孕期暴露鄰苯二甲酸酯對胎盤功能的影響及其機制研究進展

張前龍，田 英，2

1. 上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院環(huán)境與兒童健康教育部和上海市重點實驗室，上海 200092；2. 上海交通大學公共衛(wèi)生學院，上海200025

環(huán)境內(nèi)分泌干擾物 （environmental endocrine disruptors，EEDs）是一類可以干擾正常內(nèi)分泌功能的化學物質。孕期EEDs暴露對孕婦、胎兒均會產(chǎn)生影響，導致妊娠并發(fā)癥、低出生體質量等不良結局［1-3］。鄰苯二甲酸酯（phthalates，PAEs）是眾多EEDs 中備受關注的一種，產(chǎn)量大且日常生活中無處不在，導致人體內(nèi)主要PAEs 代謝物檢出率常超過80%［4-5］，女性往往高于男性［6］。胎盤富含激素受體，對EEDs 高度敏感［7］。因PAEs 及其代謝物呈脂溶性，且胎盤的屏障作用有限，PAEs 代謝物可以透過胎盤，通過干擾激素受體影響胎盤功能［8］。胎盤對于妊娠期胎兒生長發(fā)育至關重要，其功能障礙將導致胎兒生長受限，甚至引起胎兒死亡［9］。本文就孕期暴露PAEs 對胎盤功能的影響及其機制做一綜述。

1 孕期PAEs暴露水平

PAEs 的結構中，有2 個碳原子數(shù)相同或不同的烷基（R 和R′）。根據(jù)烷基側鏈碳原子數(shù)和化學特性不同，PAEs 通常分為三大類［10］。一類是長鏈PAEs，碳原子≥C7，包括鄰苯二甲酸二異癸酯（diisodecyl phthalate，DiDP）、鄰苯二甲酸二異壬酯（diisononyl phthalate，DiNP）、 鄰苯二甲酸二（2- 乙基己基） 酯［di-2（ethylhexyl）-phthalate，DEHP］、鄰苯二甲酸二正辛酯（di-n-octyl phthalate，DnOP）等，在工業(yè)中被作為增塑劑軟化聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）材料，常見于食品包裝、瓶裝水、兒童玩具、醫(yī)療用品、地板和建筑材料等，其中產(chǎn)量最大的是DEHP。其余2 類是中、短鏈PAEs，其中碳原子為C4～C6 者包括鄰苯二甲酸丁基芐基酯（benzylbutyl phthalate，BBzP）、鄰苯二甲酸二異丁酯（diisobutyl phthalate，DiBP）、鄰苯二甲酸二正丁酯（di-n-butyl phthalate，DnBP）等，碳原子≤C3者包括鄰苯二甲酸二乙酯（diethyl phthalate，DEP）、鄰苯二甲酸二甲酯（dimethyl phthalate，DMP）、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯（docyclohexyl phthalate，DCHP）等，主要用于油漆、油墨、黏合劑、溶劑、殺蟲劑、化妝品、香水和藥物等［11］。飲食是PAEs 的重要接觸途徑，PAEs 可以通過食品的生產(chǎn)、包裝、儲存和運輸進入食品，還可以通過PVC 等產(chǎn)品直接釋放、遷移、浸出、蒸發(fā)和磨蝕等廣泛存在于家庭環(huán)境中，孕婦可經(jīng)攝入、吸入或經(jīng)皮膚吸收暴露于該類化合物［12］。PAEs 進入生物體內(nèi)被代謝成生物活性更強、毒性更大的初級或次級代謝產(chǎn)物，主要隨尿液排出體外［13］。短鏈PAEs進入生物體后，其中一個酯鍵迅速水解，轉變?yōu)猷彵蕉姿釂熙ィ闯跫壌x物；中、長鏈PAEs 水解為單酯后，還可以通過酶促氧化作用將鄰苯二甲酸單酯的烷基側鏈轉化為更親水的氧化產(chǎn)物，即次級代謝物［14］。盡管血液等生物樣本也可檢測到PAEs 代謝物，但因該類樣本中均存在酯酶，能促進外源性PAEs 水解，從而降低了分析結果的準確性。而人體尿液中不含酯酶，且尿液中的代謝物濃度遠遠高于血液（是其10～100 倍）［15］，因此尿液中的PAEs 初級及次級代謝物成為了評估PAEs 暴露水平的最佳生物標志物，已廣泛應用于孕期暴露評價。

