的批間變異無顯著性差異。

2.4 試劑盒包容性和排他性

選擇經(jīng)確認(rèn)的100株沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株以及實(shí)驗(yàn)室自行分離的沙門氏菌菌株，用3M試劑盒檢測(cè)，結(jié)果均為陽性，表明該試劑盒在包容性上表現(xiàn)良好。

選擇經(jīng)確認(rèn)的30株非沙門氏菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，用3M試劑盒進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果均為陰性，表明該試劑盒在排他性上表現(xiàn)良好。

2.5 試劑盒協(xié)同試驗(yàn)

協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析見表5、表6。

表5 協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果(+/-)

表6 協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

7家實(shí)驗(yàn)室對(duì)三個(gè)接種水平樣品的測(cè)試結(jié)果分析表明，試劑盒方法和參考方法檢測(cè)結(jié)果無差異，試劑盒方法穩(wěn)定可靠。

3 結(jié)論

通過5大類15種食品兩種檢測(cè)方法的比對(duì)試驗(yàn)，靈敏度、特異性和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果，以及7家實(shí)驗(yàn)室協(xié)同試驗(yàn)結(jié)果分析均說明3M MDS沙門氏菌分子檢測(cè)試劑盒和國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4—2016在食品檢測(cè)上無顯著性差異。耐變性結(jié)果表明試劑盒在檢測(cè)的裂解時(shí)間和裂解體積及反應(yīng)體積范圍內(nèi)對(duì)檢測(cè)結(jié)果沒有影響；批間變異結(jié)果表明不同批號(hào)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果無顯著差異，說明試劑盒穩(wěn)定性良好。包容性和排他性試驗(yàn)均未出現(xiàn)假陰性和假陽性結(jié)果。綜上所述，3M MDS沙門氏菌分子檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確，產(chǎn)品性能穩(wěn)定，特異性強(qiáng)，相對(duì)GB 4789.4—2016檢測(cè)時(shí)間可縮短48 h，能滿足食品中沙門氏菌的檢測(cè)要求。