礦泉水中銅綠假單胞菌的測定能力驗證結(jié)果分析

胡如榮

銅綠假單胞菌又稱綠膿桿菌，廣泛分布于自然界及各類型水中，對消毒劑、干燥、紫外線等理化因素具有很強的耐受性，可引起多種疾病，國內(nèi)外都有被此污染的報道。因此，我國食品安全國家標準GB 8537《飲用天然礦泉水》2008版中就增加了對銅綠假單胞菌的要求，并于2018版中提高了對銅綠假單胞菌指標的要求，2021年版《國家食品安全監(jiān)督抽檢實施細則》也將銅綠假單胞菌指標作為包裝飲用水的重點監(jiān)測項目之一。2021年1-9月全國各省市場監(jiān)督管理局對包裝飲用水進行抽檢，其中，微生物項目抽檢不合格的產(chǎn)品結(jié)果顯示，約95%為銅綠假單胞菌不合格。因此，準確而快速地檢測礦泉水中銅綠假單胞菌污染情況，對于保障人民飲水安全和評價工廠檢測能力顯得尤為重要。

能力驗證即通過實驗室間的比對，按照預(yù)先設(shè)定的標準規(guī)則來評價參加者的能力。實驗室可以利用能力驗證的方法對檢測人員能力、方法驗證、數(shù)據(jù)或結(jié)果的準確性和不確定度進行評價，對于滿足監(jiān)管機構(gòu)和提升公司產(chǎn)品出廠檢驗準確性具有重要意義。本實驗室分別通過參加中國檢驗檢疫科學(xué)研究試驗測試評價中心ACAS-PT1117和大連中食國實檢測技術(shù)有限公司組織的銅綠假單胞菌能力驗證和（定量）測量審核，來驗證檢測中心出具的檢測報告是否具有良好的可靠性，并以此作為公司銅綠假單胞菌檢測質(zhì)量提升的理論支持。

一、材料和設(shè)備

1.原材料及主要試劑。標準樣，21-M797、21-Q246，中國檢驗檢疫研究院測試評價中心;銅綠假單胞菌（定量測試）樣品-064，大連中食國實檢測技術(shù)有限公司;假單胞菌CN選擇性培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;營養(yǎng)瓊脂，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;氧化酶試紙、乙酰胺肉湯、鈉氏試劑、綠濃菌素測定培養(yǎng)基，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;配置用水，檢測中心自制超純水。

2.主要實驗設(shè)備。超凈工作臺，SW-CJ-ID，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司;生化培養(yǎng)箱，SHP-150，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;顯微鏡，DYS系列，上海點應(yīng)光學(xué)儀器有限公司;暗箱式紫外分析儀，ZF-20D，上海寶山顧村電光儀器廠;高壓滅菌器，BSC-250，上海申安醫(yī)療器械廠;電子天平，0.1g/500g，雙節(jié)測試儀器廠;移液槍，1000-5000μL，Dragon-lab。

二、實驗和方法

1.樣品預(yù)處理。分別依據(jù)ACAS-PT1117（2021）礦泉水中銅綠假單胞菌的檢測能力驗證參試指導(dǎo)書2.3條款和礦泉水中銅綠假單胞菌（定量）測量審核參試指導(dǎo)書的要求，對樣品進行預(yù)處理。（1）中檢樣品：在無菌級的超凈工作臺上打開西林瓶，用移液槍加入10mL無菌水，反復(fù)吹吸溶解后轉(zhuǎn)移至容量為1000mL的三角瓶中，再反復(fù)用余下的無菌水清洗西林瓶內(nèi)壁，回收至三角瓶中，最終三角瓶中的菌液定容為520mL，即為待測原液A。（2）大連中食國實樣品：用稀釋液2-4mL對西林瓶再水化，反復(fù)清洗西林瓶，并回收至無菌瓶中，稀釋液合計40mL;將10mL稀釋液添加到240mL的無菌生理鹽水中，最終定容至250mL，即為待測液原液A。

