不同蘋果砧木實生苗對鹽堿復合脅迫的生理響應

許盼云，李春蘭，宋金迪，王 鑫，程嘉寶，吳玉霞，何天明

(1.新疆農業(yè)大學林學與園藝學院，烏魯木齊 830052；2.新疆農業(yè)大學農學院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】蘋果(MalusdomestacaBorkh.)是世界溫帶落葉果樹最主要的樹種，也是我國北方種植面積最大，產量最高的水果[1-2]。我國西北、華北和東北地區(qū)的鹽堿地分布較多，使得土地利用率降低[3]。新疆作為我國蘋果的主產區(qū)之一，也是我國最大的鹽漬化地區(qū)，有將近1/3的耕地面積受不同程度鹽漬化危害，其中南疆分布面積最大，土壤鹽漬化嚴重[4-6]。土壤鹽堿化已成為影響蘋果生長的主要非生物限制因素[7]。選擇耐鹽堿砧木是減少蘋果生產中受鹽堿化影響，提高果實產量和品種的有效措施[8-10]。【前人研究進展】鹽堿脅迫對植物的危害既包括鹽脅迫引起的滲透效應、離子失衡、營養(yǎng)水分缺乏，導致植物氧化脅迫，也包括堿性鹽的存在引起的高pH脅迫[11]。Shi等[12]研究發(fā)現(xiàn)，高酸堿度或鹽度對向日葵幼苗的脅迫小于鹽度與高酸堿度相結合的脅迫。Jia等[1]研究耐鹽堿能力較強的MalushallianaKoehne.蘋果砧木對鹽、堿和鹽堿脅迫的適應性，發(fā)現(xiàn)該砧木是通過降低葉片含水量、氣孔導度和胞間CO2濃度，提高水分利用效率和積累滲透物質來適應3種脅迫。朱燕芳[13]以NaCl、NaHCO3模擬pH 8.0～8.2鹽堿土，對垂絲海棠和山定子進行脅迫處理，測定其7項生理指標，垂絲海棠較山定子能更好的通過調節(jié)滲透物質、積累有機酸、啟動抗氧化酶系統(tǒng)，以緩解脅迫傷害。在鹽堿復合脅迫下，紫花苜蓿各光合參數(shù)隨脅迫強度的增大而顯著下降[14]?！颈狙芯壳腥朦c】蘋果屬植物在脅迫耐受性方面具有豐富的種間多樣性[15]。目前，關于蘋果砧木單一中性鹽或堿性鹽的研究已有報道，但有關鹽堿復合脅迫蘋果砧木以篩選出適宜當?shù)卦耘嗟难芯枯^少。研究不同蘋果砧木實生苗對鹽堿復合脅迫的生理響應。【擬解決的關鍵問題】以7種4年生蘋果砧木為材料，人工模擬新疆南疆地區(qū)的鹽堿土，采用沙培盆栽澆灌營養(yǎng)液加鹽的方法，研究鹽堿復合脅迫后各蘋果砧木葉片的葉綠素含量、相對電導率、滲透調節(jié)物含量等5項生理指標的變化，采用隸屬函數(shù)法綜合評價蘋果砧木的耐鹽堿能力，篩選出適宜新疆半干旱地區(qū)栽培的品種，為培育優(yōu)良蘋果砧穗組合提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗選用4年生的湖北海棠(M.hupehensis(Pamp.)Rehder)、小金海棠(M.xiaojinensisCheng et Jiang)、八棱海棠(M.robusta)、平邑甜茶(M.hupehensis)、野蘋果(M.sieversiiRoem)、白海棠(M.Chaenomeles)、山定子(M.baccataBorkh)作為研究材料，均種植于塑料花盆(直徑20 cm，深60 cm)，純凈河沙培養(yǎng)，每桶1株。置于新疆農業(yè)大學網室統(tǒng)一管理，定期除草，澆水。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

選擇2種中性鹽NaCl、Na2SO4和2種堿性鹽NaHCO3、Na2CO3，按摩爾比1∶9∶9∶1比例混合，用1/2 Hoagland營養(yǎng)液加鹽澆灌，設計5個濃度梯度鹽堿復合溶液處理：0(對照)、15、30、45、60 mmol/L，對照澆營養(yǎng)液。每處理3次重復，每桶為1次重復。處理濃度按15 mmol/L每天遞增，待全部處理達到設定濃度后，計算脅迫時間。每隔3 d，17:00～18:00時澆灌處理液，每次用量1 000 mL，持續(xù)處理20 d后，測定各生理指標。表1

