1例13號(hào)染色體復(fù)雜嵌合型結(jié)構(gòu)畸變的細(xì)胞遺傳學(xué)分析

李顯箏 許玲 蔡嬋慧 胡晶晶

（廣東省婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511442）

絨毛染色體核型分析是孕早期常見(jiàn)的產(chǎn)前診斷方法之一。相對(duì)于羊水染色體核型分析，絨毛核型分析更容易出現(xiàn)嵌合體，而這些嵌合體有些是真性嵌合，有些是假性嵌合，如何鑒別和預(yù)測(cè)這些嵌合體對(duì)胎兒的風(fēng)險(xiǎn)，是產(chǎn)前診斷中的一大難題［1］。目前，臨床上絨毛嵌合體多數(shù)為非整倍體數(shù)目異常嵌合，染色體結(jié)構(gòu)重排畸變嵌合比較少見(jiàn)（79.3%vs 20.7%）［2］。本文將探討1例13號(hào)染色體復(fù)雜結(jié)構(gòu)畸變的嵌合體病例，并深入探討其可能發(fā)生的機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 孕婦，43歲，2019年3月27日來(lái)本院就診。末次月經(jīng)為2018年12月19日，于2018年12月23日通過(guò)體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization／intracytoplasmic sperm injection-embryo transfer，IVF／ICSI-ET）手段植入2枚冷凍胚胎，早期超聲提示存活1枚。2009年順產(chǎn)一女，現(xiàn)體健，平素月經(jīng)規(guī)則，無(wú)特殊，夫妻雙方外周血染色體核型均正常。孕12＋周左右，超聲提示宮腔內(nèi)單活胎，胎兒頸項(xiàng)透明層厚度（nuchal translucency，NT）4.7mm。就診完善相關(guān)檢查，孕婦及家屬簽署知情同意書，于孕14＋周，經(jīng)腹B超行絨毛膜穿刺術(shù)，同時(shí)送檢絨毛染色體核型分析及染色體微陣列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）檢測(cè)。因絨毛染色體結(jié)果提示嵌合體，孕婦于孕18＋周，經(jīng)腹B超行羊膜腔穿刺術(shù)，再次送檢羊水核型分析及CMA檢測(cè)。

1.2 方法

1.2.1 絨毛染色體核型分析孕11～15周孕婦在B超介導(dǎo)下經(jīng)腹穿刺絨毛20～30mg，用無(wú)菌生理鹽水清洗干凈后，送至無(wú)菌培養(yǎng)室，于解剖顯微鏡下挑選出絨毛組織，經(jīng)無(wú)菌手術(shù)刀剁碎和酶消化后，接種到3個(gè)培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)觀察，1瓶進(jìn)行原位收獲、制片，1瓶傳代、收獲和制片，另1瓶留作備份繼續(xù)培養(yǎng)，于顯微鏡下分析計(jì)數(shù)核型，若出現(xiàn)嵌合現(xiàn)象時(shí)加大計(jì)數(shù)量并對(duì)備份培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞進(jìn)行傳代、收獲和制片，加數(shù)盡量多的核型進(jìn)行分析。

1.2.2 羊水染色體核型分析本中心采用原位羊水細(xì)胞培養(yǎng)法，孕婦于孕18～24周在B超介導(dǎo)下經(jīng)腹穿刺羊水30ml，雙人雙線操作，接種2個(gè)培養(yǎng)瓶和2個(gè)培養(yǎng)皿，常規(guī)羊水培養(yǎng)，將2個(gè)培養(yǎng)瓶進(jìn)行原位收獲和制片，顯微鏡下計(jì)數(shù)15個(gè)細(xì)胞克隆，分析5個(gè)核型，若出現(xiàn)嵌合現(xiàn)象時(shí)加大計(jì)數(shù)量并對(duì)2個(gè)備份培養(yǎng)皿中的細(xì)胞進(jìn)行傳代、收獲和制片，加數(shù)盡量多的核型進(jìn)行分析。

1.2.3 CMA檢測(cè)簽署知情同意書后，采集孕婦絨毛或羊水。使用Agilent公司生產(chǎn)的8×60K芯片進(jìn)行全基因組范圍的不平衡現(xiàn)象檢測(cè)。整個(gè)過(guò)程嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)化操作進(jìn)行，包括DNA的提取、酶切、連接、PCR、純化、片段化、標(biāo)記、雜交、掃描和分析。最終以正常男性DNA作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，利用Ch AS軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 經(jīng)腹超聲結(jié)果經(jīng)腹部超聲掃查提示：子宮增大，宮腔內(nèi)見(jiàn)一胎兒回聲，頭臀徑63mm，可見(jiàn)胎心搏動(dòng)，胎兒NT4.7mm，胎盤位于子宮前壁，厚16mm，胎盤成熟度0度，羊水暗區(qū)31mm，子宮宮底壁見(jiàn)1個(gè)低回聲團(tuán)，大小約23mm×12mm，邊界清，內(nèi)部回聲分布均勻，圖1。

