DNA聚合酶θ在子宮內(nèi)膜癌中的表達及其臨床意義

宣貝貝，龔賽楠，劉佳麗，全 權(quán)，孟 雨，牟曉玲

1.重慶醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院，重慶 400016；2.重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，重慶 400016

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）是女性三大婦科腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%以及女性全身惡性腫瘤的7%［1］。近年來EC 的發(fā)病率在世界范圍內(nèi)逐年上升，并呈年輕化趨勢［2］。據(jù)我國國家癌癥中心統(tǒng)計，2015 年EC 發(fā)病率為63.4/10 萬，死亡率為21.8/10 萬［3］。EC 治療采用手術(shù)為主，輔以放射治療和化學(xué)治療（放化療）的綜合治療方式。雖然多數(shù)EC 患者在診斷時疾病處于早期階段，整體預(yù)后較好，但仍有15%～20%的患者在術(shù)后復(fù)發(fā)，出現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移［4］。晚期及復(fù)發(fā)性EC 由于對傳統(tǒng)的放化療不敏感導(dǎo)致其預(yù)后差［5］，5 年生存率僅為17%～30%［6］，嚴(yán)重危害女性生殖健康。EC 的發(fā)病原因至今不能明確，并且缺乏有效的治療手段及預(yù)后指標(biāo)。探討EC 的發(fā)病機制，尋找新的治療靶點及有效的治療藥物，探尋有效預(yù)后指標(biāo)，具有十分重要的意義。

機體為維持基因穩(wěn)定性，通過DNA 損傷應(yīng)答（DNA-damage response，DDR） 系統(tǒng)修復(fù)各種內(nèi)源性（活性氧、復(fù)制叉崩塌等）和外源性（紫外線、毒性物質(zhì)等）因素造成的DNA 損傷［7］，主要涉及3 條修復(fù)通路。其中同源重組（homologous recombination，HR）被認(rèn)為是唯一精確的DNA 雙鏈斷裂（double-strand breakage，DSB）修復(fù)途徑［8］；而大多數(shù)DNA 損傷修復(fù)是通過典型的非同源端連接（canonical non-homologous end joining，c-NHEJ）修復(fù)，這是一種直接依賴DNA 末端的途徑［9］；當(dāng)以上2 種修復(fù)通路發(fā)生缺陷時，DNA 損傷修復(fù)需要DNA 聚合酶θ（DNA polymerase θ，POLQ）參與的第3種途徑，最初被稱為替代末端連接（alternative endjoining，alt-EJ） 或微同源末端連接（microhomologymediated end joining，MMEJ），后來由于逐漸認(rèn)識了POLQ 在該通路的重要性被稱為聚合酶θ 介導(dǎo)的末端連接（polymerase theta-mediated end joining，TMEJ）［10］。但POLQ參與的替代末端連接過程通常容易發(fā)生易位，這是一種易出錯的修復(fù)途徑［11］。當(dāng)正常細(xì)胞中POLQ 高表達時，可能意味著細(xì)胞更傾向于以一種易出錯的途徑修復(fù)損傷DNA，細(xì)胞基因穩(wěn)定性降低，最終導(dǎo)致癌癥。DDR系統(tǒng)是正常細(xì)胞維持基因穩(wěn)定、防止發(fā)生癌變的關(guān)鍵因素，但對于腫瘤細(xì)胞而言，DDR 降低了放化療對腫瘤的殺傷力，與腫瘤耐藥及復(fù)發(fā)密切相關(guān)［12］。因此，抑制癌細(xì)胞中POLQ 表達限制了癌細(xì)胞TMEJ修復(fù)途徑，可能具有放化療增敏作用并防止耐藥的發(fā)生。已經(jīng)有研究［13-14］證明POLQ是在乳腺癌中高表達、在正常乳腺組織中低表達的基因，且抑制POLQ 表達可以顯著提高乳腺癌細(xì)胞對放療的敏感性。

