血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A 調(diào)控人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞miRNA 的全基因表達(dá)譜分析

劉 俐，耿子龍，陳嘉煥，張沙沙，張 冰

上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院，系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240

血管新生是指在已有的血管基礎(chǔ)上形成新血管的過程［1］，該過程往往與許多癌癥和心血管疾病的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelia growth factor，VEGF）是最重要的生長(zhǎng)因子之一［2］，已有研究表明VEGF 及其相關(guān)受體VEGFR （VEGF receptor）在調(diào)節(jié)血管形成的過程中起著關(guān)鍵作用。其二者的結(jié)合可激活下游信號(hào)通路，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、遷移與血管形成［3］。VEGF 家族包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE 和胎盤生長(zhǎng)因子（placental growth factor，PIGF）［4］。VEGFA 是該家族中誘導(dǎo)血管形成作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生長(zhǎng)因子，是血管發(fā)生和造血系統(tǒng)中的關(guān)鍵調(diào)控因子［5］。

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類進(jìn)化上高度保守的非編碼單鏈小RNA，長(zhǎng)度為18～25 個(gè)核苷酸［6］，結(jié)合靶mRNA 的3′端非翻譯區(qū)（3′-untranslated region，3′-UTR）后，可降解靶mRNA 或抑制其翻譯。成熟的miRNA 能在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工修飾等階段調(diào)控基因表達(dá)［7］。miRNAs參與多種細(xì)胞過程，如分化、細(xì)胞周期調(diào)控、代謝和凋亡等。近年來miRNA 異常表達(dá)已被證實(shí)與血管新生相關(guān)疾病有關(guān)，如部分癌癥和心血管疾?。?-9］。因此，探究miRNA 對(duì)血管新生的調(diào)控能夠幫助人們更深入地了解微血管異常生長(zhǎng)性疾病的發(fā)生機(jī)制，為相關(guān)疾病的治療提供新的思路和靶標(biāo)。本課題組前期研究［10］已證實(shí)，VEGFA 刺激能引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）轉(zhuǎn)錄水平顯著變化，共發(fā)現(xiàn)874 個(gè)mRNAs 和61 個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）發(fā)生顯著差異表達(dá)。但是，與IncRNA 和mRNA 關(guān)系密切的miRNA 在VEGFA 刺激后的變化尚未清晰。

基于此，本研究探索在VEGFA 刺激下HUVEC 內(nèi)miRNA 的動(dòng)態(tài)性，分析動(dòng)態(tài)表達(dá)的miRNA 與其靶基因的調(diào)控，并討論miRNA與血管新生的調(diào)控關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 HUVEC培養(yǎng)及體外刺激

從美國(guó)Lonza 公司購(gòu)買的原代HUVEC 在EGM2 完全培養(yǎng)基（CC-3162，Lonza，美國(guó)）中生長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)前1 d，將HUVEC用全培養(yǎng)基鋪板，待細(xì)胞融合度達(dá)90%左右時(shí)換成低血清無生長(zhǎng)因子培養(yǎng)液（EBM2+1%血清）；過夜饑餓培養(yǎng)使細(xì)胞的VEGFA 耗盡，第2 日加入50 ng/mL 的VEGFA-165（VEGFA 最主要的活性剪切體）刺激，在添加VEFGA-165后的0（未處理）、1、4和12 h收集細(xì)胞用于下游分析。

1.2 miRNA的獲取與測(cè)定

使用具有柱上脫氧核糖核酸酶Ⅰ消化功能的PurelinkTMmiRNA 試劑盒（Life Technologies，美國(guó)）收集HUVEC 的miRNA。使用nCounter Human Ⅴ2 miRNA表達(dá)測(cè)定試劑盒（Nano String Technologies，美國(guó)），檢測(cè)818 條帶注釋的人類miRNA 的探針，即每個(gè)時(shí)間點(diǎn)做2 組生物學(xué)重復(fù)，并對(duì)每組獲取的miRNA 進(jìn)行測(cè)定。

1.3 差異性表達(dá)miRNA的分析

NanoString nCounter 分析可測(cè)量818 種內(nèi)源性miRNA。此外，還有6 個(gè)陽(yáng)性對(duì)照探針、6 個(gè)陰性對(duì)照探針、5 個(gè)管家對(duì)照探針以及5 個(gè)插入對(duì)照探針。DESeq R包［11］用于數(shù)據(jù)歸一化和差異性表達(dá)分析。去除計(jì)數(shù)值在任何時(shí)間點(diǎn)均小于陰性對(duì)照平均計(jì)數(shù)值的內(nèi)源性miRNA。使用Wald成對(duì)檢驗(yàn)；與0 h 比較，P＜0.05 的miRNA 作為差異性表達(dá)miRNA（miDEGs），并根據(jù)其瞬時(shí)表達(dá)模式將miDEGs分為3個(gè)簇。

