孕期暴露鄰苯二甲酸酯對(duì)胎盤功能的影響及其機(jī)制研究進(jìn)展

張前龍，田 英，2

1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院環(huán)境與兒童健康教育部和上海市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200092；2. 上海交通大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，上海200025

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物 （environmental endocrine disruptors，EEDs）是一類可以干擾正常內(nèi)分泌功能的化學(xué)物質(zhì)。孕期EEDs暴露對(duì)孕婦、胎兒均會(huì)產(chǎn)生影響，導(dǎo)致妊娠并發(fā)癥、低出生體質(zhì)量等不良結(jié)局［1-3］。鄰苯二甲酸酯（phthalates，PAEs）是眾多EEDs 中備受關(guān)注的一種，產(chǎn)量大且日常生活中無處不在，導(dǎo)致人體內(nèi)主要PAEs 代謝物檢出率常超過80%［4-5］，女性往往高于男性［6］。胎盤富含激素受體，對(duì)EEDs 高度敏感［7］。因PAEs 及其代謝物呈脂溶性，且胎盤的屏障作用有限，PAEs 代謝物可以透過胎盤，通過干擾激素受體影響胎盤功能［8］。胎盤對(duì)于妊娠期胎兒生長發(fā)育至關(guān)重要，其功能障礙將導(dǎo)致胎兒生長受限，甚至引起胎兒死亡［9］。本文就孕期暴露PAEs 對(duì)胎盤功能的影響及其機(jī)制做一綜述。

1 孕期PAEs暴露水平

PAEs 的結(jié)構(gòu)中，有2 個(gè)碳原子數(shù)相同或不同的烷基（R 和R′）。根據(jù)烷基側(cè)鏈碳原子數(shù)和化學(xué)特性不同，PAEs 通常分為三大類［10］。一類是長鏈PAEs，碳原子≥C7，包括鄰苯二甲酸二異癸酯（diisodecyl phthalate，DiDP）、鄰苯二甲酸二異壬酯（diisononyl phthalate，DiNP）、 鄰苯二甲酸二（2- 乙基己基） 酯［di-2（ethylhexyl）-phthalate，DEHP］、鄰苯二甲酸二正辛酯（di-n-octyl phthalate，DnOP）等，在工業(yè)中被作為增塑劑軟化聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）材料，常見于食品包裝、瓶裝水、兒童玩具、醫(yī)療用品、地板和建筑材料等，其中產(chǎn)量最大的是DEHP。其余2 類是中、短鏈PAEs，其中碳原子為C4～C6 者包括鄰苯二甲酸丁基芐基酯（benzylbutyl phthalate，BBzP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（diisobutyl phthalate，DiBP）、鄰苯二甲酸二正丁酯（di-n-butyl phthalate，DnBP）等，碳原子≤C3者包括鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP）、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（docyclohexyl phthalate，DCHP）等，主要用于油漆、油墨、黏合劑、溶劑、殺蟲劑、化妝品、香水和藥物等［11］。飲食是PAEs 的重要接觸途徑，PAEs 可以通過食品的生產(chǎn)、包裝、儲(chǔ)存和運(yùn)輸進(jìn)入食品，還可以通過PVC 等產(chǎn)品直接釋放、遷移、浸出、蒸發(fā)和磨蝕等廣泛存在于家庭環(huán)境中，孕婦可經(jīng)攝入、吸入或經(jīng)皮膚吸收暴露于該類化合物［12］。PAEs 進(jìn)入生物體內(nèi)被代謝成生物活性更強(qiáng)、毒性更大的初級(jí)或次級(jí)代謝產(chǎn)物，主要隨尿液排出體外［13］。短鏈PAEs進(jìn)入生物體后，其中一個(gè)酯鍵迅速水解，轉(zhuǎn)變?yōu)猷彵蕉姿釂熙?，即初?jí)代謝物；中、長鏈PAEs 水解為單酯后，還可以通過酶促氧化作用將鄰苯二甲酸單酯的烷基側(cè)鏈轉(zhuǎn)化為更親水的氧化產(chǎn)物，即次級(jí)代謝物［14］。盡管血液等生物樣本也可檢測到PAEs 代謝物，但因該類樣本中均存在酯酶，能促進(jìn)外源性PAEs 水解，從而降低了分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。而人體尿液中不含酯酶，且尿液中的代謝物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于血液（是其10～100 倍）［15］，因此尿液中的PAEs 初級(jí)及次級(jí)代謝物成為了評(píng)估PAEs 暴露水平的最佳生物標(biāo)志物，已廣泛應(yīng)用于孕期暴露評(píng)價(jià)。

