胡椒梗精油的提取條件優(yōu)化及其成分分析

李麟洲，張楨炎，劉建卓，馮建成，張容鵠，谷風(fēng)林，吳桂蘋

（1.海南大學(xué)化學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，海南?？?570228）（2.海南海墾胡椒產(chǎn)業(yè)股份有限公司，海南?？?571126）（3.海南大學(xué)理學(xué)院，海南?？?570228）（4.海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工設(shè)計(jì)研究所，海南海口 571100）（5.海南省熱帶果蔬冷鏈研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 571100）（6.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所，海南萬寧 571533）

胡椒（Piper nigrumL.）又名白川、王椒，是胡椒科（Piperaceae）、胡椒屬（Piper）常綠藤本植物。原產(chǎn)于印度，后傳入我國，是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物。其氣味獨(dú)特，口感辛辣，深受世界各地人民的喜愛，被譽(yù)為“香料之王”[1-3]。胡椒梗是胡椒初加工過程中產(chǎn)生的廢棄物，在傳統(tǒng)加工過后被直接丟棄或被焚燒，帶來了環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。

精油又稱揮發(fā)油或香精油，是一類存在于植物的花、葉、枝、根、樹皮、果實(shí)、種子等部位，可以以蒸餾、壓榨、萃取等方式提煉出來的具有揮發(fā)性的芳香物質(zhì)[4-6]。胡椒粒中胡椒精油含量約1%～3%，主要成分是萜烯類物質(zhì)[7]。胡椒精油具有胡椒的辛辣氣味，風(fēng)味獨(dú)特，自然醇香[8,9]。目前，胡椒精油一般作為保健用品，供熏香、按摩時(shí)使用，有較高的產(chǎn)品附加值。長期以來，國際胡椒市場存在著供不應(yīng)求的問題[10]，若能夠從胡椒初加工廢棄物-胡椒梗中提取精油來代替胡椒果精油，或許可以減少胡椒果精油的需求[7]。

精油常用的提取方法有水蒸氣蒸餾法、有機(jī)溶劑萃取法、超臨界萃取法等方法[11]。水蒸氣蒸餾法工藝簡單，設(shè)備低廉易得，但精油產(chǎn)率較低[12,13]；溶劑萃取法工藝簡單且提取率高，但有機(jī)溶劑對環(huán)境危害較大，且溶劑殘留會(huì)對精油品質(zhì)造成較大影響[14]。超臨界萃取法提取效率高，且安全無殘留，但生產(chǎn)成本較高，不適合大規(guī)模生產(chǎn)[15,16]。國內(nèi)外利用互補(bǔ)技術(shù)提取不同天然產(chǎn)物的功能因子，均比傳統(tǒng)法得率高、時(shí)間短。王穎等[17]利用超聲-微波協(xié)同技術(shù)提取白胡椒精油，得率達(dá)3.80%，比單獨(dú)微波輔助和單獨(dú)超聲輔助得率均有所提高。酶法輔助水蒸氣蒸餾法在保留兩種方法優(yōu)勢的基礎(chǔ)上，通過生物酶專一性降解底物的細(xì)胞壁等細(xì)胞結(jié)構(gòu)[18,19]，使得在細(xì)胞內(nèi)的有效物質(zhì)溶出，從而達(dá)到提高精油產(chǎn)率的目的[20]。辜雪冬等[21]利用酶法輔助水蒸氣蒸餾技術(shù)提取檸檬果皮精油，相較單獨(dú)使用水蒸氣蒸餾，提取率有所提高，提取所需時(shí)間大大減少。

目前，國內(nèi)外關(guān)于胡椒果的精油提取已有較多報(bào)道，但鮮有關(guān)于胡椒梗精油提取及其成分分析的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以海南文昌胡椒初加工廢棄物-胡椒梗為原料，采用響應(yīng)面法對酶法輔助水蒸氣蒸餾法提取胡椒梗精油條件進(jìn)行優(yōu)化，并對胡椒梗精油的化學(xué)成分進(jìn)行分析，以期為胡椒梗廢棄物的開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與儀器