目前，DEHP 研究報道較多，是產(chǎn)量最大的一種PAEs化合物，在歐洲和中國分別約占PAEs總量的30%和80%，而DnBP是全球應用最廣的PAEs化合物［14］。因此，孕婦尿液中DEHP 5 種代謝物總量（sum of five DEHP metabolites，MDEHP）和鄰苯二甲酸單正丁酯（monobutyl phthalate，MnBP）最受關注。其中，MDEHP 包括鄰苯二甲酸（2-乙基己基）單酯［mono-（2-ethylhexyl）phthalate，MEHP］、鄰苯二甲酸（2-乙基-5羥基己基）單酯［mono-（2-ethyl-5-hydroxyhexyl）phthalate，MEHHP］、鄰苯二甲酸（2-乙基-5-氧己基）單酯［mono-（2-ethyl-5-oxohexyl）phthalate，MEOHP］、鄰苯二甲酸（2-乙基-5-羧基戊基）單酯［mono-2-ethyl-5-carboxypentyl phthalate，MECPP］、鄰苯二甲酸（2-羧基甲基己基）單酯［mono-2-carboxymethyl-hexylphthalate，MCMHP］。不同孕期尿液中均可檢出PAEs 代謝物，且主要代謝產(chǎn)物檢出率接近100%。孕婦尿液中PAEs 代謝物平均濃度在1～400 ng/mL之間。不同國家孕婦尿液中PAEs 代謝物總濃度和高濃度代謝物種類均有差異。亞洲國家PAEs 代謝物總濃度為74～85 ng/mL，低于歐美國家（63～534 ng/mL），且亞洲國家以中鏈PAEs 代謝物MnBP 平均濃度最高（20～47 ng/mL），而歐美國家以短鏈PAEs 代謝物鄰苯二甲酸單乙酯（monoethyl phthalate，MEP）平均濃度最高（25～386 ng/mL）。在中國孕婦尿液中，MDEHP 和MnBP 平均濃度分別在14～44 ng/mL 和20～47 ng/mL 之間。不同國家孕婦的不同孕期尿液中PAEs代謝物的濃度見表1［4-5，12，16-29］。

表1 不同國家孕婦尿液中PAEs主要代謝物的濃度Tab 1 Concentrations of major metabolites of PAEs in pregnant women urine collected from various countries