1.2.2 指標測定

采用乙醇—分光光度計法測定葉綠素含量[16]；電導法測定相對電導率[16]；茚三酮顯色法測定脯氨酸含量[17]；蒽酮比色法測定可溶性總糖含量[17]；考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白含量[17]。

1.3 數(shù)據處理

采用Excel 2016進行數(shù)據整理與繪圖，SPSS 19.0進行差異顯著性分析，結合隸屬函數(shù)法對7個品種的耐鹽堿能力進行綜合評價[18]。

當指標與抗性呈正相關時用公式(1)隸屬函數(shù)計算：

U(Xij)=(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin).

(1)

當指標與抗性呈負相關用公式(2)反隸屬函數(shù)計算：

U(X)=1-(Xij-Xjmin)/(Xjmax-Xjmin).

(2)

公式中，U(Xij)表示i品種j指標的隸屬函數(shù)值，Xij表示i品種j指標的測定值，Xjmax和Xjmin分別表示品種中j指標的最大值和最小值。

2 結果與分析

2.1 鹽堿復合脅迫對不同蘋果砧木葉片葉綠素含量的影響

研究表明，隨著脅迫濃度的增加，7種蘋果砧木葉片葉綠素含量總體呈下降趨勢，且下降幅度不同。湖北海棠和白海棠各處理濃度下的葉綠素含量與前一濃度處理下的相比，均達到顯著性差異水平(P<0.05)。15 mmol/L處理下，各品種葉片的葉綠素含量與對照相比均顯著下降(P<0.05)，除了平邑甜茶、小金海棠和八棱海棠的葉綠素含量增大，并且八棱海棠的葉綠素含量與對照相比顯著增大。與0 mmol/L相比，八棱海棠和平邑甜茶在60 mmol/L下的葉綠素含量下降幅度最小，分別下降了49.4%和56.9%；湖北海棠的下降幅度最大，下降了83.2%。圖1

2.2 鹽堿復合脅迫對不同蘋果砧木葉片相對電導率的影響

研究表明，7種蘋果砧木在鹽堿復合脅迫下相對電導率的變化趨勢相同，即隨著脅迫濃度的增加均呈持續(xù)上升的趨勢。各蘋果砧木葉片的細胞膜透性增加，膜系統(tǒng)受到破壞。湖北海棠和白海棠的相對電導率在脅迫初期(15 mmol/L)顯著增大，小金海棠、野蘋果和山定子的在30 mmol/L處理下顯著增大，平邑甜茶和八棱海棠的在45 mmol/L時顯著增大；八棱海棠、平邑甜茶和小金海棠的膜系統(tǒng)受脅迫的傷害較輕，與對照相比60 mmol/L下的相對電導率增幅較小，分別增加了33%、38.8%和40.4%；湖北海棠的相對電導率上升幅度最大，增加了66.6%，并且鹽濃度在30 mmol/L之后呈不顯著增大(P>0.05)，在此濃度以上的脅迫處理使湖北海棠的細胞膜嚴重被破壞，相對電導率幾乎不再改變。圖2

圖2 不同鹽堿復合脅迫下7個蘋果砧木葉片相對電導率變化Fig.2 Effects of salt-alkali complex stress on relative electrical conductivity of seven apple rootstock leaves

2.3 鹽堿復合脅迫對不同蘋果砧木葉片滲透調節(jié)物質的影響

研究表明，隨著鹽堿復合脅迫鹽濃度的增加，各蘋果砧木葉片脯氨酸含量總體呈增大趨勢，且各蘋果砧木葉片脯氨酸含量的增幅存在差異。湖北海棠和白海棠分別在30和45 mmol/L下脯氨酸含量達到最大，其余品種的脯氨酸含量在60 mmol/L時最大。與0 mmol/L下的脯氨酸含量相比，八棱海棠、平邑甜茶和小金海棠在60 mmol/L處理下脯氨酸積累最多，分別增加了23.58、23.91和16.71 μg/g，這幾個品種通過積累脯氨酸以適應混合鹽堿脅迫的能力最強；山定子、野蘋果和白海棠的脯氨酸積累較少；湖北海棠積累最少，為6.88 μg/g。圖3

圖3 不同鹽堿復合脅迫下7個蘋果砧木葉片脯氨酸含量變化Fig.3 Effects of salt-alkali complex stress on proline content in leaves of seven apple rootstocks