然而，目前POLQ 在EC 中的表達情況未見報道。本研究通過生物信息學(xué)分析及免疫組織化學(xué)（免疫組化）方法驗證POLQ 在EC 患者中的表達情況及其臨床意義，可能為EC 提供新的基因治療靶點及預(yù)后指標(biāo)，從而有利于改善EC患者預(yù)后。

1 材料與方法

1.1 生物信息學(xué)數(shù)據(jù)下載及分析

在基因表達數(shù)據(jù)動態(tài)分析（Gene Expression Profiling Interactive Analysis，GEPIA）網(wǎng)站檢索POLQ基因在人體各器官腫瘤組織和正常組織中的表達情況。

癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫子宮內(nèi)膜癌（Uterine Corpus Endometrial Carcinoma，UCEC）項目的所有基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，包括遺傳數(shù)據(jù)、轉(zhuǎn)錄組分析和臨床信息，均從美國國家癌癥研究所基因組數(shù)據(jù)共享網(wǎng)站（http：//portal.gdc.cancer.gov）獲得。對基因表達數(shù)據(jù)進行歸一化處理，并經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)化后用于后續(xù)分析。在587 個EC 患者樣本中，35 個來自癌旁組織，552 個來自EC 組織。臨床信息包括：患者年齡、腫瘤分級、生存狀態(tài)和總生存時間。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)經(jīng)Strawberry Perl 軟件（5.30.0 版本）整理后獲得基因表達矩陣以及癌旁與癌組織配對文件，并運用R 軟件（3.5.1版本）提取POLQ單基因表達數(shù)據(jù)。通過R 軟件limma包、beeswarm 包對單基因表達數(shù)據(jù)進行分析，明確POLQ在EC 組織和癌旁組織中的表達情況并繪制散點差異圖和配對差異圖。臨床數(shù)據(jù)由R語言分析獲得POLQ受試者操作特征曲線（ROC 曲線）的最佳截斷值，將患者分為高表達組和低表達組，比較2組的預(yù)后生存情況。運用基因探針富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）軟件（4.1.0 版本）對POLQ基因進行分析，采用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計的方法，隨機組合次數(shù)設(shè)為1 000 次，其他參數(shù)設(shè)為默認(rèn)值，選取偽發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）小于0.05的富集通路。

1.2 患者臨床病理信息及隨訪數(shù)據(jù)

本研究納入了127 例2011 年3 月—2014 年12 月在重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受手術(shù)且組織病理學(xué)診斷為EC 的患者。既往或合并有其他惡性腫瘤的患者排除在外。收集患者臨床信息包括入院年齡、手術(shù)時間、手術(shù)方式、術(shù)后病理分型和分級、肌層浸潤情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤大小以及雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）表達情況。根據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO）分期系統(tǒng)確定腫瘤分期。腫瘤分級分為高分化（G1）、中分化（G2）和低分化（G3），漿液性癌以及透明細(xì)胞癌歸入G3 級腫瘤。術(shù)后每6 個月進行一次隨訪評估，隨訪時間截至2020 年9月。所有結(jié)果均通過門診或電話訪談獲得。常規(guī)的隨訪檢查包括體格檢查、實驗室檢測（血常規(guī)、肝腎功能、腫瘤標(biāo)志物CA125 和HE4），以及胸部X 光片，腹部盆腔超聲檢查、CT 或MRI。根據(jù)檢查結(jié)果確定腫瘤是否復(fù)發(fā)。總生存期（overall survival，OS）定義為從手術(shù)到死亡的時間或到最后一次隨訪時間。無病生存期（disease free survival，DFS）定義為從手術(shù)到疾病復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或最后一次隨訪日期。每位患者均簽署了知情同意書。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審查批準(zhǔn)實施（審查批號為2020-425）。

