靶向凝血因子FⅨa-FⅧa復(fù)合物結(jié)合位點(diǎn)的新型抗栓抗體

孫天瑤，蔣時(shí)楓，徐 沁，劉俊嶺，黨素英#，樊雪梅#

1.上海交通大學(xué)生物化學(xué)與分子細(xì)胞生物學(xué)系，上海 200025；2.上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院生物工程系，上海 200240

血栓栓塞性疾病是一類(lèi)以動(dòng)靜脈和微血管血栓形成或栓塞為特點(diǎn)的臨床常見(jiàn)疾??；血栓形成后血流受阻，或栓子脫落導(dǎo)致下游血流中斷，將會(huì)造成組織器官的缺血和壞死［1］。全球約有1 790萬(wàn)人死于心血管疾病，占全球死亡人數(shù)的31%［2］。血栓形成是引發(fā)各類(lèi)嚴(yán)重心腦血管疾病的重要因素，血栓性疾病已成為當(dāng)今社會(huì)威脅人類(lèi)健康和生命的首要原因［1］。血栓栓塞性疾病的主要治療手段是抗栓治療，包括抗凝、抗血小板以及溶栓［3］。其中，抗凝治療主要通過(guò)抑制凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)中不同的凝血因子阻斷凝血過(guò)程［4］。目前，臨床上使用的抗凝藥物有肝素及其衍生物、維生素K 拮抗劑（如華法林）［5］、小分子抑制劑（利伐沙班、達(dá)比加群等），均可作用于凝血瀑布的共同凝血途徑（凝血因子Ⅱa、Ⅹa），難以避免對(duì)生理性止血功能產(chǎn)生影響，因而這些藥物存在嚴(yán)重的出血危險(xiǎn)［6］，特別是腦出血［7-8］。由于內(nèi)源性凝血途徑與病理性血栓形成密切相關(guān)而非止血功能所必需［9］，內(nèi)源性凝血因子的選擇性抑制劑已成為新型抗凝血藥物研究的熱點(diǎn)［10］。

凝血因子Ⅸa（coagulation factor Ⅸa，F(xiàn)Ⅸa）是內(nèi)源性凝血途徑中關(guān)鍵的凝血因子，是唯一可溶形式的凝血蛋白［11-12］。FⅨ可以在聚集的血小板上由FⅪa 直接激活成為FⅨa，F(xiàn)Ⅸa 能夠有效地從組織因子承載細(xì)胞擴(kuò)散到血小板，成為凝血鏈起始和放大階段之間的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4］。FⅨa 通過(guò)形成FⅨa-FⅧa 復(fù)合物激活FⅩ，該過(guò)程的速度是組織因子（tissue factor，TF）-FⅦa 復(fù)合物的50 倍以上［13］，同時(shí)也是凝血酶產(chǎn)生的限速步驟［14-16］。Lollar等［17］在體外證明了FⅨa 活性位點(diǎn)抑制劑（FⅨai）可抑制凝血反應(yīng)；Benedict 等［18］在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中證明了FⅨai 可以預(yù)防血栓形成但對(duì)生理性止血影響較小。因此，F(xiàn)Ⅸa 被認(rèn)為是抗血栓形成的安全靶標(biāo)［19-21］。目前多種針對(duì)FⅨa 的抑制劑正在被開(kāi)發(fā)，包括小分子抑制劑、大分子競(jìng)爭(zhēng)性活性位點(diǎn)阻斷抑制劑、單克隆抗體、RNA適配體等［22］。

本課題組在此研究中制備了一株以FⅨa-FⅧa為靶點(diǎn)的高親和性單克隆抗體FⅨa-4，F(xiàn)Ⅸa-4 不直接與FⅨa 的底物催化位點(diǎn)結(jié)合，而是占據(jù)了FⅨa 和FⅧa 的結(jié)合區(qū)域，針對(duì)該作用位點(diǎn)的新型抑制劑具有良好的抗凝作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞來(lái)源 BALB/c 小鼠、裸鼠均為SPF級(jí)，購(gòu)自蘇州西山生物科技有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（滬）2018-0003。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)科部飼養(yǎng)在SPF 屏障系統(tǒng)中，實(shí)行嚴(yán)格的微生物學(xué)控制，使用許可證號(hào)為SCXK（滬）2018-0003。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均符合倫理規(guī)范。骨髓瘤細(xì)胞SP2/0來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，目錄號(hào)為T(mén)CM18。

