復(fù)合植物提取物對湘東黑山羊胃腸道游離氨基酸含量及其轉(zhuǎn)運(yùn)載體相對表達(dá)量的影響

徐琪翔 曹文豪 羅雙貴 謝靜靜 呂小康 朱晉佳 吳祎程 周傳社* 譚支良

(1.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，畜禽養(yǎng)殖污染控制與資源化技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，動物營養(yǎng)生理與代謝過程湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長沙 410125；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.湖南先偉實(shí)業(yè)有限公司，長沙 410016)

植物提取物由于含有酚、萜、酸、酮和醚等活性物質(zhì)，具有抗氧化、增強(qiáng)免疫力和提高生長性能等生理功能[1-2]。有研究發(fā)現(xiàn)，植物提取物能通過對鈉離子-葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)體2(sodium-glucose cotransporter 2,SGLT2)的抑制作用來減少腎臟對葡萄糖的重吸收，保護(hù)胰島β細(xì)胞，從而降低機(jī)體的葡萄糖水平[3]，說明植物提取物對動物機(jī)體相關(guān)基因具有調(diào)控作用。本試驗(yàn)所用復(fù)合植物提取物主要組成物質(zhì)為杜仲、迷迭香、枇杷葉和柿子提取物，其中杜仲葉中主要活性物質(zhì)為綠原酸、京尼平苷酸和黃酮類等，具有消炎、抗氧化和抗菌的功能[3-4]；迷迭香主要活性物質(zhì)為迷迭香酸和鼠尾草酸等，具有改善血脂、保護(hù)肝臟和提高免疫力的作用[5]；枇杷葉和柿子葉主要活性物質(zhì)為熊果酸和齊墩果酸，具有降低腸道炎癥反應(yīng)、調(diào)控腸道菌群和抗氧化作用[6-7]。

氨基酸是動物機(jī)體內(nèi)最重要的2類含氮小分子物質(zhì)之一，是蛋白質(zhì)和多肽合成的基礎(chǔ)物質(zhì)，也是動物機(jī)體內(nèi)代謝過程中重要的信號傳遞物質(zhì)[8]。胃腸道是動物營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要部位，氨基酸在胃腸道氨基酸感應(yīng)和轉(zhuǎn)運(yùn)的作用下吸收后經(jīng)血液運(yùn)輸?shù)礁闻K、肌肉和腎臟等部位進(jìn)行代謝[9]。但當(dāng)前對植物提取物在動物胃腸道氨基酸及其轉(zhuǎn)運(yùn)載體的影響方面研究較少，因此深入研究植物提取物對胃腸道游離氨基酸含量以及氨基酸感應(yīng)和轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的影響，對動物機(jī)體胃腸道氨基酸的感應(yīng)和轉(zhuǎn)運(yùn)以及植物提取物功能的研究具有重要意義。因此，本試驗(yàn)通過在湘東黑山羊飼糧中添加0.15%復(fù)合植物(杜仲葉、迷迭香葉和枇杷葉和柿子)提取物，研究其對湘東黑山羊瘤胃、回腸和盲腸游離氨基酸含量及其關(guān)鍵轉(zhuǎn)運(yùn)載體基因相對表達(dá)量的影響，旨在為植物提取物在反芻家畜養(yǎng)殖應(yīng)用提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)所用復(fù)合植物提取物添加劑由湖南某實(shí)業(yè)有限公司提供，為淡黃色粉末物質(zhì)，組成原料為枇杷葉和柿子提取物(400～600 g/kg)、迷迭香葉粉(300～400 g/kg)和杜仲葉提取物(100～200 g/kg)；有效成分含量為：酚酸類20%～30%，二萜類25%～40%，黃酮類5%～10%，五環(huán)三萜類25%～40%。試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)分組方法，選取3～4月齡、體重相近[(9.82±0.83) kg]且體況良好的雌性湘東黑山羊20頭，隨機(jī)分為2組，每組10頭。對照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加0.15%的復(fù)合植物提取物的試驗(yàn)飼糧。將復(fù)合植物提取物與精料混合后進(jìn)行飼喂，每日飼喂2次?；A(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)羔羊采用單欄飼喂，精粗料按1∶1飼喂，整個(gè)試驗(yàn)期共56 d，其中預(yù)試期14 d，正試期42 d。每日飼喂2次(06:30、18:30)，保證日剩料為投料量的5%～10%，記錄采食量，自由飲水。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 樣品采集與處理

正式試驗(yàn)結(jié)束后，山羊禁食24 h，禁水12 h，對山羊進(jìn)行屠宰，采集瘤胃液，用4層紗布過濾后于-80 ℃保存；將山羊各胃室分離，生理鹽水沖洗干凈，用載玻片剝離瘤胃黏膜2 g左右于-80 ℃保存。將山羊小腸和大腸各段分離，采集回腸和盲腸食糜于-80 ℃保存；除去腸系膜和脂肪，剪開用生理鹽水沖洗干凈，用載玻片剝離回腸中部和盲腸黏膜2 g左右于-80 ℃保存。