2 孕期PAEs 暴露對胎盤功能的影響及其機制

胎盤是維持胎兒宮內(nèi)生長發(fā)育的重要器官。在受精后4～5 d 受精卵發(fā)育為囊胚，囊胚由位于內(nèi)部的內(nèi)細胞團和外部的滋養(yǎng)外胚層組成，日后滋養(yǎng)外胚層發(fā)育為胎盤，內(nèi)細胞團發(fā)育為胎兒。滋養(yǎng)外胚層由稱為細胞滋養(yǎng)層細胞（cytotrophoblast cells，CTBs） 的干細胞組成。人類在妊娠第10 日左右，早期CTBs 開始沿著2 條途徑（侵潤遷移途徑和融合途徑）分化［30］。侵潤遷移途徑中，CTBs 分化為具有侵潤能力的絨毛外滋養(yǎng)層細胞（extravilloustrophoblasts，EVTs）向母體子宮發(fā)生侵潤，并通過重鑄螺旋動脈（spiral artery，SA）增加母體血液對胎盤的灌注，從而為胎兒的正常發(fā)育提供足夠的氧氣和營養(yǎng)物質。融合途徑中，胎盤絨毛CTBs中有一類具有增殖分化能力的細胞，在CTBs層上發(fā)生融合形成一個多核合胞體細胞，稱為合胞滋養(yǎng)細胞（syncytiotrophoblasts，STBs）；通過持續(xù)增殖和融合，STBs排列在胎盤絨毛上，形成STBs 層作為母親直接接觸胎兒血液的屏障。CTBs通過分化出更多STBs，更新現(xiàn)有的STBs 層，使STBs 層中部分老化的細胞代謝到母體血液循環(huán)中完成自身的新陳代謝，從而實現(xiàn)胎盤的發(fā)育和成熟［31-32］。EVTs 侵潤失調可引發(fā)胎盤增生、胎盤內(nèi)分泌功能不足或穿透性胎盤等胎盤缺陷，進而導致流產(chǎn)和產(chǎn)后大出血［33］。CTBs融合失調會導致人類胎盤STBs 數(shù)量和孕酮分泌減少，從而出現(xiàn)子癇前期和宮內(nèi)生長受限（intrauterine growth restriction，IUGR）等癥狀［34］。然而，孕期暴露PAEs 對胎盤功能影響的機制，研究尚不充分。孕期PAEs 暴露與胎盤功能異?？赡芟嚓P的機制包括侵潤/融合、氧化應激、細胞分化/凋亡、激素分泌、脂質積累和胎盤轉運等［30］。

2.1 侵潤/融合

因PAEs 呈脂溶性，且胎盤的屏障作用有限，其代謝物可以透過胎盤，可能對侵潤和融合過程產(chǎn)生影響，從而干擾胎盤功能［8］。Grindler 等［3］研究表明，孕婦早期暴露于PAEs，尿液中代謝物的濃度與胎盤組織中表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）的表達和甲基化呈負相關。鑒于EGFR在胎盤組織中最為豐富且在胎盤發(fā)育中起重要作用［35］，應關注這些表觀遺傳修飾改變對胎盤病理學的影響。流行病學研究發(fā)現(xiàn)，DEHP代謝物總量在IUGR孕婦尿液中濃度較高［36］，且與胎盤滋養(yǎng)層分化基因低表達和各種與胎盤未知功能有關的長鏈非編碼RNA 低表達相關［37-38］。早產(chǎn)兒相較于正常胎齡兒，胎盤迷路微血管密度明顯降低［39］。在動物實驗研究中，CD-1小鼠妊娠期暴露于DEHP抑制了胎盤發(fā)育，組織病理學觀察發(fā)現(xiàn)胎盤迷路層減少，該層類似于人類的合胞體，包含了與人類STBs 功能相似的海綿滋養(yǎng)細胞［40］。有研究觀察ICR 小鼠不同妊娠期暴露于DEHP 對胎盤發(fā)育的影響，結果顯示妊娠中期暴露的小鼠胎盤迷路層細胞增殖率顯著下降，血竇面積明顯減小且胎盤重量明顯減輕［41］。研究［42-43］表明，MEHP 暴露能抑制EVTs 侵潤的重要蛋白——基質金屬蛋白酶-9 （matrix metalloproteinase-9，MMP-9）的活性，增加EVTs 侵潤的負調節(jié)因子——組織抑制因子基質金屬蛋白酶-1（tissue inhibitor matrix metalloproteinase-1，TIMP-1）的表達，并通過激活過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ）相關基因表達，最終抑制人絨毛膜滋養(yǎng)層細胞（human trophoblast 8，HTR-8/SVneo）和來源于大鼠胎盤的滋養(yǎng)細胞HRP-1 的侵襲。