研究中，湖北海棠、小金海棠、山定子和白海棠的可溶性總糖含量隨著脅迫強度的增大呈先增加后減少的變化趨勢，其中除了小金海棠葉片的可溶性總糖含量在45 mmol/L時達到峰值，剩下的均在15 mmol/L時最大；平邑甜茶、八棱海棠、野蘋果的可溶性總糖含量呈波動式變化，最大鹽濃度處理下的可溶性總糖含量均顯著高于對照下的；較0和60 mmol/L處理下的可溶性總糖含量八棱海棠積累的最多(10.95 mg/g)，增加了1.23倍，湖北海棠積累的最少(1.19 mg/g)，增加了1.04倍。圖4

圖4 不同鹽堿復合脅迫下7個蘋果砧木葉片可溶性總糖含量變化Fig.4 Effects of salt-alkali complex stress on total soluble sugar content in leaves of seven apple rootstocks

在整個鹽堿復合脅迫過程中，除了湖北海棠和八棱海棠可溶性蛋白含量呈先升后降趨勢，其余品種葉片可溶性蛋白含量呈波動式變化，總體呈增大的趨勢。其中，八棱海棠和小金海棠葉片中可溶性蛋白含量在45 mmol/L下達到峰值，隨后呈無顯著性下降，且60 mmol/L下的可溶性蛋白含量較對照分別增加了6.70和5.93 mg/g，積累最多；湖北海棠在15 mmol/L時可溶性蛋白含量顯著增大且達到峰值，達到峰值后在45 mmol/L時大幅下降，60 mmol/L下可溶性蛋白含量較對照只增加3.43 mg/g，積累最少。圖5

圖5 不同鹽堿復合脅迫下7個蘋果砧木葉片可溶性蛋白含量變化Fig.5 Effects of salt-alkali complex stress on the soluble protein content in leaves of seven apple rootstocks

2.4 不同蘋果砧木耐鹽堿能力綜合評價

隸屬函數(shù)平均值越大，該品種耐鹽堿性就越強。研究表明，7個蘋果砧木品種的耐鹽堿能力由強到弱依次為八棱海棠>野蘋果>平邑甜茶>小金海棠>山定子>白海棠>湖北海棠。表2

表2 不同蘋果砧木耐鹽堿能力綜合評價Table 2 Comprehensive evaluation of salt-tolerant ability of different apple rootstocks

3 討 論

3.1 葉綠素對鹽堿復合脅迫的響應

葉綠素含量可以反映植物的光合能力，其濃度被用作代表細胞代謝狀態(tài)的敏感指標[19-20]。在鹽脅迫下，由于水分不足、礦物質營養(yǎng)缺乏和能量不足，植物的生理機能會受到干擾[21]。試驗中湖北海棠、野蘋果、山定子、白海棠的葉綠素含量隨脅迫強度的增加始終低于對照，鹽堿復合脅迫破壞了葉綠體結構，細胞中大量的Na+取代了質膜和被細胞內系統(tǒng)結合的Ca2+，與光合作用有關的細胞膜系統(tǒng)和膜結構受到傷害，直接或間接影響葉綠素含量的正常合成[2,22]。此外，造成葉綠素含量降低的原因還可能是由于隨著脅迫強度的增大pH升高導致合成葉綠素必要元素Mg2+的沉淀，導致葉綠素合成受阻，含量減少[23]。在鹽生植物紫穗槐中發(fā)現(xiàn)葉片的Ca2+和Mg2+的濃度隨著鹽度的增加而降低[24]。由于各蘋果砧木的耐鹽堿性能力不同，導致鹽堿復合脅迫對葉綠體的破壞程度也不同。平邑甜茶、小金海棠和八棱海棠在低濃度的鹽堿復合脅迫(15 mmol/L)下，葉綠素含量升高，這與Stepien[25]、劉曉涵[26]、謝陽嬌[27]的研究結果相同，這3種砧木的耐鹽堿能力較強，鹽堿復合脅迫在一定程度上可以促進葉綠素的合成。

