超聲波結(jié)合熱處理對蓮藕多酚氧化酶和過氧化物酶鈍化效果研究

代雨杉，馬秀菊，畢秀芳

（1.西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，成都 610039；2.四川省食品生物技術(shù)高校重點實驗室，成都 610039）

0 引言

蓮藕（Nelumbo nucifera Gaertn.）屬睡蓮科植物，是一種多年生大型水生草本植物。蓮藕中富含鉀、鐵、硫胺素、核黃素、吡哆醇、維生素C、多酚等營養(yǎng)素，具有促進血液循環(huán)、消化吸收，健脾開胃，提高免疫功能以及緩解焦慮、頭痛和血壓等功效［1］。鮮切蓮藕是將新鮮蓮藕經(jīng)過最少加工程序制成的一種可直接烹調(diào)食用的產(chǎn)品［2］，因其方便、快捷而受到人們歡迎。但新鮮蓮藕加工過程中易發(fā)生酶促褐變反應(yīng)，給蓮藕產(chǎn)品的外觀和營養(yǎng)等各方面造成極大的損害［3］。因此，開發(fā)鮮切蓮藕防褐變保鮮技術(shù)已成為鮮切蓮藕研究的熱點之一。多酚氧化酶（Polyphenol oxidase，PPO）是鮮切蓮藕中發(fā)生酶促褐變的關(guān)鍵性酶之一，PPO在有氧條件下催化酚類物質(zhì)氧化成醌，并聚合形成黑色素或褐色素［4］。此外，引起鮮切果蔬酶促褐變的重要因素還有過氧化物酶（Peroxidase，POD）［5］。

傳統(tǒng)的熱處理雖然能殺菌和鈍酶，但會破壞食品的天然成分和營養(yǎng)物質(zhì)［6］。超聲波（Ultrasound，US）在食品的保鮮［7］、解凍［8］、功能性物質(zhì)的提取以及食品污染物的降解中發(fā)揮了良好的作用［9-10］。超聲波在食品加工中主要作用是殺菌和鈍酶，周新麗等［11］發(fā)現(xiàn)用超聲波輔熱聯(lián)合抗壞血酸的方法處理胡蘿卜不僅能顯著提高胡蘿卜樣品中維生素C的含量，還能最大程度地維持胡蘿卜細胞的原有結(jié)構(gòu)；楊明冠等［12］以600 W的超聲波功率處理馬鈴薯90 min，發(fā)現(xiàn)馬鈴薯PPO的酶活力僅為原酶液的54.21%，結(jié)果表明超聲波有效抑制了馬鈴薯的褐變；吳詠等［13］研究發(fā)現(xiàn)在超聲功率密度70 W/L、雙頻超聲20 kHz與40 kHz順序工作15 min后，蓮藕中PPO和POD的酶活力分別降低至30.6%和44.3%。但目前關(guān)于超聲波結(jié)合熱處理對蓮藕酶活性的鈍化效果鮮有報道。本試驗通過研究不同溫度和US單獨處理以及兩者結(jié)合處理對蓮藕PPO和POD活力的影響，從而更好地控制酶促褐變，為工業(yè)化生產(chǎn)過程中蓮藕品質(zhì)控制提供條件和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮蓮藕，成都市紅光鎮(zhèn)世紀百盛超市；鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、雙氧水、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉分析純，成都科龍化工試劑廠；聚乙烯吡咯烷酮（PVPP），Sigma-Aldrich（中國上海）。

WFJ7200型分光光度計（尤尼柯（上海）儀器有限公司）；THERMO型高速冷凍離心機（成都世紀方舟科技有限公司）；Scientz-llD型超聲波細胞粉碎機（上海試驗儀器有限公司）；DZKW-C型雙列六孔恒溫水浴箱（天津市萊悅納格試驗室儀器銷售有限公司）；HBL-P08D1R型打漿機（青島海爾成套家具服務(wù)有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 粗酶液的提取

參照王秋成等［2］的方法，并略加修改。將188 g新鮮蓮藕洗凈，去皮，切成5 cm×5 cm×5 cm小塊，加入到470 mL，pH值為7.0，0.2 mol/L的磷酸緩沖液（含5%PVPP）的提取液中勻漿后置于4 ℃冰箱里靜置12 h，再在4 ℃、8 000 r/min離心作用10 min，取上清液過濾后得到粗酶液，記錄上清液體積，所得粗提物無需進一步純化即可使用。