1.4 miRNA的靶基因預(yù)測(cè)

由于檢測(cè)得到的miDEGs 中多數(shù)miRNA 未曾報(bào)道，因此其可能的功能需要通過對(duì)下游靶基因做功能預(yù)測(cè)分析。miRTargetLink Human 是一個(gè)在線的以交互作用網(wǎng)絡(luò)形式提供人源miRNA-mRNA 相互作用的詳細(xì)信息網(wǎng)站。使用miRTargetLink Human網(wǎng)站默認(rèn)的設(shè)置，預(yù)測(cè)miRNA的靶基因。以查詢miR-221 靶mRNA 為例：點(diǎn)擊“search by microRNA”，填寫“miRNA-221”，選擇“hsa-miRNA-221-3p”，網(wǎng)站會(huì)自動(dòng)呈現(xiàn)出互作網(wǎng)絡(luò)，包括64 個(gè)強(qiáng)關(guān)系的互作、293 個(gè)弱關(guān)系的互作、91 個(gè)預(yù)測(cè)（未經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)）的互作關(guān)系。

1.5 miRNA功能分析

使用DAVID（Database for Annotation，Visualization and Integrated Discovery）資源庫(kù)［12］對(duì)VEGFA 刺激后差異表達(dá)的miRNA 進(jìn)行基因本體數(shù)據(jù)庫(kù)（gene ontology，GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析。綜合miDEGs 的靶基因交集，根據(jù)GO 注釋中的生物學(xué)過程進(jìn)行注釋層次分類和富集分析，用Fisher精確分析，得到基因集合相對(duì)于背景具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的高頻率注釋；基于KEGG的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析預(yù)測(cè)miDEGs的靶基因功能，從而推導(dǎo)上游miDEGs 相關(guān)功能。以P＜0.05 為顯著性閾值。

1.6 miDEGs-靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

構(gòu)建miDEGs與其靶基因調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)可以更直觀地顯示miDEGs 與靶基因互作關(guān)系，尋找關(guān)鍵miDEGs。使用Cytoscape 軟件構(gòu)建miDEGs-靶基因相互作用網(wǎng)絡(luò)，并計(jì)算網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的連接（degree）值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次，所得的數(shù)據(jù)使用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用負(fù)二項(xiàng)分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)驗(yàn)證。所有數(shù)據(jù)采用±s表示，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 VEGFA刺激引起HUVEC中miRNA表達(dá)的改變

基于NanoString結(jié)果，共計(jì)有173個(gè)miRNA表達(dá)。與0 h（未處理）相比，在VEGFA 刺激后1、4 和12 h，有39 個(gè)miRNA 的表達(dá)量發(fā)生了顯著差異性變化（絕對(duì)差異倍數(shù)≥2，P＜0.05）。使用miRTargetLink Human在線平臺(tái)依次查找這39個(gè)miDEGs的靶基因，共計(jì)有129個(gè)靶mRNA（圖1），其中有17.05%（22/129）的mRNA 在我們前期基于相同HUVEC 血管新生模型的RNA-Seq 數(shù)據(jù)［10］中呈差異表達(dá)。

圖1 miDEGs的靶基因Fig 1 Target genes of miDEGs

根據(jù)這4個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量的不同，將相同變化趨勢(shì)的miRNA聚類在一起（圖2，矯正P＜0.01；n=2）。

圖2 差異性表達(dá)miRNAs（miDEGs）的熱圖Fig 2 Heat map of differentially expressed miRNAs(miDEGs)

2.2 miDEG靶基因功能和通路的富集分析

結(jié)果顯示這些miDEGs在細(xì)胞增殖正調(diào)控、細(xì)胞缺氧應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞遷移正調(diào)控、傷口愈合、上皮細(xì)胞增殖正調(diào)控、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活、內(nèi)皮細(xì)胞增殖正調(diào)控、血管形成模式?jīng)Q定、血管網(wǎng)形成、血管新生正調(diào)控等過程富集（圖3）。同樣使用DAVID 在線平臺(tái)，以P＜0.05 為顯著性閾值，差異表達(dá)miRNA所富集的KEGG通路有癌癥中的miRNAs、FOXO（Forkhead box）信號(hào)通路、細(xì)胞周期、低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）信號(hào)通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3 kinase/protein kinase B，PI3K/PKB，PI3K/AKT）信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、Janus 激酶（Janus kinase，JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄活化子（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號(hào)通路（圖4）。