目前，DEHP 研究報(bào)道較多，是產(chǎn)量最大的一種PAEs化合物，在歐洲和中國分別約占PAEs總量的30%和80%，而DnBP是全球應(yīng)用最廣的PAEs化合物［14］。因此，孕婦尿液中DEHP 5 種代謝物總量（sum of five DEHP metabolites，MDEHP）和鄰苯二甲酸單正丁酯（monobutyl phthalate，MnBP）最受關(guān)注。其中，MDEHP 包括鄰苯二甲酸（2-乙基己基）單酯［mono-（2-ethylhexyl）phthalate，MEHP］、鄰苯二甲酸（2-乙基-5羥基己基）單酯［mono-（2-ethyl-5-hydroxyhexyl）phthalate，MEHHP］、鄰苯二甲酸（2-乙基-5-氧己基）單酯［mono-（2-ethyl-5-oxohexyl）phthalate，MEOHP］、鄰苯二甲酸（2-乙基-5-羧基戊基）單酯［mono-2-ethyl-5-carboxypentyl phthalate，MECPP］、鄰苯二甲酸（2-羧基甲基己基）單酯［mono-2-carboxymethyl-hexylphthalate，MCMHP］。不同孕期尿液中均可檢出PAEs 代謝物，且主要代謝產(chǎn)物檢出率接近100%。孕婦尿液中PAEs 代謝物平均濃度在1～400 ng/mL之間。不同國家孕婦尿液中PAEs 代謝物總濃度和高濃度代謝物種類均有差異。亞洲國家PAEs 代謝物總濃度為74～85 ng/mL，低于歐美國家（63～534 ng/mL），且亞洲國家以中鏈PAEs 代謝物MnBP 平均濃度最高（20～47 ng/mL），而歐美國家以短鏈PAEs 代謝物鄰苯二甲酸單乙酯（monoethyl phthalate，MEP）平均濃度最高（25～386 ng/mL）。在中國孕婦尿液中，MDEHP 和MnBP 平均濃度分別在14～44 ng/mL 和20～47 ng/mL 之間。不同國家孕婦的不同孕期尿液中PAEs代謝物的濃度見表1［4-5，12，16-29］。

表1 不同國家孕婦尿液中PAEs主要代謝物的濃度Tab 1 Concentrations of major metabolites of PAEs in pregnant women urine collected from various countries

2 孕期PAEs 暴露對(duì)胎盤功能的影響及其機(jī)制

胎盤是維持胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育的重要器官。在受精后4～5 d 受精卵發(fā)育為囊胚，囊胚由位于內(nèi)部的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和外部的滋養(yǎng)外胚層組成，日后滋養(yǎng)外胚層發(fā)育為胎盤，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)發(fā)育為胎兒。滋養(yǎng)外胚層由稱為細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞（cytotrophoblast cells，CTBs） 的干細(xì)胞組成。人類在妊娠第10 日左右，早期CTBs 開始沿著2 條途徑（侵潤遷移途徑和融合途徑）分化［30］。侵潤遷移途徑中，CTBs 分化為具有侵潤能力的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞（extravilloustrophoblasts，EVTs）向母體子宮發(fā)生侵潤，并通過重鑄螺旋動(dòng)脈（spiral artery，SA）增加母體血液對(duì)胎盤的灌注，從而為胎兒的正常發(fā)育提供足夠的氧氣和營養(yǎng)物質(zhì)。融合途徑中，胎盤絨毛CTBs中有一類具有增殖分化能力的細(xì)胞，在CTBs層上發(fā)生融合形成一個(gè)多核合胞體細(xì)胞，稱為合胞滋養(yǎng)細(xì)胞（syncytiotrophoblasts，STBs）；通過持續(xù)增殖和融合，STBs排列在胎盤絨毛上，形成STBs 層作為母親直接接觸胎兒血液的屏障。CTBs通過分化出更多STBs，更新現(xiàn)有的STBs 層，使STBs 層中部分老化的細(xì)胞代謝到母體血液循環(huán)中完成自身的新陳代謝，從而實(shí)現(xiàn)胎盤的發(fā)育和成熟［31-32］。EVTs 侵潤失調(diào)可引發(fā)胎盤增生、胎盤內(nèi)分泌功能不足或穿透性胎盤等胎盤缺陷，進(jìn)而導(dǎo)致流產(chǎn)和產(chǎn)后大出血［33］。CTBs融合失調(diào)會(huì)導(dǎo)致人類胎盤STBs 數(shù)量和孕酮分泌減少，從而出現(xiàn)子癇前期和宮內(nèi)生長受限（intrauterine growth restriction，IUGR）等癥狀［34］。然而，孕期暴露PAEs 對(duì)胎盤功能影響的機(jī)制，研究尚不充分。孕期PAEs 暴露與胎盤功能異?？赡芟嚓P(guān)的機(jī)制包括侵潤/融合、氧化應(yīng)激、細(xì)胞分化/凋亡、激素分泌、脂質(zhì)積累和胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)等［30］。