1.4 瘤胃、回腸和盲腸游離氨基酸含量測定

準(zhǔn)確稱量回腸和盲腸食糜2 g，加入5 mL蒸餾水，于4 ℃冰箱過夜后吸取上清液2 mL，同時(shí)取2 mL瘤胃液3 000 r/min離心5 min后，吸取上清液1 mL于離心管中，加入1 mL 8%磺基水楊酸溶液，混勻后10 000 r/min離心10 min，取上清液，0.22 μm濾膜過濾后用氨基酸分析儀(日立L8900)測定游離氨基酸的含量。

1.5 瘤胃、回腸和盲腸氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體測定

1.5.1 瘤胃、回腸和盲腸總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

1.5.2 引物設(shè)計(jì)

引物序列及參數(shù)信息引用Wu等[10]，具體信息見表2。甘油醛-3-磷酸脫氫酶為內(nèi)參基因。

表2 引物序列及參數(shù)

1.5.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析

使用Excel 2010軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，使用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05和P<0.01分別表示差異顯著和差異極顯著，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果分析

2.1 瘤胃游離氨基酸含量及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相對表達(dá)量

由表3可知，與對照組相比，飼糧添加復(fù)合植物提取物極顯著增加了山羊瘤胃中天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和脯氨酸(Pro)含量(P<0.01)，顯著增加了蘇氨酸(Thr)的含量(P<0.05)，對瘤胃其他游離氨基酸含量變化沒有顯著影響(P>0.05)。

表3 復(fù)合植物提取物對瘤胃液游離氨基酸含量的影響

由表4可知，與對照組相比，試驗(yàn)組山羊瘤胃黏膜鈣敏感受體(CASR)基因相對表達(dá)量上調(diào)了68.6%(P<0.01)，復(fù)合植物提取物對其他氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的相對表達(dá)量沒有顯著影響(P>0.05)。

表4 復(fù)合植物提取物對瘤胃黏膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相對表達(dá)量的影響

2.2 回腸游離氨基酸含量及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相對表達(dá)量

由表5可知，相對于對照組，試驗(yàn)組回腸游離Gly、Ala和精氨酸(Arg)含量極顯著增加(P<0.01)，纈氨酸(Val)含量顯著增加(P<0.05)，其他游離氨基酸含量均沒有顯著變化(P>0.05)。

表5 復(fù)合植物提取物對回腸食糜中游離氨基酸含量的影響

由表6可知，與對照組相比，添加復(fù)合植物提取物后，試驗(yàn)組回腸黏膜溶質(zhì)載體家族1成員1(SLC1A1)、溶質(zhì)載體家族1成員3(SLC1A3)基因相對表達(dá)量分別上調(diào)了162.6%和27.1%(P<0.01)，溶質(zhì)載體家族38成員2(SLC38A2)基因相對表達(dá)量上調(diào)了34.3%(P<0.05)，對其他氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的相對表達(dá)量并沒有顯著影響(P>0.05)。

表6 復(fù)合植物提取物對回腸黏膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相對表達(dá)量的影響

2.3 盲腸游離氨基酸含量及氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相對表達(dá)量

由表7可知，試驗(yàn)組盲腸Thr、Glu、Gly、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)的含量極顯著低于對照組(P<0.01)，絲氨酸(Ser)、Ala、纈氨酸(Val)、賴氨酸(Lys)的含量顯著降低(P<0.05)，2組之間其他游離氨基酸含量沒有顯著變化(P>0.05)。

表7 復(fù)合植物提取物對盲腸食糜中游離氨基酸含量的影響

由表8可知，與對照組相比，試驗(yàn)組盲腸黏膜SLC1A1基因相對表達(dá)表達(dá)量下調(diào)了43.6%和(P<0.01)，溶質(zhì)載體家族3成員2(SLC3A2)、溶質(zhì)載體家族7成員1(SLC7A1)和SLC38A2相對表達(dá)量分別上調(diào)了21.6%、29.2%和34.3%(P<0.05)，其他氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的相對表達(dá)量并沒有顯著變化(P>0.05)。

表8 復(fù)合植物提取物對盲腸黏膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相對表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 復(fù)合植物提取物對湘東黑山羊瘤胃游離氨基酸含量及黏膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相對表達(dá)量的影響