1.3 免疫組化法分析

取127位患者術(shù)中切取的腫瘤組織石蠟切片，免疫組化染色步驟具體如下：60 ℃烤片2 h，二甲苯脫蠟，抗原修復(fù)，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）洗滌5 次；每張切片滴加50～100 μL 新配制的3%過氧化氫溶液，室溫下濕盒孵育10 min，PBS 洗滌5 次；甩干組織周圍液體，加入5%牛血清白蛋白50～100 μL，室溫下濕盒孵育60 min；甩去封閉液，加入50倍稀釋的一抗50～100 μL，4 ℃濕盒孵育過夜；PBS 洗滌5 次后加入50～100 μL二抗，室溫下濕盒孵育60 min；PBS洗滌5次，加入適量DAB 顯影液；蘇木精復(fù)染、酚化、脫水、透明、封片。另收集臨床手術(shù)后病理診斷為子宮肌瘤的22 例患者的正常子宮內(nèi)膜組織，包埋切片后重復(fù)以上步驟。兔抗人POLQ 多克隆抗體購自生工生物工程上海股份有限公司，通用SP 試劑盒購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4 免疫組化評分標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化染色后切片由2位副高級職稱及以上的病理科醫(yī)師進行雙盲閱片。陽性細(xì)胞的判斷是以免疫組化后細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核中出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為標(biāo)準(zhǔn)，同時采用半定量法，即染色細(xì)胞百分比及染色強度的乘積來判斷。①陽性著色細(xì)胞數(shù)：每張切片上觀察5個高倍鏡視野（×200），計數(shù)陽性細(xì)胞百分比＜5%為0 分，5%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，76%～100%為4分。②陽性著色強度：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。兩者計分相乘即為陽性等級：0 分為陰性（-），1～4 分為弱陽性（+），5～8 分為陽性（++），9～12分為強陽性（+++）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析，運用R 軟件（3.5.1版本）繪圖。定性資料采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗進行比較；定量資料如果符合正態(tài)分布，則2組間比較采用t檢驗，否則采用Wilcoxon 檢驗（2 組） 或Kruskal-Wallis 檢驗（多組）。Kaplan-Meier 法用來進行生存分析，并用Log-rank檢驗比較組間差異。Cox多因素回歸分析用于篩選獨立預(yù)后因素。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 POLQ在人體各器官組織中的表達情況

POLQ在人體各器官腫瘤組織和正常組織中的表達譜通過GEPIA 網(wǎng)站獲得，結(jié)果（圖1）可見POLQ在多數(shù)癌癥中表達均升高，僅在睪丸癌（testicular germ cell tumor，TGCT） 中相對低表達。在EC 中，POLQ表達明顯升高。

圖1 POLQ在人體各系統(tǒng)腫瘤和正常組織中的表達情況Fig 1 Expression of POLQ in human tumors and normal tissues

2.2 POLQ 在TCGA-UCEC 數(shù)據(jù)庫中癌組織和癌旁組織的表達差異

通過分析TCGA-UCEC 數(shù)據(jù)庫中的PRKM（reads per kilobase per million mapped reads）數(shù)據(jù)，比較POLQ在EC 組織和癌旁組織中的表達水平（圖2A），并進行了配對差異分析（圖2B）；結(jié)果顯示，POLQ在EC 組織中的表達高于癌旁組織（P=0.000）。

圖2 TCGA-UCEC數(shù)據(jù)庫中POLQ在EC組織和癌旁組織的差異表達Fig 2 Differential expression of POLQ in the EC and paracancerous tissues in the TCGA-UCEC

2.3 TCGA-UCEC 數(shù)據(jù)庫中POLQ 的表達與EC 患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系

POLQ在年齡≥60 歲患者中的表達水平顯著高于其在年齡＜60歲的患者中的水平（圖3A，P=0.003）。POLQ在不同腫瘤分級中的表達有顯著差異，隨著腫瘤分級升高，POLQ 表達有上升趨勢（圖3B，P=0.000）。根據(jù)最佳截斷值，將患者分為高表達組和低表達組，生存曲線比較結(jié)果（圖3C）顯示POLQ高表達組OS較短（P=0.000）。

圖3 TCGA-UCEC數(shù)據(jù)庫中POLQ表達與患者年齡、分級以及預(yù)后的關(guān)系Fig 3 Relationship of the POLQ expression with age，grade and prognosis of the patients in the TCGA-UCEC