2.1 侵潤/融合

因PAEs 呈脂溶性，且胎盤的屏障作用有限，其代謝物可以透過胎盤，可能對(duì)侵潤和融合過程產(chǎn)生影響，從而干擾胎盤功能［8］。Grindler 等［3］研究表明，孕婦早期暴露于PAEs，尿液中代謝物的濃度與胎盤組織中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的表達(dá)和甲基化呈負(fù)相關(guān)。鑒于EGFR在胎盤組織中最為豐富且在胎盤發(fā)育中起重要作用［35］，應(yīng)關(guān)注這些表觀遺傳修飾改變對(duì)胎盤病理學(xué)的影響。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，DEHP代謝物總量在IUGR孕婦尿液中濃度較高［36］，且與胎盤滋養(yǎng)層分化基因低表達(dá)和各種與胎盤未知功能有關(guān)的長鏈非編碼RNA 低表達(dá)相關(guān)［37-38］。早產(chǎn)兒相較于正常胎齡兒，胎盤迷路微血管密度明顯降低［39］。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，CD-1小鼠妊娠期暴露于DEHP抑制了胎盤發(fā)育，組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)胎盤迷路層減少，該層類似于人類的合胞體，包含了與人類STBs 功能相似的海綿滋養(yǎng)細(xì)胞［40］。有研究觀察ICR 小鼠不同妊娠期暴露于DEHP 對(duì)胎盤發(fā)育的影響，結(jié)果顯示妊娠中期暴露的小鼠胎盤迷路層細(xì)胞增殖率顯著下降，血竇面積明顯減小且胎盤重量明顯減輕［41］。研究［42-43］表明，MEHP 暴露能抑制EVTs 侵潤的重要蛋白——基質(zhì)金屬蛋白酶-9 （matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的活性，增加EVTs 侵潤的負(fù)調(diào)節(jié)因子——組織抑制因子基質(zhì)金屬蛋白酶-1（tissue inhibitor matrix metalloproteinase-1，TIMP-1）的表達(dá)，并通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ）相關(guān)基因表達(dá)，最終抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞（human trophoblast 8，HTR-8/SVneo）和來源于大鼠胎盤的滋養(yǎng)細(xì)胞HRP-1 的侵襲。

2.2 氧化應(yīng)激

氧化應(yīng)激涉及多種妊娠并發(fā)癥，包括先兆子癇、早產(chǎn)和妊娠糖尿病，過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和氧化應(yīng)激可導(dǎo)致胎盤發(fā)育異常［44］。研究［45］發(fā)現(xiàn)，孕婦尿液中PAEs 代謝物濃度與尿液中氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物8-異前列腺素F2α（8-iso-prostaglandin F2α，8-iso-PGF2α） 水平呈正相關(guān)。體外研究［46］表明，MEHP 可導(dǎo)致人滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo 中ROS 產(chǎn)物增加和DNA 氧化損傷，并引起氧化還原敏感基因表達(dá)差異。多個(gè)研究發(fā)現(xiàn)，MEHP可能通過在滋養(yǎng)細(xì)胞中激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號(hào)通路，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的敏感性，導(dǎo)致線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡，最終抑制細(xì)胞增殖［47-48］；而與miR-17-5p、 miR-155-5p、 miR-126-3p 相關(guān)的PI3K/AKT、PTEN、NRF2基因則介導(dǎo)了氧化應(yīng)激反應(yīng)信號(hào)通路［49］。