2.樣品稀釋。將待測原液A參照國標GB 4789-2016《菌落總數(shù)測定》樣品稀釋方法進行相應(yīng)的稀釋。（1）中檢原液：用移液槍分別吸取50mL原液A、450mL無菌水，混勻即為10倍稀釋待測液B;用移液槍分別吸取50mL待測液B、450mL無菌水，混勻即為100倍稀釋待測液C;用移液槍分別吸取50mL待測液C、450mL無菌水，混勻即為1000倍稀釋待測液D（待測液B、C、D分別平行制備2份）。（2）大連中食國實原液：取25mL待測原液A加入到225mL稀釋液中，定容至250mL，作為10倍稀釋待測液B，以此類推依次作相應(yīng)梯度稀釋。

3.樣品過濾。樣品過濾需在超凈工作臺進行。先用無菌鑷子夾取無菌濾膜的邊緣部分，將糙面朝上，貼放在已滅菌的濾床上，將250mL無菌濾杯固定好，再分別將待測原液A（ 1份）、10倍稀釋待測液B（2份）、100倍稀釋待測液C（2份）、1000倍稀釋待測液D（2份）通過孔徑0.45μm的濾膜過濾，最后將過濾后的濾膜貼在已制備好的CN瓊脂平皿上，平鋪時要避免在瓊脂和濾膜之間留有氣泡，并做好陰性和陽性對照。培養(yǎng)溫度：36±1℃，培養(yǎng)周期：24-48h。

三、結(jié)果與分析

1.結(jié)果觀察與計數(shù)。中檢樣品21-Q246、21-M797在10倍稀釋液B和100倍稀釋液C平皿形成了可計算的分散的典型菌落，而待測原液A的菌落數(shù)目多不可計，1000倍稀釋液D未長菌。大連中食國實樣品-064待測原液A和10倍稀釋液B平皿形成了可計算的分散的典型菌落，100倍稀釋液C和1000倍稀釋液D均未長菌。

2.可疑菌落的確證性試驗。根據(jù)GB 8538-2016《飲用天然礦泉水檢驗方法》57.5.3-57.5.4條款要求，對可疑菌落進行確證性試驗，菌落選擇和驗證步驟詳見表1。

樣品21-Q246、21-M797和樣品-064上的產(chǎn)熒光（非藍/綠）菌落經(jīng)常規(guī)生化驗證實驗和綠膿菌素試驗，鑒定為銅綠假單胞菌。結(jié)合CN平皿上可疑菌落的計數(shù)結(jié)果，樣品21-Q246報送結(jié)果為540CFU/250mL，樣品21-M797報送結(jié)果為890CFU/250mL，樣品-064報送結(jié)果為141CFU/250mL。

3.實驗結(jié)果。樣品21-Q246的檢測結(jié)果為540CFU/250mL，樣品21-M797的檢測結(jié)果為890CFU/250mL，取得z值分別為-2.8和-2.5，結(jié)果可疑，經(jīng)過對整個檢測過程的復(fù)盤排查，最終確認影響因素主要有兩個：一是樣品預(yù)處理沒有充分混勻，原液稀釋時僅用移液槍來回吹吸;二是樣品快遞過程存活率低。對中國檢驗檢疫科學(xué)研究試驗測試評價中心的試驗分析進行改進后，通過參加大連中食國實檢測技術(shù)有限公司測量審核，取得Z值為-1.68，說明本實驗室具備檢測銅綠假單胞菌的能力。

四、結(jié)論與討論

本實驗室通過參加由中國檢驗檢疫科學(xué)研究院和大連中食國實檢測技術(shù)有限公司組織實施的礦泉水中銅綠假單胞菌檢測能力驗證及定量測量審核實驗，依據(jù)能力驗證指導(dǎo)書及GB 8538-2016《飲用天然礦泉水檢測方法》對樣品進行檢測，并總結(jié)了檢測過程的影響因素及一般步驟，供實驗室在進行能力驗證或測量審核時參考。在實驗過程中發(fā)現(xiàn)，不同機構(gòu)提供的操作指導(dǎo)書存在比較大的差異，尤其在樣品預(yù)處理-樣品稀釋方面。另外，GB 8538-2016《飲用天然礦泉水檢測方法》中沒有稀釋方法，實驗過程中對礦泉水樣品參照GB4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》進行相應(yīng)的稀釋處理，使濾膜上能夠形成分散的單一菌落，便于可疑菌落的觀察計數(shù)，為準確報告飲用水中銅綠假單胞菌的污染情況提供保障。