2.2 氧化應激

氧化應激涉及多種妊娠并發(fā)癥，包括先兆子癇、早產(chǎn)和妊娠糖尿病，過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）和氧化應激可導致胎盤發(fā)育異常［44］。研究［45］發(fā)現(xiàn)，孕婦尿液中PAEs 代謝物濃度與尿液中氧化應激的生物標志物8-異前列腺素F2α（8-iso-prostaglandin F2α，8-iso-PGF2α） 水平呈正相關。體外研究［46］表明，MEHP 可導致人滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo 中ROS 產(chǎn)物增加和DNA 氧化損傷，并引起氧化還原敏感基因表達差異。多個研究發(fā)現(xiàn)，MEHP可能通過在滋養(yǎng)細胞中激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路，增強細胞內(nèi)氧化應激的敏感性，導致線粒體功能障礙和細胞凋亡，最終抑制細胞增殖［47-48］；而與miR-17-5p、 miR-155-5p、 miR-126-3p 相關的PI3K/AKT、PTEN、NRF2基因則介導了氧化應激反應信號通路［49］。

2.3 細胞分化/凋亡

PPARγ 信號通路是胎盤發(fā)育重要的信號調節(jié)通路之一。在滋養(yǎng)細胞中表達的PPARγ 通過調控滋養(yǎng)細胞分化相關基因，對胎盤的基本發(fā)育和功能發(fā)揮重要作用，包括誘導胎盤血管形成、血管重構、脂肪酸運輸和炎癥等［47，50-51］。Ahbab 等［50］研究發(fā)現(xiàn)，大鼠孕期暴露于DCHP后，滋養(yǎng)層的退化、減少和不規(guī)則的血管形成可能與胎盤PPARγ 表達減少有關；而大鼠孕期暴露于DEHP后，在大鼠胎盤母胎交界區(qū)和迷路層中PPARα 和PPARγ的mRNA和蛋白表達量呈劑量依賴性升高，提示PPAR可能參與了DEHP 對大鼠胎盤的調控［51］。體外研究［47］發(fā)現(xiàn)，MEHP 作為PPARγ 激活的高親和性配體，對PPARγ轉錄活性具有“U”形劑量反應效應，同時還可對MAPK通路產(chǎn)生影響，共同干擾人CTBs分化。

小鼠孕期暴露于DEHP，與胎盤細胞凋亡有關的4 個關鍵基因Bax、caspase-3、caspase-8 和Bcl-2均受到影響，DEHP 通過活化caspase-3 和caspase-8，上調Bax、下調Bcl-2的mRNA和蛋白水平，誘導胎盤凋亡［40］。對取自正常分娩孕婦胎盤組織的絨毛細胞滋養(yǎng)層細胞體外研究［47］發(fā)現(xiàn)，MEHP 可以提升caspase-3 的活性。MEHP 處理人滋養(yǎng)細胞HTR-8/SVneo 導致MiR-16表達升高，并與抗凋亡基因BCL-2互補結合，誘導細胞死亡［49］。

2.4 激素分泌

人絨毛膜促性腺激素 （human chorionic gonadotropin，hCG）是孕期最重要的激素。在妊娠初期，hCG 的產(chǎn)生和分泌是誘導卵巢黃體合成孕酮的必要條件，導致子宮肌層松弛［47］。在妊娠的前3 個月，hCG參與了CTBs 和血管生成的融合和侵潤過程［52］。hCG 還可通過旁分泌和自分泌的方式觸發(fā)妊娠期EVTs 的分化和更替［47］。Adibi 等［37］研究發(fā)現(xiàn)，孕婦尿液中PAEs 代謝物濃度與hCG基因靶點低表達顯著相關，提示PAEs代謝物可能通過影響hCG 的異常分泌來干擾滋養(yǎng)細胞分化。在不同性別來源的人CTBs中，不同濃度MEHP 暴露均能減少hCGβ 的釋放，說明暴露于MEHP 會抑制滋養(yǎng)細胞的激素功能［47］。

胎盤促腎上腺皮質激素釋放激素（corticotropinreleasing hormone，CRH）和環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）是分娩的關鍵介質，受非典型的核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）信號通路調控［53］。在原代培養(yǎng)的人滋養(yǎng)細胞中，MEHP 可能通過NF-κB 信號通路提升RelB/p52 異源二聚體的核轉運能力，從而以劑量效應的方式增加了CRH和COX-2的mRNA 和蛋白質豐度，進而提前誘導產(chǎn)前基因的活性，導致早產(chǎn)［53］。