2.3 細(xì)胞分化/凋亡

PPARγ 信號(hào)通路是胎盤發(fā)育重要的信號(hào)調(diào)節(jié)通路之一。在滋養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)的PPARγ 通過調(diào)控滋養(yǎng)細(xì)胞分化相關(guān)基因，對(duì)胎盤的基本發(fā)育和功能發(fā)揮重要作用，包括誘導(dǎo)胎盤血管形成、血管重構(gòu)、脂肪酸運(yùn)輸和炎癥等［47，50-51］。Ahbab 等［50］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠孕期暴露于DCHP后，滋養(yǎng)層的退化、減少和不規(guī)則的血管形成可能與胎盤PPARγ 表達(dá)減少有關(guān)；而大鼠孕期暴露于DEHP后，在大鼠胎盤母胎交界區(qū)和迷路層中PPARα 和PPARγ的mRNA和蛋白表達(dá)量呈劑量依賴性升高，提示PPAR可能參與了DEHP 對(duì)大鼠胎盤的調(diào)控［51］。體外研究［47］發(fā)現(xiàn)，MEHP 作為PPARγ 激活的高親和性配體，對(duì)PPARγ轉(zhuǎn)錄活性具有“U”形劑量反應(yīng)效應(yīng)，同時(shí)還可對(duì)MAPK通路產(chǎn)生影響，共同干擾人CTBs分化。

小鼠孕期暴露于DEHP，與胎盤細(xì)胞凋亡有關(guān)的4 個(gè)關(guān)鍵基因Bax、caspase-3、caspase-8 和Bcl-2均受到影響，DEHP 通過活化caspase-3 和caspase-8，上調(diào)Bax、下調(diào)Bcl-2的mRNA和蛋白水平，誘導(dǎo)胎盤凋亡［40］。對(duì)取自正常分娩孕婦胎盤組織的絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞體外研究［47］發(fā)現(xiàn)，MEHP 可以提升caspase-3 的活性。MEHP 處理人滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo 導(dǎo)致MiR-16表達(dá)升高，并與抗凋亡基因BCL-2互補(bǔ)結(jié)合，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［49］。

2.4 激素分泌

人絨毛膜促性腺激素 （human chorionic gonadotropin，hCG）是孕期最重要的激素。在妊娠初期，hCG 的產(chǎn)生和分泌是誘導(dǎo)卵巢黃體合成孕酮的必要條件，導(dǎo)致子宮肌層松弛［47］。在妊娠的前3 個(gè)月，hCG參與了CTBs 和血管生成的融合和侵潤過程［52］。hCG 還可通過旁分泌和自分泌的方式觸發(fā)妊娠期EVTs 的分化和更替［47］。Adibi 等［37］研究發(fā)現(xiàn)，孕婦尿液中PAEs 代謝物濃度與hCG基因靶點(diǎn)低表達(dá)顯著相關(guān)，提示PAEs代謝物可能通過影響hCG 的異常分泌來干擾滋養(yǎng)細(xì)胞分化。在不同性別來源的人CTBs中，不同濃度MEHP 暴露均能減少hCGβ 的釋放，說明暴露于MEHP 會(huì)抑制滋養(yǎng)細(xì)胞的激素功能［47］。

胎盤促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropinreleasing hormone，CRH）和環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是分娩的關(guān)鍵介質(zhì)，受非典型的核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號(hào)通路調(diào)控［53］。在原代培養(yǎng)的人滋養(yǎng)細(xì)胞中，MEHP 可能通過NF-κB 信號(hào)通路提升RelB/p52 異源二聚體的核轉(zhuǎn)運(yùn)能力，從而以劑量效應(yīng)的方式增加了CRH和COX-2的mRNA 和蛋白質(zhì)豐度，進(jìn)而提前誘導(dǎo)產(chǎn)前基因的活性，導(dǎo)致早產(chǎn)［53］。