圖3 miDEGs靶基因GO功能分析Fig 3 GO function analysis of target genes of miDEGs

圖4 miDEGs靶基因的KEGG通路分析Fig 4 KEGG pathway analysis of target genes of miDEGs

GO 功能富集和KEGG 通路富集分析證明miDEGs 的靶基因參與細(xì)胞增殖和血管新生。VEGFA 刺激后，胞內(nèi)多種生理過程和信號(hào)通路受到影響，與靶基因結(jié)合的miRNAs也隨之差異性表達(dá)。

2.3 差異性表達(dá)miRNA與靶基因互作關(guān)系

圖5 中綠色菱形代表miDEGs，紅點(diǎn)代表差異性表達(dá)的預(yù)測(cè)靶基因，藍(lán)點(diǎn)表示非差異性表達(dá)的預(yù)測(cè)靶基因。每個(gè)節(jié)點(diǎn)的大小對(duì)應(yīng)于它與網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點(diǎn)的連接邊的數(shù)目。差異性表達(dá)miRNA 與每個(gè)預(yù)測(cè)靶基因之間連線的顏色表示基因表達(dá)的相關(guān)性，由皮爾森相關(guān)系數(shù)來定量，黃色和灰色分別表示正相關(guān)和負(fù)相關(guān)。整個(gè)網(wǎng)絡(luò)由156個(gè)節(jié)點(diǎn)和337 條連接邊組成，包含39 個(gè)miDEGs 和22 個(gè)差異表達(dá)的靶基因。根據(jù)miDEGs degree的值并基于前期的研究，我們挑選并提取了3 個(gè)miDEGs ［（miR-21（degree=29），miR-24 （degree=18），miR-221 （degree=28）］的子網(wǎng)絡(luò)。

圖5 差異性表達(dá)miRNAs和它們靶基因的互作網(wǎng)絡(luò)Fig 5 Network of miDEGs and their target genes

miR-21 在多種實(shí)體瘤中高表達(dá)，也是最早確認(rèn)的可促進(jìn)癌癥的miRNAs之一，它靶向許多與增殖、凋亡和侵襲相關(guān)的腫瘤抑制基因［13］。miR-21 在HUVEC 中結(jié)合靶基因PTEN（phosphatase and tensin homolog）和SMAD7（SMAD family member 7） 的mRNA，即通過負(fù)調(diào)控PTEN和SMAD7的蛋白表達(dá)，調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和侵襲，進(jìn)而影響血管新生［14］。我們的靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)：PTEN 是miR-21 的靶基因。miR-221 表達(dá)在4 h 時(shí)達(dá)到最高，與靶基因ETS1和PIK3R1分別呈正調(diào)控與負(fù)調(diào)控關(guān)系。miR-221 可通過靶向轉(zhuǎn)錄因子ETS1抑制血管新生［15］，且差異表達(dá)的ETS1也在4h 時(shí)達(dá)到最高值［10］。miR-221在1h時(shí)表達(dá)量最低，差異表達(dá)的PIK3R1在1h時(shí)表達(dá)量也最低，靶向PIK3R1可以控制VEGFA 下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。

2.4 miR-107和miR-21在HUVEC中受VEGFA調(diào)控

腫瘤的生長(zhǎng)遷徙與血管新生密切相關(guān)。miR-107的異常表達(dá)會(huì)影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展［16-17］，目前已知在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中上調(diào)的miR-107 可以抑制VEGFA 的表達(dá)和血管新生［18］，而HUVEC 中miR-107 和VEGFA 的調(diào)控關(guān)系還沒有相關(guān)研究報(bào)道。我們利用體外刺激模型發(fā)現(xiàn)，VEGFA 刺激可以引起miR-107表達(dá)量在1 h時(shí)稍下降，在4 h 時(shí)迅速上調(diào)。靶基因預(yù)測(cè)顯示miR-107 與其靶向的CDK6顯示強(qiáng)關(guān)系；在之前研究DEGs 時(shí)，CDK6表達(dá)在4 h 達(dá)到最高值后逐漸減少［10］。此結(jié)果提示在外源VEGFA 刺激后，可與CDK6結(jié)合的miR-107 的表達(dá)量可能在4 h 達(dá)到較高水平，miR-107 靶向CDK6導(dǎo)致其在4 h之后開始減少，并影響內(nèi)源VEGFA 的表達(dá)。外源VEGFA 刺激后miR-21 的表達(dá)在4 h 時(shí)顯著上升，靶基因互作關(guān)系顯示差異性表達(dá)的miR-21與內(nèi)源VEGFA呈負(fù)相關(guān)。在此研究中我們發(fā)現(xiàn)了新的可能調(diào)控血管新生的miR-107 和miR-21。以上研究結(jié)果提示在血管新生中VEGFA可能通過改變miRNA來刺激血管生成。