圖1 超聲結(jié)果：NT4.7mm

2.2 染色體G顯帶核型結(jié)果絨毛染色體核型分析共發(fā)現(xiàn)3種異常核型：①46，XX，del（13）（q22）；②46，XX，-13，＋mar；③46，XX，add（13）（q22），均涉及13號(hào)染色體，嵌合比例分別為50%、30%和20%，圖2A-C，羊水染色體核型分析結(jié)果為46，XX，del（13）（q31.1），胎兒僅存在一種異常核型，圖2D。

圖2 染色體核型結(jié)果

2.3 染色體微陣列檢測(cè)結(jié)果絨毛染色體微陣列結(jié)果提示：arr［hg19］10q22.1q26.3（70，857，961-135，426，386）x2-3，13q22.1q34（74，346，851-115，107，733）x1-2，發(fā)現(xiàn)胎兒存在兩種基因拷貝數(shù)的變化：①10號(hào)染色體10q22.1-q26.3位置發(fā)生嵌合重復(fù)（比例約23%），片段大小約64.6Mb，包含616個(gè)基因；②13號(hào)染色體13q22.1-q34位置發(fā)生嵌合缺失（比例約40%），片段大小約40.7Mb，涉及251個(gè)基因，圖3A。

羊水染色體微陣列結(jié)果提示：arr［hg19］13q31.1q34（84，336，388-115，107，733）x1，發(fā)現(xiàn)胎兒13號(hào)染色體13q31.1-qter位置發(fā)生缺失，片段大小約40.7Mb，涉及251個(gè)基因，其中97個(gè)為OMIM基因，圖3B。

圖3 染色體微陣列結(jié)果

3 討論

絨毛是胚胎和母體進(jìn)行物質(zhì)交換的重要組成部分［3］。絨毛染色體核型G顯帶分析技術(shù)在臨床中具有早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)、降低孕婦心理及身體創(chuàng)傷等優(yōu)點(diǎn)，但其技術(shù)手段仍存在一定的弊端［4］。眾所周知，胎盤由羊膜、葉狀絨毛膜和底蛻膜構(gòu)成，羊膜和葉狀絨毛膜構(gòu)成胎盤的胎兒部分，葉狀絨毛膜是絨毛穿刺的目標(biāo)物［5］；底蛻膜構(gòu)成胎盤的母體部分，絨毛穿刺時(shí)不慎抽到底蛻膜是造成母體組織污染的主要原因［6］。同時(shí)，由于絨毛取材過(guò)程中易污染、取材難度大、絨毛量多少不同、孕周不同、培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短等因素，對(duì)最終絨毛染色體結(jié)果都會(huì)造成不同程度的影響［7］。

絨毛檢查所取標(biāo)本主要為滋養(yǎng)細(xì)胞及絨毛間質(zhì)細(xì)胞，雖然與胎兒來(lái)源于同一個(gè)受精卵，屬于胎盤的一部分，但其并非真正的胎兒組織。在胚胎發(fā)育至64個(gè)細(xì)胞胚泡階段，4個(gè)細(xì)胞發(fā)育成胎兒，12個(gè)細(xì)胞發(fā)育成胚外中胚層，其余48個(gè)細(xì)胞發(fā)育成滋養(yǎng)層，在胚胎發(fā)育早期，理論上非胎兒結(jié)構(gòu)比胎兒更容易發(fā)生有絲分裂錯(cuò)誤［8］。一般情況下絨毛核型能代表胎兒核型，但也可能由于母體組織污染或者限制性胎盤嵌合體（CPM）的存在，不能真實(shí)反映胎兒情況。當(dāng)絨毛染色體嵌合現(xiàn)象發(fā)生時(shí)，應(yīng)首先鑒別胎兒真性嵌合的可能性。如果在胚胎時(shí)期，細(xì)胞融合或分裂錯(cuò)誤形成嵌合體，一般是真性嵌合體［9］。所以，準(zhǔn)確分析判斷絨毛染色體嵌合體的真假性，排除CPM的可能，對(duì)胎兒及妊娠結(jié)局的影響是非常重要的。