飼糧中瘤胃可降解蛋白(RDP)在瘤胃微生物分泌的酶的作用下迅速被分解為多肽和氨基酸，氨基酸在瘤胃的去路主要有合成微生物蛋白、脫氨基產(chǎn)生氨和有機(jī)酸以及脫羧基產(chǎn)生伯胺類物質(zhì)[11]，因此，瘤胃微生物和飼糧中氨基酸是影響瘤胃內(nèi)游離氨基酸的重要因素[12]。在以往的研究中認(rèn)為反芻動物與單胃動物一樣，氨基酸在小腸內(nèi)被吸收，但是隨著研究的深入，有研究指出瘤胃和瓣胃能夠參與氨基酸的吸收[13-15]，閏磊[16]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，反芻動物前胃中有相關(guān)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)，同時(shí)周英昊[17]研究發(fā)現(xiàn)瘤胃內(nèi)存在堿性氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)，但是瘤胃和瓣胃對氨基酸吸收的機(jī)制尚缺乏具體研究。氨基酸是動物機(jī)體營養(yǎng)、代謝和免疫的組成物質(zhì)，對動物機(jī)體的生理活動有著很重要的作用[12]。Asp是動物機(jī)體的非必需氨基酸，在機(jī)體內(nèi)能夠從轉(zhuǎn)氨基途徑以及草酰乙酸生成，是動物機(jī)體內(nèi)Lys、蛋氨酸(Met)等氨基酸的合成前體物[18]；Glu在動物機(jī)體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝過程中占有重要的地位，也是動物機(jī)體內(nèi)發(fā)生轉(zhuǎn)氨基反應(yīng)的主要氨基酸[19]；Pro在動物機(jī)體內(nèi)主要以Glu磷酸化后的底物合成[20]；Gly和Ala也是動物機(jī)體的非必需氨基酸，Gly主要是以Ser為底物合成[21]，而Ala主要是從丙酮酸的中間代謝產(chǎn)物而來。本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合植物提取物能夠顯著提高瘤胃游離Asp、Thr、Glu、Gly、Ala和Pro的含量，這有可能是復(fù)合植物提取物能夠促進(jìn)瘤胃微生物分泌更多的酶，增加RDP在瘤胃中的降解；同時(shí)由于Asp和Glu等氨基酸合成前體物的增加，導(dǎo)致其他氨基酸以及微生物蛋白在微生物的作用下合成的數(shù)量增加[22]。也有可能是復(fù)合植物提取物上調(diào)了CASR基因相對表達(dá)量從而促進(jìn)瘤胃分泌胃泌素[23]；胃泌素具有促進(jìn)瘤胃的運(yùn)動和瘤胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖，降低瘤胃的排空速度的功能[24]，增加飼糧在瘤胃中停留的時(shí)間，從而飼糧蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨基酸和瘤胃微生物合成微生物蛋白增加。CASR主要通過磷脂酶C(phospholipase，PLC)信號通路調(diào)控胃泌素的分泌，CASR能夠通過激活胃泌素分泌細(xì)胞(G細(xì)胞)上的受體，促進(jìn)胃酸的分泌[25]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合植物提取物能夠上調(diào)CASR基因相對表達(dá)量，這有可能是植物提取物的活性物質(zhì)能夠刺激瘤胃G細(xì)胞的增殖分化，從而提高CASR在G細(xì)胞中的表達(dá)量，但具體影響機(jī)制尚需進(jìn)一步的研究。

3.2 復(fù)合植物提取物對湘東黑山羊回腸游離氨基酸含量及黏膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相對表達(dá)量的影響