2.5 脂質(zhì)積累

在妊娠期間維持必需脂肪酸（essential fatty acid，EFA）穩(wěn)態(tài)對(duì)胎兒發(fā)育至關(guān)重要。許多EFA 穩(wěn)態(tài)蛋白受PPAR 調(diào)控［51］。大鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，DEHP 及其代謝產(chǎn)物MEHP可能通過PPAR的反式激活影響EFA穩(wěn)態(tài)，并對(duì)其轉(zhuǎn)運(yùn)體和酶產(chǎn)生下游影響［51］。經(jīng)高濃度MEHP 處理的人絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞中的PPARγ 活性增加，而經(jīng)同步處理的胎盤絨毛中發(fā)現(xiàn)脂滴積聚。這些實(shí)驗(yàn)證明，MEHP 能越過胎盤屏障影響胎盤所有細(xì)胞類型（合胞體滋養(yǎng)層、絨毛細(xì)胞滋養(yǎng)層、間充質(zhì)細(xì)胞） 的脂質(zhì)含量［47］。MEHP 暴露后，來源于大鼠胎盤的滋養(yǎng)細(xì)胞株HRP-1 中甘油糖脂和磷脂的顯著積累［43］，以及來源于人類胎盤的滋養(yǎng)細(xì)胞株JEG-3 中脂質(zhì)代謝的改變［54］，都提示了PAEs孕期暴露可能導(dǎo)致胎盤脂質(zhì)失衡。

2.6 胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)

胎盤的關(guān)鍵作用之一是將母體的營養(yǎng)物質(zhì)輸送給胎兒，同時(shí)將胎兒產(chǎn)生的代謝廢物運(yùn)回到母體以排出體外。人類胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)過程是復(fù)雜的，以一種協(xié)調(diào)的方式維持胎兒快速生長。胎盤轉(zhuǎn)運(yùn)過程受到干擾與異常的胎兒生長有關(guān)，有可能引發(fā)妊娠糖尿?。╣estational diabetes mellitus， GDM） 和胎兒生長受限 （fetal growth restriction，F(xiàn)GR）等常見的妊娠病理狀況［55］。相對(duì)分子質(zhì)量＜600 的物質(zhì)能夠通過被動(dòng)擴(kuò)散的方式穿過胎盤屏障［56］。PAEs 最大相對(duì)分子質(zhì)量不超過500，其進(jìn)入胎盤后對(duì)轉(zhuǎn)運(yùn)功能的影響報(bào)道較少。Bailey-Hytholt等［57］通過構(gòu)建類似胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞膜的脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)DEHP能與膜脂質(zhì)相互作用，被吸附并嵌入雙層膜中，從而影響母胎界面的轉(zhuǎn)運(yùn)特性。

3 總結(jié)與展望

孕婦作為特殊的易感人群廣泛暴露于PAEs。PAEs代謝物可以透過胎盤并通過多種路徑影響其功能，從而對(duì)母體和胎兒產(chǎn)生影響。當(dāng)前，孕期暴露于PAEs 對(duì)胎盤功能影響的流行病學(xué)證據(jù)仍需進(jìn)一步補(bǔ)充。胎盤與胎兒出生體質(zhì)量之比（placental-to-birth weight ratio，PFR）可作為反映胎盤功能的綜合指標(biāo)之一，PFR 低提示胎盤活性和營養(yǎng)素轉(zhuǎn)移能力強(qiáng)［5］。然而孕期PAEs 暴露對(duì)胎盤功能綜合影響的流行病研究鮮有報(bào)道，這種影響有無性別差異尚需進(jìn)一步研究。PPARγ 的調(diào)控在胎盤發(fā)育過程中起重要作用，但PAEs 對(duì)其基因表達(dá)的影響尚未完全闡明，應(yīng)進(jìn)一步探索PAEs 通過PPARγ 通路對(duì)胎盤產(chǎn)生影響的分子機(jī)制。此外，在體內(nèi)、體外胎盤毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，其染毒劑量通常較高（超過了估計(jì)的人群每日攝入量，有些甚至超過3 個(gè)數(shù)量級(jí)［58］）；應(yīng)加強(qiáng)開展在環(huán)境暴露劑量下，PAEs 暴露對(duì)胎盤病理、生理功能影響的研究。而且，目前多數(shù)研究基于DEHP 及其代謝產(chǎn)物，其他種類PAEs 的研究報(bào)道較少，尤其是近年來的新型替代品DiNP。應(yīng)進(jìn)一步關(guān)注其他PAEs 及其代謝產(chǎn)物對(duì)胎盤功能的影響，開展混合效應(yīng)機(jī)制研究。