2.5 脂質積累

在妊娠期間維持必需脂肪酸（essential fatty acid，EFA）穩(wěn)態(tài)對胎兒發(fā)育至關重要。許多EFA 穩(wěn)態(tài)蛋白受PPAR 調控［51］。大鼠動物實驗研究發(fā)現(xiàn)，DEHP 及其代謝產(chǎn)物MEHP可能通過PPAR的反式激活影響EFA穩(wěn)態(tài)，并對其轉運體和酶產(chǎn)生下游影響［51］。經(jīng)高濃度MEHP 處理的人絨毛細胞滋養(yǎng)層細胞中的PPARγ 活性增加，而經(jīng)同步處理的胎盤絨毛中發(fā)現(xiàn)脂滴積聚。這些實驗證明，MEHP 能越過胎盤屏障影響胎盤所有細胞類型（合胞體滋養(yǎng)層、絨毛細胞滋養(yǎng)層、間充質細胞） 的脂質含量［47］。MEHP 暴露后，來源于大鼠胎盤的滋養(yǎng)細胞株HRP-1 中甘油糖脂和磷脂的顯著積累［43］，以及來源于人類胎盤的滋養(yǎng)細胞株JEG-3 中脂質代謝的改變［54］，都提示了PAEs孕期暴露可能導致胎盤脂質失衡。

2.6 胎盤轉運

胎盤的關鍵作用之一是將母體的營養(yǎng)物質輸送給胎兒，同時將胎兒產(chǎn)生的代謝廢物運回到母體以排出體外。人類胎盤轉運過程是復雜的，以一種協(xié)調的方式維持胎兒快速生長。胎盤轉運過程受到干擾與異常的胎兒生長有關，有可能引發(fā)妊娠糖尿?。╣estational diabetes mellitus， GDM） 和胎兒生長受限 （fetal growth restriction，F(xiàn)GR）等常見的妊娠病理狀況［55］。相對分子質量＜600 的物質能夠通過被動擴散的方式穿過胎盤屏障［56］。PAEs 最大相對分子質量不超過500，其進入胎盤后對轉運功能的影響報道較少。Bailey-Hytholt等［57］通過構建類似胎盤滋養(yǎng)層細胞膜的脂質雙層結構，發(fā)現(xiàn)DEHP能與膜脂質相互作用，被吸附并嵌入雙層膜中，從而影響母胎界面的轉運特性。

3 總結與展望

孕婦作為特殊的易感人群廣泛暴露于PAEs。PAEs代謝物可以透過胎盤并通過多種路徑影響其功能，從而對母體和胎兒產(chǎn)生影響。當前，孕期暴露于PAEs 對胎盤功能影響的流行病學證據(jù)仍需進一步補充。胎盤與胎兒出生體質量之比（placental-to-birth weight ratio，PFR）可作為反映胎盤功能的綜合指標之一，PFR 低提示胎盤活性和營養(yǎng)素轉移能力強［5］。然而孕期PAEs 暴露對胎盤功能綜合影響的流行病研究鮮有報道，這種影響有無性別差異尚需進一步研究。PPARγ 的調控在胎盤發(fā)育過程中起重要作用，但PAEs 對其基因表達的影響尚未完全闡明，應進一步探索PAEs 通過PPARγ 通路對胎盤產(chǎn)生影響的分子機制。此外，在體內(nèi)、體外胎盤毒理學實驗中發(fā)現(xiàn)，其染毒劑量通常較高（超過了估計的人群每日攝入量，有些甚至超過3 個數(shù)量級［58］）；應加強開展在環(huán)境暴露劑量下，PAEs 暴露對胎盤病理、生理功能影響的研究。而且，目前多數(shù)研究基于DEHP 及其代謝產(chǎn)物，其他種類PAEs 的研究報道較少，尤其是近年來的新型替代品DiNP。應進一步關注其他PAEs 及其代謝產(chǎn)物對胎盤功能的影響，開展混合效應機制研究。