小腸是蛋白質(zhì)消化吸收的主要場所，小腸的蛋白質(zhì)來源主要有瘤胃未降解蛋白(UDP)、微生物蛋白和內(nèi)源蛋白，其中微生物蛋白是小腸蛋白質(zhì)的主要來源。其在胰腺以及微生物分泌的酶的作用下分解為肽，隨后在腸腔羧肽酶的作用下分解為氨基酸[26]，氨基酸主要在空腸近端被吸收[27]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，腸道內(nèi)游離氨基酸組成和含量受飼糧中蛋白質(zhì)水平和種類的影響，同時(shí)瘤胃內(nèi)的小肽和氨基酸含量會影響腸道內(nèi)氨基酸的消化和吸收[28]。有研究指出，植物提取物能夠提高空腸胰蛋白酶和糜蛋白酶[29]的活性以及十二指腸和空腸絨毛高度和隱窩深度比[30]，從而提高營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，復(fù)合植物提取物能極顯著提高回腸游離Gly、Ala和Arg的含量，顯著提高Val的含量，與瘤胃游離氨基酸含量相比大幅下降，說明氨基酸在十二指腸和空腸被大量吸收，流入回腸的游離氨基酸含量減少。而這4種氨基酸含量的升高則可能與植物提取物提高機(jī)體抗氧化能力和抗炎癥作用[31]有關(guān)，本課題組已有研究表明，添加此種復(fù)合植物提取物能夠顯著提高湘東黑山羊的抗氧化能力[32]。相關(guān)研究表明，由Glu、Cys和Gly組成的谷胱甘肽(glutathione，GSH)是機(jī)體抗氧化的主要物質(zhì)，而在GSH合成的過程中會產(chǎn)生Ala[33]；Val能通過一般性調(diào)控阻遏蛋白激酶2(general regulation repressor protein kinase 2，GCN2)防止機(jī)體氧化應(yīng)激以及抗炎癥的作用；而Arg能夠抑制絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路來抑制腸道的炎癥，這有可能是這4種氨基酸在回腸含量升高的原因[34]。但是本試驗(yàn)結(jié)果表明，與Ala、Gly和谷氨酰胺(Gln)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的SL38A2轉(zhuǎn)運(yùn)載體在回腸黏膜的相對表達(dá)量顯著上調(diào)，Gln在機(jī)體內(nèi)可由Vla和Glu生成，與Arg轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體在回腸黏膜的相對表達(dá)量并沒有顯著差異，而參與Glu和Asp轉(zhuǎn)運(yùn)的SLC1A1和SLC1A3轉(zhuǎn)運(yùn)載體在回腸黏膜的相對表達(dá)量極顯著上調(diào)。有研究表明，腸道氨基酸含量過高或過低都會刺激氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)[35-36]，因此本試驗(yàn)中3種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相對表達(dá)量的上調(diào)可能與回腸Ala、Gly和Val含量的升高有關(guān)，但具體是因?yàn)橹参锾崛∥锟寡趸约翱寡装Y作用導(dǎo)致氨基酸含量和相應(yīng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相對表達(dá)量的升高，還是其他的調(diào)控機(jī)制尚需要進(jìn)一步的研究。

3.3 復(fù)合植物提取物對湘東黑山羊盲腸游離氨基酸含量及黏膜氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體相對表達(dá)量的影響

雖然氨基酸的消化吸收主要發(fā)生在小腸，但還是有部分蛋白質(zhì)和氨基酸流入大腸，而氨基酸在大腸的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收受到很多因素的影響，如微生物代謝產(chǎn)物和液體的分泌等[27]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，相對于回腸游離氨基酸含量，盲腸游離氨基酸含量大幅度降低，同時(shí)試驗(yàn)組山羊盲腸游離氨基酸除組氨酸(His)和Arg含量外，其他氨基酸含量在數(shù)值上低于對照組，其中試驗(yàn)組山羊盲腸游離Thr、Glu、Gly、Try和Phe含量極顯著低于對照組，Ser、Ala、Val和Lys含量顯著低于對照組。回腸的相關(guān)數(shù)據(jù)表明，試驗(yàn)組回腸相關(guān)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的相對表達(dá)量顯著上調(diào)，說明復(fù)合植物提取物提高了試驗(yàn)組山羊游離氨基酸在小腸的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收，從而導(dǎo)致試驗(yàn)組山羊盲腸游離氨基酸含量顯著降低。同時(shí)相關(guān)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，植物提取物能夠抑制胃腸道有害菌的生長，促進(jìn)有益菌的生長[37]，由于氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收主要在小腸，同時(shí)流入盲腸的碳水化合物較少，因此氨基酸主要作為盲腸微生物的能量來源[38]，微生物對氨基酸的分解利用率提高，從而導(dǎo)致試驗(yàn)組游離氨基酸含量顯著低于對照組。盲腸相較于小腸其對氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)吸收能力大幅度降低，本試驗(yàn)結(jié)果表明，復(fù)合植物提取物對盲腸氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的調(diào)節(jié)作用并不一致，其中與Glu轉(zhuǎn)運(yùn)吸收相關(guān)的SLC1A1基因相對表達(dá)量顯著下調(diào)，與Lys轉(zhuǎn)運(yùn)吸收相關(guān)的SLC7A1基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)，且與Ala、Gly、Ser轉(zhuǎn)運(yùn)吸收相關(guān)的SLC3A2和SLC38A2基因相對表達(dá)量顯著上調(diào)。這有可能是復(fù)合植物提取物降低了盲腸游離氨基酸含量，相應(yīng)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的消耗較少，從而導(dǎo)致試驗(yàn)組中相關(guān)氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的相對表達(dá)量顯著上調(diào)。因?yàn)閺?fù)合植物提取物中的活性物質(zhì)進(jìn)入大腸的數(shù)量非常少，因此其對盲腸氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的直接作用還需要進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

① 飼糧添加0.15%復(fù)合植物提取物能夠顯著提高湘東黑山羊瘤胃和腸道中部分游離氨基酸的含量，增加機(jī)體可利用氨基酸的含量，改善機(jī)體的氨基酸營養(yǎng)。

② 飼糧添加0.15%復(fù)合植物提取物能夠顯著調(diào)控湘東黑山羊瘤胃和腸道部分氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體的相對表達(dá)量。