1.2.2 試驗設(shè)計

1.2.2.1 不同溫度處理酶液

取30 mL粗酶液置于50 mL燒杯中，置于水浴鍋中保溫，當(dāng)酶液中心溫度達到指定溫度后開始計時，在 35～65 ℃下保溫 5～30 min，在 75 ℃下保溫5～10 min。達到處理時間后取出樣品并迅速用25 ℃水浴降溫至室溫，以未處理粗酶液作對照，考察溫度對粗酶液酶活力的影響，試驗重復(fù)2次。

1.2.2.2 0 ℃和25 ℃下不同超聲功率處理酶液

取30 mL粗酶液置于50 mL燒杯中，分別在溫度為0 ℃（冰?。┖?5 ℃（水?。┫拢?30～520 W超聲波（探頭直徑6 mm；探頭浸入液面的高度1.5 cm；脈沖間隔2.5 s開，2.5 s關(guān)）分別處理 2，4，6，8，10 min，以未處理粗酶液作對照，分別考察0 ℃和25 ℃溫度下不同功率的超聲波處理對粗酶液酶活力的影響，試驗重復(fù)2次。

1.2.2.3 260 W超聲波結(jié)合不同溫度處理酶液

取30 mL粗酶液置于50 mL燒杯中，在不同溫度（25，35，45 ℃）水浴下結(jié)合 260 W 超聲波（探頭直徑6 mm；探頭浸入液面的高度1.5 cm；脈沖間隔 2.5 s開，2.5 s關(guān)）處理 2，4，6，8，10 min，以未處理粗酶液作對照，考察超聲波結(jié)合不同溫度對粗酶液酶活力的影響，試驗重復(fù)2次。

1.2.3 指標(biāo)測定

1.2.3.1 PPO的測定

參照胡婉峰等［14］的方法，并略加修改。取3 mL的底物溶液（0.3 mol/L鄰苯二酚，用0.2 mol/L的磷酸緩沖液配置，pH值為7.0）與0.5 mL粗酶液迅速混合均勻后立即測定在420 nm處的吸光值，每5 s記錄1次，連續(xù)記錄 1.5 min。

1.2.3.2 POD的測定

參照李忠光等［15］的方法，并略加修改。取2 mL 1%的愈創(chuàng)木酚（0.2 mol/L磷酸緩沖液配置，pH值為7.0），0.1 mL 2%過氧化氫溶液（用0.2 mol/L磷酸緩沖液配置，pH值為7.0），然后加入0.1 mL粗酶液迅速混合均勻后立即測定在470 nm處的吸光值，每 10 s 記錄1次，連續(xù)記錄3 min。

PPO 和 POD的一個酶活力單位（U）定義為每分鐘吸光值增加0.1。并利用如下公式計算殘留酶活力（Residual enzyme activity，RA）：

式中At——處理后樣品酶活力；

A0——未處理樣品初始酶活力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 22對數(shù)據(jù)進行顯著性分析，顯著水平為0.05，使用 Originpro 8.5軟件作圖，所有試驗重復(fù)2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對PPO和POD活力的影響

由圖1可知，當(dāng)處理溫度為35 ℃和45 ℃時，隨處理時間的延長，PPO和POD殘留酶活力無顯著變化（P>0.05），與闕瑞琦等［16］發(fā)現(xiàn)蓮藕POD在30～50 ℃穩(wěn)定性較強的試驗結(jié)果相似。在45 ℃下處理20 min時，出現(xiàn)PPO和POD活力小幅度增加的現(xiàn)象，這可能是因為溫度升高改變了酶蛋白結(jié)構(gòu)，使酶活性中心暴露，從而提高了酶活力［17］。在55 ℃和65 ℃條件下，PPO和POD殘留活力隨處理時間的延長顯著下降，處理30 min后PPO活力分別降至52.9%、25.7%，POD活力分別降至56.7%、28.7%。朱路英等［18］也發(fā)現(xiàn)隨著溫度升高，庫爾勒梨PPO活力降低，在70～75 ℃下熱處理10 min，庫爾勒梨PPO殘留酶活力降至24.81%～35.79%。

圖1 不同溫度對蓮藕PPO和POD活力的影響Fig.1 Effects of different temperatures on PPO and POD activity of lotus root