胡椒梗來自海南省瓊海市東紅農(nóng)場；正己烷為色譜純，美國SIGMA公司；纖維素酶，酶活30000 U/g，山東隆科特酶制劑有限公司；無水硫酸鈉及其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

HF-200A型高速多功能粉碎機(jī)，辰禾盛豐工貿(mào)有限公司；DHG-9053A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；AUY-220型分析天平，島津制作所；SPH-200B型恒溫培養(yǎng)震蕩器，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Agilent 7890B-7250氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胡椒梗精油的提取

將胡椒梗用自來水洗滌，在60 ℃烘箱中充分干燥，粉碎，過60目篩。準(zhǔn)確稱取100 g胡椒梗粉末，并按液料比5:1（mL/g）加入100 g/L的纖維素酶，在40 ℃，180 r/min振蕩處理3.0 h。將酶處理后的樣品放入水蒸氣蒸餾裝置，水蒸氣蒸餾6.0 h，回收分離器中的精油，并計(jì)算精油得率。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

采取1.2.1中的提取方法，保持酶解溫度為40 ℃、酶處理時(shí)間為3.0 h，液料比為5:1不變，分別考察酶濃度為0、50、100、150、200 g/L時(shí)對胡椒梗精油產(chǎn)率的影響；保持酶濃度為100 g/L，酶處理時(shí)間為3.0 h，液料比為5:1不變，分別考察酶處理溫度為20、30、40、50、60 ℃時(shí)對胡椒梗精油產(chǎn)率的影響；保持酶濃度為100 g/L、酶解溫度為40 ℃、液料比為5:1不變，分別考察酶處理時(shí)間為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h下對胡椒梗精油產(chǎn)率的影響；保持酶濃度為100 g/L，酶解溫度為40 ℃、酶處理時(shí)間為3.0 h不變，分別考察液料比為2:1、5:1、8:1、11:1、14:1（mL/g）時(shí)對胡椒梗精油產(chǎn)率的影響。通過單因素試驗(yàn)考察各因素對胡椒梗精油產(chǎn)率的影響，進(jìn)而進(jìn)一步確認(rèn)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)因素及水平。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取酶液濃度（g/L）、酶處理溫度（℃）、酶處理時(shí)間（h）、液料比（mL/g）為自變量，以胡椒梗精油得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對胡椒梗精油提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，其因素及水平設(shè)計(jì)見表1所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素和水平Table 1 Response surface experimental factors and levels

1.2.4 GC-MS色譜條件

精油前處理：將所得胡椒梗精油樣品充分靜置，加入少量無水硫酸鈉干燥，取上層精油樣品，用少量正己烷進(jìn)行稀釋待用。

氣相色譜條件：進(jìn)樣量0.5 μL，色譜柱Agilent HP-5MS （30 m×250 μm×0.25 μm），升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0 ℃，保持3 min，以4 ℃/min升溫至250 ℃，保持時(shí)間7 min，后運(yùn)行溫度為280 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源溫度200 ℃，四級桿溫度150 ℃，掃描范圍40～450 u，采集速度5質(zhì)譜圖/s。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design-Expert 8.05等軟件進(jìn)行顯著性分析，并通過各因素之間的交互影響效果的三維圖來分析各因素之間影響效果的顯著性，以預(yù)測最佳提取條件，通過比較預(yù)測值和實(shí)際值的差異可以判斷模型的準(zhǔn)確性。CG-MS結(jié)果采用采用Wiley譜庫檢索、結(jié)合人工解譜和查閱相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行定性，并采用面積歸一化法計(jì)算精油各成分的相對含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 酶濃度對胡椒梗精油得率的影響

由圖1可知，當(dāng)酶液濃度低于100 g/L時(shí)，隨著酶液濃度增大胡椒梗精油產(chǎn)率也不斷增加，但繼續(xù)增大酶液濃度，精油產(chǎn)率反而緩慢下降。其原因在于纖維素酶可以有效破壞胡椒梗細(xì)胞的細(xì)胞壁，使有效成分更容易溶出，從而增大胡椒梗精油的產(chǎn)率，隨著酶液濃度的增加，底物和纖維素酶的作用更加充分，使精油產(chǎn)率隨之增加；但酶液濃度過大，精油產(chǎn)率反而略有降低，這可能是由于酶濃度較高時(shí)會(huì)大大加快細(xì)胞壁的分解速率，細(xì)胞壁的分解產(chǎn)物會(huì)吸附精油中的某些組分，從而導(dǎo)致精油提取率降低[22]，該結(jié)果與張雪松[23]的研究一致。此外，更高的酶濃度會(huì)增加生產(chǎn)成本，因此，酶液濃度應(yīng)選擇100 g/L左右為宜。