在孕早期絨毛活檢中，CPM的發(fā)生率大約在1%～2%［10］。當(dāng)發(fā)生CPM時(shí)，絨毛核型與胎兒核型結(jié)果可能出現(xiàn)不一致，出現(xiàn)絨毛嵌合現(xiàn)象。目前，CPM根據(jù)發(fā)生機(jī)制，可分為減數(shù)分裂型以及有絲分裂型：減數(shù)分裂型指受精卵染色體異常，在之后的分裂中，由于“錯(cuò)誤”導(dǎo)致囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中形成胚胎的細(xì)胞丟失異常染色體，而其余異常細(xì)胞被“驅(qū)趕”至滋養(yǎng)細(xì)胞層，這個(gè)過(guò)程被稱為“胎兒自救”（fetal rescue）；有絲分裂型指受精卵染色體正常，異常分裂發(fā)生在胎盤細(xì)胞的前體中［11］。對(duì)于絨毛染色體發(fā)現(xiàn)異常核型嵌合現(xiàn)象時(shí)，不能盲目認(rèn)定胎兒染色體存在異常，需進(jìn)一步復(fù)查羊水，但即使后續(xù)羊水診斷核型結(jié)果正常，胎兒仍可能存在低水平的嵌合，并且有1／3的機(jī)會(huì)是單親二體（uniparental disomy，UPD），對(duì)于某些可能存在印記基因的染色體，例如5、6、7、9、11、14、15、16號(hào)染色體，診斷CPM的同時(shí)還要除外UPD的存在［5］。

本病例絨毛核型與CMA結(jié)果均提示13號(hào)染色體存在異常。由于CMA的結(jié)果提示10號(hào)染色體存在嵌合重復(fù)，且重復(fù)片段斷裂位點(diǎn)位于10q22，結(jié)合第三種異常核型，與10號(hào)染色體帶紋進(jìn)行比對(duì)，我們認(rèn)定第三種異常核型中的未知13號(hào)染色體為一條衍生染色體，其未知附加片段來(lái)源為10號(hào)染色體的部分三體，同時(shí)伴隨13號(hào)q22位置至末端的部分單體，其核型描述修正為：46，XX，der（13）t（10；13）（q22；q22）。CMA提示10號(hào)染色體嵌合重復(fù)的比例為23%，而13號(hào)染色體嵌合缺失的比例為40%，除了10號(hào)與13號(hào)染色體易位重排的衍生染色體外，還存在13號(hào)q22至末端缺失的情況，即第一種異常核型46，XX，del（13）（q22）。由于核型分析與CMA技術(shù)均存在局限性，不能排除絨毛CPM的存在，同時(shí)CMA技術(shù)對(duì)低比例的嵌合不能準(zhǔn)確檢出，所以第二種異常核型仍不能確認(rèn)其來(lái)源及異常類型，需進(jìn)一步復(fù)查羊水。經(jīng)檢測(cè)，羊水染色體核型分析以及CMA結(jié)果均提示胎兒為純合狀態(tài)的13號(hào)染色體q31至末端的缺失，“13p缺失綜合征”主要臨床表現(xiàn)為嚴(yán)重的智力障礙、特殊面容、中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常、肌張力低下等，孕婦及家屬選擇終止妊娠。

該病例絨毛與羊水檢測(cè)出現(xiàn)了不同的結(jié)果，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，絨毛核型與絨毛CMA結(jié)果基本一致，羊水核型與羊水CMA結(jié)果一致，從而排除由于細(xì)胞體外培養(yǎng)、收獲等操作造成的假性嵌合現(xiàn)象，可以確定該病例CPM的存在，推測(cè)13號(hào)染色體的畸變細(xì)胞異常分裂可能發(fā)生在減數(shù)分裂期，由于胎兒復(fù)雜的自救過(guò)程，導(dǎo)致胎盤存在三種不同形式的異常核型的嵌合，而胎兒由一種異常核型發(fā)育而來(lái)。遺憾的是本病例外院引產(chǎn)，未能留取胎盤組織進(jìn)一步印證。

綜上所述，絨毛核型分析的嵌合現(xiàn)象仍然是產(chǎn)前診斷和咨詢中的難點(diǎn)。雖然CPM的發(fā)生率較低，當(dāng)絨毛核型分析發(fā)現(xiàn)嵌合體時(shí)仍應(yīng)充分考慮CPM的可能性，復(fù)查羊水或臍帶血進(jìn)一步確診。臨床上應(yīng)重視CPM的存在，加強(qiáng)對(duì)CPM的遺傳咨詢。對(duì)于存在CPM且胎兒核型正常的妊娠，孕期應(yīng)加強(qiáng)對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育的監(jiān)測(cè)，分娩時(shí)留取胎盤多點(diǎn)取材，分別檢測(cè)染色體核型進(jìn)一步印證。