處理溫度升高至75 ℃，PPO和POD在10 min內(nèi)完全失活。張琥等［19］發(fā)現(xiàn)100 ℃處理10 min，馬鈴薯PPO殘留活力降至20%；劉軍偉等［20］發(fā)現(xiàn)90 ℃處理20 min時，紫薯PPO殘留活力為10%。以上結(jié)果表明蓮藕PPO和POD的熱穩(wěn)定性相對較差，對熱更為敏感。高溫鈍化酶活的主要原因是高溫下酶分子的二級結(jié)構(gòu)中發(fā)生著α-螺旋向β-轉(zhuǎn)角的轉(zhuǎn)化，當(dāng)升高處理溫度時，α-螺旋同時向β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)化，從而使得酶失活速度加快。

2.2 0 ℃下不同功率US對PPO和POD活力的影響

由圖2（a）可知，當(dāng)超聲波功率為130 W和260 W時，隨著超聲時間的延長，PPO殘留酶活力緩慢下降，處理10 min后分別降至91.3%、80.6%；當(dāng)處理時間相同時，隨著超聲功率的增加，酶活力下降顯著，處理10 min時，390 W和520W下PPO活力分別為60.2%和41.3%。結(jié)果表明在一定時間范圍內(nèi)，超聲波功率越高，鈍酶效果越好。這與文獻報道的隨著超聲波功率的增大，過氧化氫酶、ATP酶活力下降的結(jié)果相似［21-22］。超聲波處理鈍化酶的原因可能是粗酶液中的自由水在超聲波的空化作用下產(chǎn)生自由基，迫使酶空間構(gòu)象發(fā)生改變，從而發(fā)生酶活的變化。

由圖2（b）可知，130 W超聲波處理10 min后POD活力降幅較小，殘留活力為91.3%；提高超聲波功率至260～520 W，POD活力隨著處理時間的延長（2～6 min）先迅速降低后幾乎不變。這可以歸因于POD存在2種不同熱穩(wěn)定性的同工酶，隨著超聲波處理時間的增加，不穩(wěn)定型同工酶在超聲波產(chǎn)生的高溫條件下失活，而穩(wěn)定型同工酶被保留［23］。在 260，390，520 W 三種功率下處理6 min，POD活力分別降至82.8%、80.6%、69.9%，這是由于超聲強度越大，產(chǎn)生的瞬態(tài)空化作用越強，酶活力越低。

圖2 0 ℃下超聲波對蓮藕PPO 和POD活力的影響Fig.2 Effects of ultrasound treatment on PPO and POD activity of lotus root at 0 ℃

130 W超聲波處理下，PPO和POD均出現(xiàn)酶活力增大的現(xiàn)象，F(xiàn)ONTELES等［24］也發(fā)現(xiàn)哈密瓜汁在373 W的超聲功率下處理6 min，POD活力增加了27.4%。這可能是由于超聲波產(chǎn)生的機械傳質(zhì)作用和熱效應(yīng)增加了底物分子與酶分子的能量，使得它們相互間碰撞的概率增大，同時也加強了介質(zhì)與酶之間的傳質(zhì)擴散過程，從而提高了酶促反應(yīng)速度。試驗中超聲波對酶的鈍化效果有限，可能是超聲波空化作用較小，還有可能是因為冰水浴抑制了超聲波的空化作用［25］。

由于0 ℃抑制了超聲波的作用，此時2種酶的殘留活力下降是超聲波產(chǎn)生的物理化學(xué)效應(yīng)所造成的，所以試驗選取溫度結(jié)合超聲波處理進一步探究超聲波的鈍酶效果。

2.3 25 ℃下不同功率US對PPO和POD活力的影響

由圖3（a）可知，在130 W功率下處理4 min，PPO殘留活力發(fā)生小幅度增加，隨處理時間延長至10 min，PPO活力緩慢降低至79.9%。提高超聲波功率至260～520 W，PPO活力隨著處理時間的增加先迅速下降后緩慢降低，處理10 min時，PPO活力分別下降至69.9%、51.6%、29.6%，這與王文宗等［26］所報道的隨著超聲處理時間的增加，PPO活力降幅變小的變化規(guī)律相似。這可能是因為超聲波產(chǎn)生的自由基和空化效應(yīng)使PPO的構(gòu)象產(chǎn)生了變化，使其活力在短時間內(nèi)迅速降低，但由于酶的結(jié)構(gòu)具有柔性，繼續(xù)延長超聲處理時間不會對其結(jié)構(gòu)再有太大影響。