圖1 酶濃度對胡椒梗精油得率的影響Fig.1 The effect of enzyme concentration on the yield of pepper stem essential oil

2.1.2 酶處理溫度對胡椒梗精油得率的影響

由圖2可知，隨著酶處理的增大，胡椒梗精油得率呈現(xiàn)先上升后降低的趨勢，在40 ℃左右時(shí)胡椒梗精油產(chǎn)率最高，進(jìn)一步增加溫度，精油產(chǎn)率大大降低。這是因?yàn)楫?dāng)溫度較低時(shí)，酶活性很低，產(chǎn)率也較低，隨著溫度增加，酶活增大，精油產(chǎn)率隨之增加，但溫度或高反而會(huì)使酶活降低，從而降低精油產(chǎn)率。這與周亞軍等[24]的研究結(jié)果基本一致。因此，酶處理溫度選擇40 ℃左右為宜。

圖2 酶處理溫度對胡椒梗精油得率的影響Fig.2 Effect of enzyme treatment temperature on the yield of pepper stem essential oil

2.1.3 酶處理時(shí)間對胡椒梗精油得率的影響

由圖3可知，胡椒梗精油得率隨著酶解時(shí)間的增大呈先上升后下降的趨勢，在酶解時(shí)間為3 h時(shí)胡椒梗精油得率最高。其原因可能是隨著酶解時(shí)間的增大，纖維素酶對細(xì)胞的破壞程度增加，促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)活性成分的釋放，但由于酶解反應(yīng)趨于完全，進(jìn)一步增加酶解時(shí)間精油得率不再增加。其結(jié)果與Sowbhagya等[25]提取小茴香精油結(jié)果相似。因此，酶解時(shí)間以3.0 h左右為宜。

圖3 酶解時(shí)間對胡椒梗精油得率的影響Fig.3 The effect of enzyme treatment time on the yield of pepper stem essential oil

2.1.4 液料比對胡椒梗精油得率的影響

由圖4可以看出，隨著液料比的增加，胡椒梗精油的產(chǎn)率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在液料比為5:1（mL/g）時(shí)精油得率最高。這是由于液料比過低時(shí)，酶液不能充分浸潤物料，酶解效率較低，隨著液料比增大，胡椒梗精油得率有所增加，但繼續(xù)增加液料比，會(huì)導(dǎo)致物料比率過低，酶液過量，不但增加了生產(chǎn)成本，而且會(huì)造成精油的損失[26]；因此，液料比的選擇應(yīng)該在5:1左右。

圖4 液料比對胡椒梗精油得率的影響Fig.4 The effect of liquid to material ratio on the yield of pepper stem essential oil

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用Design-Expert軟件，選取酶液濃度、酶處理溫度、酶解時(shí)間、液料比四個(gè)因素作為自變量，以胡椒梗精油產(chǎn)量為響應(yīng)值，采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface experiment results

2.2.2 響應(yīng)面回歸模型的建立與分析

通過Design-Expert軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，得到胡椒梗精油得率和四個(gè)因素的擬合二次多項(xiàng)式回歸方程為：

由表3方差分析結(jié)果可知，響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著性p<0.0001，為極顯著，表明該模型具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，自變量B為極顯著，A、D項(xiàng)為一般顯著，C項(xiàng)為不顯著，二次項(xiàng)BC為顯著，A2、B2、C2、D2均為極顯著，表明改模型擬合情況良好，結(jié)果可靠。四個(gè)因素對胡椒梗精油提取率影響顯著程度排序?yàn)槊柑幚頊囟龋˙）>液料比（D）>酶液濃度（A）>酶處理時(shí)間（C）。