1.1.2 主要試劑及儀器 半固體培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)STEMCELL 公司，完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、聚乙二醇（PEG）、四甲基十五烷（pristane） 購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，人凝血因子FⅨa、FⅩ購(gòu)自美國(guó)Enzyme Research Laboratories 公司，活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time，APTT）試劑、凝血酶原時(shí)間（prothrombin time，PT）試劑、Owren′s veronal緩沖液（Owren′s veronal buffer， OVB） 購(gòu)自德國(guó)Siemens 公司，凝血酶、磷脂酰膽堿和磷脂酰絲氨酸混合物（PC/PS）購(gòu)自法國(guó)Hyphen Biomed 公司，蛋白G 瓊脂糖樹(shù)脂購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司，人凝血因子FⅧ購(gòu)自上海萊士血液制品股份有限公司，ELISA-TMB 顯色液購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，正常人混合血漿購(gòu)自美國(guó)Instrumentation Laboratory 公司，SPECTROZYME?FⅨa發(fā)色底物購(gòu)自加拿大Biomedica Diagnostics 公司，蝰蛇毒液（Russell′s viper venom，RVV） 購(gòu)自法國(guó)Diagnostica Stago 公司，S2765 發(fā)色底物購(gòu)自意大利Chromogenix 公司，HRP 標(biāo)記的鼠源二抗購(gòu)自美國(guó)Jackson Immuno Research Laboratories公司。

APTT 和PT 儀器（STart 4 fibrinometer） 購(gòu)自法國(guó)Diagnostica Stago 公司，酶標(biāo)儀（type1530） 購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 制備以FⅨa為靶點(diǎn)的單克隆抗體

1.2.1 免疫小鼠及細(xì)胞融合 免疫SPF級(jí)BALB/c雄性小鼠，6～8周齡4只。初次免疫將FⅨa抗原與弗氏完全佐劑混合，F(xiàn)Ⅸa 終濃度為100 μg/100 μL，2 只足墊各注射50 μg/50 μL；第2 次免疫，將弗氏完全佐劑替換為弗氏不完全佐劑；第3 次免疫，F(xiàn)Ⅸa 抗原用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）稀釋至100 μg/100 μL，進(jìn)行腹腔注射；第4 次免疫，即加強(qiáng)免疫，以100 μg/100 μL 劑量進(jìn)行尾靜脈注射。共進(jìn)行4 次免疫，每次免疫間隔2周。

加強(qiáng)免疫后第3日取免疫小鼠的脾細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞SP2/0在PEG作用下進(jìn)行細(xì)胞融合，獲得雜交瘤細(xì)胞。

1.2.2 抗體陽(yáng)性細(xì)胞株篩選和克隆化 雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)7 d 后， 采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）進(jìn)行抗體陽(yáng)性檢測(cè)。在ELISA板中包被抗原FⅨa 0.1 μg/100 μL，37 ℃孵育1.5 h；再用2%牛血清白蛋白37 ℃封閉1 h；然后加入細(xì)胞培養(yǎng)上清液，37 ℃孵育1.5 h；接著加入鼠源二抗，37 ℃孵育30 min；最后加入顯色底物TMB 室溫避光孵育5 min 后，加入終止液2 mol/L H2SO4，終止反應(yīng)。根據(jù)在酶標(biāo)儀450 nm 處測(cè)量的吸光度，篩選抗體陽(yáng)性細(xì)胞株；然后在半固體培養(yǎng)基中進(jìn)行克隆化培養(yǎng)，7 d 后挑選出單克隆到96 孔板中，按上述ELISA 再次進(jìn)行篩選，最終獲得抗體陽(yáng)性的單克隆細(xì)胞株。

1.2.3 抗體測(cè)序 收取足量抗體陽(yáng)性細(xì)胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用小鼠抗體測(cè)序引物進(jìn)行PCR。反應(yīng)條件：98 ℃300 s；98 ℃10 s，58 ℃15 s，72 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)；72 ℃300 s。最后將PCR 產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司測(cè)序。

1.2.4 腹水制備及抗體純化 選擇雄性裸鼠4只，6～8周齡。提前7 d 注射pristane 0.5 mL/只，然后在小鼠腹腔注射雜交瘤細(xì)胞（0.5～1）×106個(gè)/0.5 mL；7～10 d 后可見(jiàn)裸鼠腹部脹大，在左下腹腔刺入針頭，收集腹水至離心管中，2 400×g離心10 min，收集上清液，加入疊氮鈉使之終濃度為0.02%。

按照蛋白G 瓊脂糖純化樹(shù)脂的說(shuō)明書(shū)流程，將上述收集的腹水依次進(jìn)行平衡、上樣、洗雜、洗脫；最后用超濾管（截留相對(duì)分子質(zhì)量≥30 000）對(duì)洗脫液進(jìn)行超濾濃縮，得到高純度的單克隆抗體。