由圖 3（b）可知，在 130，260，390 W 功率下處理2 min，POD活力分別增加了5.7%、0.8%、8.7%。隨著處理時間延長（2～10 min），殘留活力逐漸下降，處理10 min時POD活力分別降低至76.3%、69.9%、47.9%；在520 W功率下，隨著處理時間延長至10min，POD活力逐漸下降至35.5%。鄭炯等［27］也發(fā)現(xiàn)隨著超聲波功率的提高（100～300 W），在相同處理時間內(nèi)西瓜汁POD殘留活力顯著降低。

圖3 25 ℃下不同功率US對蓮藕PPO和POD活力的影響Fig.3 Effects of different US on PPO and POD activity of lotus root under 25 ℃

圖3中出現(xiàn)酶活力增大的現(xiàn)象可能是因為短時間或低功率的US作用對酶有一定的提取作用［28］，還可能是因為短時間的超聲波作用會打破大分子結(jié)構(gòu)，增加酶蛋白活性基團與底物結(jié)合的幾率，從而提升酶活力。在相同處理時間內(nèi)，對比0 ℃和25 ℃下相同功率超聲處理的鈍酶化效果，結(jié)果表明升高溫度有利于增強超聲波的鈍酶效果。

從以上試驗結(jié)果得出，在25 ℃、功率≤260 W條件下處理PPO和POD時，鈍酶效果優(yōu)于冰浴條件（0 ℃、功率≤260 W），考慮到實際生產(chǎn)成本以及儀器使用壽命，可選擇260 W超聲波結(jié)合不同溫度處理作進一步研究。

2.4 260 W超聲功率下不同溫度對PPO和POD活力的影響

由圖4可知，隨著處理溫度的升高和時間的延長，PPO和POD殘留酶活力逐漸降低；在25 ℃、35 ℃、45 ℃下處理 10 min，PPO 活力分別下降至69.9%、42.1%、28.8%，POD活力分別下降至69.9%、57.6%、40.7%，表明POD耐受性強于PPO。一方面，這可能是因為溫和熱處理（25 ℃～45 ℃）對POD熱降解的反應(yīng)速率常數(shù)k影響不大，此時蛋白質(zhì)二、三級結(jié)構(gòu)受熱影響較小，酶活力降低更加依賴時間效應(yīng)，因而POD更耐熱［29］；另一方面，PPO前體一般由N-端導(dǎo)肽、富含His殘基的Cu結(jié)合區(qū)和疏水性C-端3部分組成［30］，超聲波處理可能使埋藏在C-端的疏水基暴露，因而PPO對超聲波更敏感。

圖4 260 W下不同溫度對蓮藕PPO和POD活力的影響Fig.4 Effects of different temperatures on PPO and POD activity of lotus root under 260 W

在45 ℃、260 W條件下處理的鈍酶效果，顯著高于單獨超聲波（0 ℃、260 W）或單獨熱處理（45 ℃、10 min）的鈍酶效果，結(jié)果表明熱處理和US處理對鈍化蓮藕中PPO和POD具有協(xié)同作用?？赡苁且驗槌暡óa(chǎn)生的穩(wěn)定空化氣泡在液體介質(zhì)中傳播時會在周圍產(chǎn)生微射流和剪切力［31］，它們會破壞維持酶蛋白空間構(gòu)象的氫鍵、范德華力等次級鍵，導(dǎo)致酶分子二級、三級結(jié)構(gòu)改變，影響酶分子熱穩(wěn)定性，使其在較低溫度下失活［32］。

3 結(jié)語

本研究的試驗結(jié)果表明：（1）溫度≤45 ℃的處理對酶液中PPO和POD的鈍化效果不顯著；隨著處理溫度的升高和保溫時間的延長，PPO和POD活力逐漸減弱。在75 ℃下處理10 min，PPO和POD都基本失活，但POD的耐熱性強于PPO；（2）經(jīng)過單獨US處理后，隨著處理功率的增加和處理時間的延長，PPO活力顯著下降；隨著超聲處理時間的延長，POD活力先顯著下降后趨于平緩；（3）超聲波結(jié)合不同溫度處理酶液后，鈍酶效果顯著強于單獨的US處理或單獨的熱處理。試驗證實了US結(jié)合熱處理對PPO和POD的鈍化效果具有協(xié)同作用，并得到兩者結(jié)合處理后鈍酶效果最好的處理條件：45 ℃、260 W處理10 min。以上試驗結(jié)果不僅為超聲波鈍化PPO和POD提供了理論數(shù)據(jù)，也為鮮切蓮藕的超聲波保鮮技術(shù)的發(fā)展提供了一定的理論支撐。