2.4 GSEA

富集結(jié)果（圖4）發(fā)現(xiàn)，POLQ除了參與細(xì)胞周期、堿基切除修復(fù)、錯配修復(fù)、HR等與DNA損傷有關(guān)修復(fù)通路及癌癥通路外，在P53信號通路、胰島素信號通路中也呈明顯高表達，這些通路都在EC的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要。

圖4 EC中POLQ基因通路富集圖Fig 4 Enrichment analysis of POLQ gene pathway in EC

2.5 免疫組化染色驗證POLQ在EC組織中的表達

對石蠟切片行免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)POLQ 在22 例正常子宮內(nèi)膜中多數(shù)呈弱陽性表達或不表達（圖5A、B），≥1分的比例為63.6%，≥5分的比例為13.6%，均顯著低于POLQ 在EC 組織中的比例（表1，均P＜0.05）。POLQ 在EC組織中的表達情況如圖5C、D所示。

圖5 正常子宮內(nèi)膜和EC組織石蠟切片POLQ免疫組化染色（×200）Fig 5 Immunohistochemical staining of POLQ in the paraffin sections of normal endometrium and EC tissues（×200）

表1 POLQ在正常子宮內(nèi)膜與EC組織的表達情況Tab 1 Expression of POLQ in the normal endometrium and EC tissues

2.6 POLQ與EC患者臨床特征之間的關(guān)系

比較不同臨床特征患者POLQ 的表達情況，結(jié)果（表2）顯示，POLQ 免疫組化評分≥5 分的比例在不同年齡、病理類型、腫瘤分級、肌層浸潤情況、腫瘤大小、ER/PR 表達情況的患者間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在不同腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的患者間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（均P=0.038）。POLQ 在腫瘤晚期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者中表達水平較高，提示POLQ 表達升高可能與EC 的進展和轉(zhuǎn)移有關(guān)（圖6）。

圖6 POLQ表達水平在不同分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況患者間的比較Fig 6 Comparison of POLQ expression in the patients with different stages and lymph node metastasis conditions

表2 不同臨床特征患者POLQ蛋白在EC組織中的表達情況Tab 2 Expression of POLQ protein in the EC tissues of patients with different clinical characteristics

2.7 POLQ與EC患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier 曲線（圖7） 顯示，POLQ 高表達組DFS（P=0.000）和OS（P=0.006）均顯著縮短。多因素Cox 回歸分析結(jié)果顯示，POLQ 評分是EC 患者DFS 和OS的獨立相關(guān)因素（表3）。

表3 EC患者DFS和OS的多因素Cox分析Tab 3 Multivariate Cox analysis of DFS and OS in the EC patients

圖7 不同POLQ表達水平EC患者的DFS（A）和OS（B）的Kaplan-Meier曲線Fig 7 Kaplan-Meier curves of DFS (A) and OS (B) for the EC patients with different POLQ expression levels

3 討論

在正常人體組織中，POLQ 在骨髓、胸腺、脾臟B 細(xì)胞及生發(fā)中心等組織中高表達，在睪丸組織的表達量最高，而在心、肝、肺、腎、腦、脊髓和小腸等組織中幾乎不表達［14-17］。POLQ在多種惡性腫瘤，包括在結(jié)腸、直腸、肺、胃、乳腺、卵巢和頭頸部腫瘤中的過度表達，提示POLQ 或許可以作為一項新的癌癥治療靶點［18-20］。但目前，其在EC 中的表達情況還未見報道。在本研究中，我們通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)POLQ在EC 癌旁組織中低表達，在EC 組織中高表達，并且POLQ的高表達與腫瘤低分化、患者預(yù)后不良相關(guān)。隨后我們收取了127例EC 患者腫瘤組織及22例正常子宮內(nèi)膜組織的石蠟切片進行免疫組化染色，亦發(fā)現(xiàn)POLQ 在EC 組織中顯著高表達。與生物信息學(xué)分析結(jié)果不同的是，127 例EC 患者POLQ 的表達水平與EC 分級并無明顯關(guān)系。我們推測可能與以下因素有關(guān)：①相較于TCGA-UCEC數(shù)據(jù)庫552例不同分級的EC 組織基因表達數(shù)據(jù)，127 例患者樣本量偏少，且分級分配不均。②在TCGA-UCEC 數(shù)據(jù)庫中，POLQ表達量為基因或轉(zhuǎn)錄本read數(shù)，而免疫組化染色評分是POLQ 在EC 組織中蛋白表達水平的相對表達強度。之前一項關(guān)于大腸癌［20］的研究表明，癌組織POLQ 高表達可作為獨立因素預(yù)測大腸癌患者總體存活率降低。在一項關(guān)于乳腺癌［21］的回顧性研究中POLQ 過表達及雌激素受體陰性均與腫瘤不良分化有關(guān)，而這兩者均可作為獨立因素預(yù)測患者的不良預(yù)后。本研究亦發(fā)現(xiàn)POLQ 過表達的EC 患者分期晚，DFS 和OS 更短，可以獨立預(yù)測EC患者的不良預(yù)后。