3.2 相對電導率對鹽堿復合脅迫的響應

葉片相對電導率是反映植物細胞對細胞內環(huán)境的穩(wěn)定性和對細胞外環(huán)境變化的適應性和抵抗能力，以及反映鹽堿脅迫對植物傷害程度的良好生理指標[21]。葉片相對電導率越高，植物受到的傷害越嚴重。研究表明，7種供試蘋果葉片的相對電導率隨著鹽濃度的增大而顯著增大，鹽堿復合脅迫破壞了7種供試蘋果葉片的細胞膜結構和功能，導致細胞內大量離子和有機物質外滲，造成細胞膜透性逐漸增大，造成相對電導率增大。在15 mmol/L脅迫初期，湖北海棠和白海棠的相對電導率與對照相比顯著增大(P<0.05)，在此濃度下細胞膜已受到嚴重傷害，這2個品種的耐鹽堿能力較弱，并且當鹽濃度達到30 mmol/L時，湖北海棠的相對電導率無顯著性增大，表明30 mmol/L以上的鹽濃度已完全破壞了植物的細胞膜，導致相對電導率幾乎不再改變。

3.3 滲透調節(jié)物質對鹽堿復合脅迫的響應

逆境條件會促進植物細胞積累各種極性的或不帶電荷的相容性溶質或滲透物以應對脅迫環(huán)境，這些物質(脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白)在高濃度下不會影響細胞的生化過程[28-29]。目前,對這些溶質的作用方式的理解為通過持續(xù)的水流入、穩(wěn)定蛋白質和細胞結構以及在鹽脅迫下清除活性氧來提供滲透調節(jié)[30]。脯氨酸作為一種重要的滲透調節(jié)物質，以游離狀態(tài)存在于植物細胞中，在生理酸堿度范圍內具有低分子量、高水溶性和不帶電荷[31]。研究表明，脯氨酸對植物抗鹽脅迫具有保護作用，它作為亞細胞結構的相容滲透壓、酶保護劑、自由基清除劑、細胞氧化還原平衡器、細胞溶質pH緩沖液和穩(wěn)定劑來提高植物的耐鹽性[32-33]?？扇苄蕴侵饕ㄆ咸烟?、蔗糖、海藻糖等，可以穩(wěn)定細胞膜和原生質體[34]，保護可溶性酶免受細胞內高濃度無機離子的影響[35]，并且它們還是碳架和能量的來源[36-37]。研究結果顯示，在整個混合鹽堿脅迫過程中，除湖北海棠和白海棠外各品種的葉片脯氨酸含量隨著鹽濃度的升高而升高；可溶性總糖含量總體呈先升后降趨勢；可溶性蛋白含量隨著脅迫強度的增大呈先升后降和先升后降再上升的變化特點。湖北海棠和白海棠葉片脯氨酸含量分別在30、45 mmol/L處理下達到峰值，隨后含量降低。這是由于鹽堿作用下植物的光合能力受到抑制，碳水化合物減少，從而造成通過碳水化合物氧化磷酸化作用為脯氨酸的合成提供必須的還原力減少，導致脯氨酸含量開始下降[38]。試驗中不同品種蘋果砧木葉片中可溶性糖和可溶性蛋白質含量均比對照有不同程度的增加，增加幅度與品種耐鹽堿能力密切相關。研究結果顯示,八棱海棠葉片的可溶性糖和可溶性蛋白質含量增幅最大，湖北海棠增幅最小，單從滲透調節(jié)物質來分析7個蘋果砧木的耐鹽堿能力，其中八棱海棠耐鹽堿能力最強，湖北海棠最弱。并且在整個脅迫過程中，由于品種特性的不同，各品種葉片滲透調節(jié)物含量達到峰值的鹽濃度也不同。湖北海棠、山定子和白海棠葉片的可溶性糖和可溶性蛋白質含量均在15 mmol/L下達到最大值，超出該濃度的鹽堿復合脅迫會破壞這3個品種的滲透物質代謝系統(tǒng)，導致滲透調節(jié)物質含量降低。

4 結 論

隨著脅迫強度的增大，各砧木葉片葉綠素含量不斷減小，相對電導率和脯氨酸含量總體呈上升趨勢，可溶性總糖含量總體呈先上升后下降，可溶性蛋白含量呈先上升后下降和“升高—降低—升高”2種變化趨勢。八棱海棠、野蘋果、平邑甜茶、小金海棠耐鹽堿能力強，其中八棱海棠位次第1，白海棠和山定子耐鹽堿能力中等，湖北海棠受脅迫的影響最大，其隸屬函數(shù)值最小。各砧木品種的耐鹽堿能力由強到弱依次為八棱海棠>野蘋果>平邑甜茶>小金海棠>山定子>白海棠>湖北海棠。