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析Table 3 Response surface test variance analysis

2.2.3 響應(yīng)面自變量間交互作用分析

利用軟件Design-Expert模擬各因素之間交互作用的三維相應(yīng)面圖如圖5～圖10所示，由圖可以看出，因素AB、BC間交互作用曲線比較陡峭，三維效果圖中心區(qū)域有明顯凸起，表明酶液濃度和酶處理溫度、酶處理溫度和酶處理時(shí)間的交互作用對胡椒梗精油得率的影響最為顯著，其他因素間的交互作用對最終精油得率的影響較小。

圖5 酶濃度和酶處理溫度對胡椒梗精油得率交互影響響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface plot of the interaction of enzyme concentration and enzyme treatment temperature on the yield of pepper stem essential oil

圖6 酶濃度和酶處理時(shí)間對胡椒梗精油得率交互影響響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface plot of the interaction of enzyme concentration and enzyme treatment time on the yield of pepper stem essential oil

圖10 酶處理時(shí)間和液料比對胡椒梗精油得率的影響響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface plot of the effect of enzyme treatment time and liquid-to-material ratio on the yield of pepper stem essential oil

圖7 酶濃度和液料比對胡椒梗精油得率交互影響響應(yīng)面圖Fig.7 Response surface plot of the interaction of enzyme concentration and liquid-to-material ratio on the yield of pepper stem essential oil

圖8 酶處理時(shí)間和酶處理溫度對胡椒梗精油得率交互影響響應(yīng)面圖Fig.8 Response surface plot of the interactive influence of enzyme treatment time and enzyme treatment temperature on the yield of pepper stem essential oil

圖9 酶處理溫度和液料比對胡椒梗精油得率交互影響響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface plot of the interactive influence of enzyme treatment temperature and liquid-to-material ratio on the yield of pepper stem essential oil

2.2.4 最佳工藝的確定及驗(yàn)證

通過響應(yīng)面回歸方程對胡椒梗精油最佳提取工藝條件進(jìn)行預(yù)測，其結(jié)果為酶濃度103.25 g/L，酶處理溫度41.28 ℃，酶處理時(shí)間3.01 h，液料比5.23:1，預(yù)測最佳產(chǎn)率1.20%，在相同條件下實(shí)際產(chǎn)率為1.21%，實(shí)際結(jié)果與理論結(jié)果相對誤差為0.83%，表明實(shí)際結(jié)果與回歸模型吻合良好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較可靠。在相同條件下使用蒸餾水做空白對照，胡椒梗精油得率為0.80%，酶輔助水蒸氣蒸餾精油得率比水蒸氣蒸餾提高51.25%。Molica等[27]采用酶法輔助水蒸氣蒸餾法提取柑橘皮精油，在相同條件下，纖維素酶預(yù)處理后的柑橘皮精油產(chǎn)率約為對照組的兩倍；張雪松等[23]通過復(fù)合酶法制備桂花精油，在復(fù)合酶添加量為50.7 U/g，液料比為20.3:1，溫度為46 ℃，水解時(shí)間2.7 h，桂花精油得率為2.75%，比未經(jīng)酶處理時(shí)精油得率提高55.37%，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，表明本實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有較高可靠性。Nurshazana Mohamad等[28]的研究表明，通過酶處理可以有效增加精油分泌腺體的收縮，促進(jìn)精油的釋放，并且通過酶處理可以破壞細(xì)胞壁等結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞質(zhì)流出，從而增加精油產(chǎn)率。

2.3 胡椒梗精油化學(xué)成分GC-MS分析

2.3.1 胡椒梗精油GC-MS測定結(jié)果

在所設(shè)色譜條件下，胡椒梗精油的GC-MS色譜圖見圖11。采用面積歸一化法計(jì)算各組分的相對含量見表4。由圖表可知，從胡椒梗精油中分別解析出47種化合物，主要含有單萜、倍半萜、芳烴、醇類化合物、酯類化合物、酮類化合物等。胡椒梗精油含量最高組分依次為檸檬烯（19.4%）、1-石竹烯（11.2%）、β-蒎烯（10.9%）、異桉油烯醇（10.7%）、3-蒈烯（6.31%）等。