POLQ包括3 個結(jié)構(gòu)域：①解旋酶樣結(jié)構(gòu)域，含保守序列，在復(fù)制進化過程中基本保持不變。②行使功能的DNA聚合酶結(jié)構(gòu)域，包括1個非功能外切酶結(jié)構(gòu)域和3個被命名為ins1、ins2、ins3 的插入序列。③連接這2 個區(qū)域的中心區(qū)域，是一段無序序列［22］。基因信息的完整性對生命體至關(guān)重要，它依賴于準(zhǔn)確的DNA 復(fù)制和修復(fù)受損DNA 的多種機制。受損基因的錯誤修復(fù)會引發(fā)大量的突變，細(xì)胞基因信息的完整性受到破壞，最終導(dǎo)致癌癥［9］。先前的研究已經(jīng)證明微同源性介導(dǎo)的缺失通常是POLQ作用的結(jié)果［23-24］。最近的研究［10］還表明，在姐妹染色單體不能作為模板的情況下，復(fù)制相關(guān)的斷裂是通過TMEJ而不是HR來修復(fù)的。因此，POLQ是在HR缺陷細(xì)胞中產(chǎn)生微同源性介導(dǎo)缺失的主要因素。

由于已知TMEJ修復(fù)通路會產(chǎn)生基因易位，可以直觀地假設(shè)POLQ上調(diào)會導(dǎo)致癌癥。與癌癥相關(guān)的POLQ上調(diào)有2種潛在機制：①在腫瘤內(nèi)POLQ表達升高的細(xì)胞的增殖優(yōu)勢可能會導(dǎo)致癌癥發(fā)生［25］。②有研究［26-28］提出了HR途徑對POLQ表達的負(fù)調(diào)控；HR缺陷致使POLQ上調(diào)的證據(jù)來自對癌癥基因組的分析，POLQ介導(dǎo)的修復(fù)轉(zhuǎn)化為一種特定的突變特征，在乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌中的頻率增加，所有這些都與HR 缺失有關(guān)。此外，TMEJ活性的另一個特征模板插入，在具有乳腺癌易感基因1/2（breast cancer susceptibility gene 1/2，BRCA1/2）突變的乳腺癌患者的基因組中更為普遍。腫瘤抑制因子P53也會影響POLQ的表達，P53突變細(xì)胞中POLQ的表達水平比野生型細(xì)胞高［29］。本研究通過GSEA 發(fā)現(xiàn)POLQ參與細(xì)胞周期、堿基切除修復(fù)、錯配修復(fù)、HR 等多種DNA 損傷修復(fù)通路，在P53信號通路、胰島素信號通路中也明顯呈高表達，這些通路都在EC 的發(fā)生發(fā)展中至關(guān)重要，但POLQ在以上途徑中的作用機制尚需要更深入的探討。

本研究結(jié)果顯示，POLQ 在EC 組織中表達比正常子宮內(nèi)膜組織顯著升高，在晚期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的EC 患者中高表達，且POLQ 高表達是EC 患者預(yù)后不良的獨立預(yù)測指標(biāo)。POLQ 可能在EC 惡性進展中發(fā)揮重要作用，能否在EC 患者的靶向治療中發(fā)揮作用需要進一步研究及驗證。