3 討論

心血管疾病和癌癥是造成人類死亡的兩大主要原因，而血管新生是上述2類疾病發(fā)生發(fā)展過程中重要的生物學(xué)過程。miRNA 在細(xì)胞增殖、分化、凋亡等過程中具有重要作用，也參與了其2 類疾病的發(fā)生發(fā)展［19］。miRNA 差異性表達(dá)屬于異常表達(dá)中的一種，是許多疾病研究中的研究熱點(diǎn)和突破口［20］。在本研究中，通過對(duì)VEGFA 刺激后差異性表達(dá)的miRNA 進(jìn)行研究討論，在預(yù)測(cè)其靶基因的基礎(chǔ)上使用GO 和KEGG 分析，推測(cè)這些miRNA 可能的生物學(xué)功能，并進(jìn)一步結(jié)合生物信息學(xué)軟件，以網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出整體互作的形式，探究miRNA 在調(diào)控VEGFA 下游基因表達(dá)中的作用，為進(jìn)一步理解血管新生與miRNA的關(guān)系提供幫助。

VEGFA 刺激后miDEGs 的靶基因中有22 個(gè)在我們前期基于相同HUVEC 血管新生模型的RNA-Seq 數(shù)據(jù)中差異表達(dá)（P＜0.001，χ2檢驗(yàn)），這也佐證了我們前期研究的結(jié)果。它們分別是DNMT3B、KAT2B、NFIA、PAK1、SIRT1、BCL6、TNFAIP3、IL6、MCL1、PIK3R1、MXD1、ICAM1、VEGFA、BBC3、CDK6、MYCN、ETS1、TMED7、HK2、DDIT4、PPARA、PRDM1。其中，ETS1 是內(nèi)皮細(xì)胞主轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可與啟動(dòng)子、增強(qiáng)子結(jié)合激活內(nèi)皮基因促進(jìn)血管新生［21］。課題組前期研究［10］發(fā)現(xiàn)，ETS1在VEGFA刺激下也差異性表達(dá)。血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生需要ETS1 介導(dǎo)的VEGFA 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來釋放暫停的RNA 聚合酶Ⅱ（RNA polymerase Ⅱ，RNAPⅡ）。VEGFA 的刺激能夠增加ETS1 的乙?；?，增強(qiáng)ETS1 與溴結(jié)構(gòu)域蛋白4（bromodomain containing 4，BRD4）的結(jié)合，促進(jìn)RNAPⅡ的轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而驅(qū)動(dòng)血管新生［22］。

VEGFA 在腫瘤生長(zhǎng)和血管形成的過程中具有重要作用，多種環(huán)境和細(xì)胞刺激因素可導(dǎo)致VEGFA 的產(chǎn)生。VEGFA的刺激不僅會(huì)引起miRNA的差異性表達(dá)，這些差異表達(dá)的miRNA 也可通過靶基因反過來影響VEGFA 的表達(dá)或者調(diào)控血管新生。模型中差異表達(dá)的miR-21 被證實(shí)與心臟疾病密切相關(guān)。miR-21在心臟衰竭過程中表達(dá)升高，通過靶向側(cè)支發(fā)芽因子同源物1 （sprouty RTK signaling antagonist 1， SPRY1） 蛋 白 激 活 ERK（extracellular regulated protein kinase）-MAPK 信號(hào)通路，可引起心臟纖維化和心肌肥厚［23］；miR-221/22 簇可通過負(fù)調(diào)控促血管生成因子C-KIT （KIT proto-oncogene，receptor tyrosine kinase）、 內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）來抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成能力，eNOS 在控制血管穩(wěn)態(tài)、滲透性和舒張等方面具有重要作用［24-25］。miR-221/22 簇也可靶向轉(zhuǎn)錄因子ETS1、STAT5 來抑制血管新生［15］；TMED7是miR-24 的靶基因，在前期VEGFA 刺激模型中TMED7也差異性表達(dá)［10］。miR-24還可通過抑制轉(zhuǎn)錄因子GATA2（GATA binding protein 2）和p21 活化激酶（p21-activated kinase，PAKs）的表達(dá)，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和損傷血管，進(jìn)而導(dǎo)致心肌梗死［26］。但目前沒有文獻(xiàn)報(bào)道靶基因TMED7與血管新生的關(guān)系，我們推測(cè)VEGFA 的刺激在一定程度上可影響miR-24 與TMED7間互作，改變TMED7 在細(xì)胞分泌物的生物合成過程，包括加工和翻譯后修飾，進(jìn)而影響心臟發(fā)育。