表4 胡椒梗精油化學(xué)成分Table 4 Chemical composition of pepper stem essential oil

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表5 胡椒梗精油與其他胡椒產(chǎn)品精油成分相對含量對比Table 5 Comparison of the content of pepper stem essential oil and other pepper products essential oil

2.3.2 胡椒梗精油成分比較分析

對所得胡椒梗精油化學(xué)成分表進(jìn)行分類，整理可知：胡椒梗精油包含單萜12種，倍半萜15種，萜醇11種，芳烴1種，脂肪醇1種，酯類化合物4種，酮類化合物3種。胡椒梗精油與其他胡椒產(chǎn)品精油存在相同成分，王花俊等[29]報(bào)道的黑胡椒精油含量前10的組分中，檸檬烯、石竹烯、蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯均為二者共同擁有；與房一鳴等[30]所報(bào)道的白胡椒精油成分比較，石竹烯、δ-欖香烯、蒎烯、3-蒈烯均為二者大量擁有。這表明胡椒梗精油具與其他胡椒產(chǎn)品精油具有一些相同的特點(diǎn)。

胡椒梗精油中大量存在的組分均有一定的生物活性，如胡椒梗精油中含量最高的物質(zhì)檸檬烯，具有抗菌、消炎、抗腫瘤等功效[31]；石竹烯則具有較強(qiáng)的抗癌活性，在清除自由基，抗衰老方面也有一定活性[32]；3-蒈烯具有消炎殺菌的功效[33]，在殺蟲除病害方面也有應(yīng)用。這表明胡椒梗精油具有一定的醫(yī)療及保健功效，在生物農(nóng)藥制造方面也有廣闊應(yīng)用前景。

胡椒梗精油和黑胡椒精油的共有組分1-石竹烯、(+)-檸檬烯、(-)-β-蒎烯等均為二者大量擁有，且含量較為接近，其中石竹烯是胡椒辛辣刺激風(fēng)味的主要來源，因此表明胡椒梗精油在具有黑胡椒精油辛辣風(fēng)味的基礎(chǔ)還具有其獨(dú)特風(fēng)味，在食品工業(yè)及保健行業(yè)擁有廣泛前景。胡椒梗精油與白胡椒精油共有大量組分為1-石竹烯、δ-欖香烯、(+)-檸檬烯、β-蒎烯、3-蒈烯等，且3-蒈烯含量非常接近，表明胡椒梗精油和白胡椒精油具有較多相同的活性成分，在按摩、熏香產(chǎn)品以及保健功能上胡椒梗精油可以部分替代白胡椒精油，以減少白胡椒精油需求的壓力。

3 結(jié)論

本文通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法確立了一種酶輔助水蒸氣蒸餾法提取胡椒梗精油的生產(chǎn)工藝。結(jié)果表明：

（1）經(jīng)響應(yīng)面分析，胡椒梗精油的最佳提取工藝為酶濃度103.25 g/L，酶處理溫度為41.28 ℃，酶處理時(shí)間為3.01 h，液料比為5.23:1（mL/g），在此條件下胡椒梗精油的最佳產(chǎn)率為1.21%±0.02%，在該條件下，酶輔助水蒸氣蒸餾法胡椒梗精油的產(chǎn)率比水蒸氣蒸餾法提高了51.25%。

（2）通過GC-MS分析，胡椒梗精油中共解離出47種化學(xué)物質(zhì)。其組成成分以烯萜類物質(zhì)為主，含量最高的組分依次為檸檬烯（19.4%）、1-石竹烯（11.2%）、β-蒎烯（10.9%）、異桉油烯醇（10.7%）、3-蒈烯（6.31%）等。

（3）胡椒梗中含量較高的組分均具有一定的生理及保健功效；此外，胡椒梗精油和黑胡椒精油、胡椒葉精油存在較多共有組分，使得其在具有胡椒精油的風(fēng)味的基礎(chǔ)上具有自己的獨(dú)特風(fēng)味。

本文的研究結(jié)果為胡椒梗廢棄物的綜合利用提供了思路，同時(shí)可以為胡椒梗精油的提取和綜合利用提供理論依據(jù)。