近年來越來越多研究表明miRNA 參與了VEGFA 調(diào)控相關(guān)的腫瘤血管形成。由于miRNA 的表達(dá)具有時(shí)序性［27］，我們猜想miRNA的調(diào)控也具有一定的時(shí)序性，即早期通過轉(zhuǎn)錄因子、晚期通過功能基因參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。我們的miDEGs 靶基因預(yù)測(cè)中發(fā)現(xiàn)，miR-21-5p、miR-22-3p、miR-29b-3p 顯示與SP1（SP1 transcription factor）強(qiáng)關(guān)系。SP1 是VEGFA轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)因子，與抑癌基因VHL（von Hippel-Lindau tumor suppressor）結(jié)合后會(huì)抑制SP1對(duì)VEGFA 啟動(dòng)子的調(diào)控，從而導(dǎo)致VEGFA 的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平降低［28］。因此我們推測(cè)miR-21-5p、miR-22-3p、miR-29b-3p 可能通過抑制轉(zhuǎn)錄因子SP1，減弱其促進(jìn)VEGFA轉(zhuǎn)錄的作用，抑制腫瘤血管形成；miRNA 晚期參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，主要是通過形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC） 再與靶mRNA結(jié)合抑制靶基因表達(dá)。多種miRNA 能夠通過抑制靶基因表達(dá)來影響VEGFA 下游信號(hào)的傳遞，從而調(diào)節(jié)腫瘤的血管新生。有研究［29］表明，促進(jìn)VEGFA轉(zhuǎn)錄的miRNA 有Let-7、miR-103、miR-107 等。Let7 家族是腫瘤抑制miRNA，其中l(wèi)et-7f、7e、7g 在我們模型中4 h 時(shí)表達(dá)量均顯著增加。并且Let-7 與我們發(fā)現(xiàn)的VEGFA 新的調(diào)控因子miR-107 之間存在互相作用，miR-107 可能通過結(jié)合let-7 而降低其穩(wěn)定性，促進(jìn)降解［30］；MXD1 是腫瘤抑制因子，已知miR-19b可以通過靶向MXD1促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移［31］。miR-19b 的表達(dá)在VEGFA 刺激后逐漸增加并在12 h時(shí)達(dá)到最高，可能是在晚期通過MXD1調(diào)控血管新生。

差異表達(dá)的miRNA 所富集的信號(hào)通路中大多都與血管新生密切相關(guān)。例如，當(dāng)腫瘤微環(huán)境缺氧時(shí)，激活的HIF-1α 會(huì)促進(jìn)VEGFA基因的上調(diào)表達(dá)［32］。VEGFA 與配體VEGFR 結(jié)合后會(huì)引發(fā)下游細(xì)胞信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，如PI3K/AKT 通路，當(dāng)VEGFR2 活化PI3K 后，3，4，5 三磷酸磷脂酰肌醇［phosphatidylinositol（3，4，5）-triphosphate，PIP3］與AKT 結(jié)合，參與細(xì)胞增殖、遷移、存活和血管生成［33］。AKT 也可磷酸化FOXO1，后者是內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管新生的重要調(diào)節(jié)因子［34］。人們基于以往的研究成果，通過靶向VEGFA 開發(fā)了許多抗血管新生的藥物，如貝伐珠單抗、雷莫蘆單抗、酪氨酸激酶抑制劑等［35］。但即使聯(lián)合用藥患者還是會(huì)出現(xiàn)預(yù)后較差或耐藥等情況。因此研究miRNA 調(diào)節(jié)VEGFA下游基因表達(dá)變化是非常有意義的，這些差異表達(dá)miRNA 及其靶基因可能成為尋找新的血管新生過程中重要調(diào)控因子和治療靶點(diǎn)。