1.3 抗體親和力檢測(cè)

采用ELISA 進(jìn)行抗體親和力檢測(cè)。在ELISA 板中包被抗原FⅨa 0.1 μg/100 μL，37 ℃孵育1.5 h；再用2%牛血清白蛋白37 ℃封閉1 h；然后分別加入不同濃度梯度的抗體，37 ℃孵育1.5 h；接著加入鼠源二抗，37 ℃孵育30 min；最后加入顯色底物TMB 室溫避光孵育5 min 后，加入終止液2 mol/L H2SO4，終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處吸光度。

1.4 抗凝血測(cè)定

1.4.1 APTT 首先將儀器及相關(guān)試劑預(yù)熱至37 ℃。然后將抗體用OVB 稀釋?zhuān)龠x定APTT 程序，放置反應(yīng)杯。依次加入50 μL APTT 試劑、50 μL 正常人混合血漿和磁珠，按啟動(dòng)鍵使磁珠開(kāi)始振蕩。然后加入25 μL抗體，按下計(jì)時(shí)鍵開(kāi)始計(jì)時(shí)，180 s后加入25 μL 50 mmol/L CaCl2，同時(shí)按手柄上的測(cè)量鍵。觀察磁珠振蕩直至血漿凝固，記錄儀器上的秒數(shù)。最后，根據(jù)血漿中抗體終濃度的對(duì)數(shù)值和凝血時(shí)間繪制曲線。

1.4.2 PT 首先將儀器和試劑預(yù)熱至37 ℃。然后將抗體稀釋于正常人混合血漿中，再選定PT 程序，放置反應(yīng)杯。加入磁珠，按啟動(dòng)鍵使磁珠開(kāi)始振蕩，然后加入50 μL 含抗體的正常人混合血漿，并按下計(jì)時(shí)鍵開(kāi)始計(jì)時(shí)。60 s 后加入100 μL PT 試劑，同時(shí)按手柄上的測(cè)量鍵。觀察磁珠振蕩直至血漿凝固，記錄儀器上的秒數(shù)。根據(jù)血漿中抗體終濃度的對(duì)數(shù)值和凝血時(shí)間繪制曲線。

1.5 發(fā)色底物法檢測(cè)抗體對(duì)酶活性的影響

首先將酶標(biāo)儀設(shè)置為37 ℃，選擇動(dòng)力學(xué)循環(huán)模式，測(cè)量吸光度的動(dòng)態(tài)變化值，總時(shí)間設(shè)置為10 min，間隔5 s，循環(huán)次數(shù)為121次。然后參考SPECTROZYME?FⅨa發(fā)色底物的說(shuō)明書(shū)，在96孔板中依次加入100 μL Tris緩沖液（50 mmol/L Tris、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L CaCl2、33%乙二醇，pH=7.4）、10 μL FⅨa 蛋白（2 μmol/L）、2.5 μL 抗體或?qū)φ?，最后加?2.5 μL 的FⅨa 發(fā)色底物（10 mmol/L），觸發(fā)反應(yīng)；測(cè)量其在405 nm處吸光值的變化情況ΔD/min。

1.6 FⅨa與單克隆抗體相互作用結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

FⅨa的催化結(jié)構(gòu)域三維模型依據(jù)FⅨa-抑制劑復(fù)合物（PDBentry：3LC3）的晶體結(jié)構(gòu)構(gòu)建而成?？紤]到3LC3中氨基酸殘基依照胰凝乳蛋白酶編號(hào)，下述用此編號(hào)的FⅨa 殘基均在編號(hào)前加c 字符。通過(guò)SabPred 網(wǎng)站的Abody Builder［23］來(lái)預(yù)測(cè)單克隆抗體可變區(qū)的三維結(jié)構(gòu)。通過(guò)ClusPro 進(jìn)行抗體與FⅨa 的對(duì)接，其中在對(duì)接的過(guò)程中使用抗體模式屏蔽抗體的非互補(bǔ)性決定區(qū)（complementarity determining region，CDR）區(qū)域［24］。對(duì)接結(jié)果由open-source PyMOL（2.5.0版）提供［25］。

1.7 抗體與FⅧa結(jié)合FⅨa的競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)

1.7.1 FⅧ的激活 在125 μL緩沖液（20 mmol/L HEPES、300 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L CaCl2）中加入1 U/100 μL凝血酶和100 μg/25 μL FⅧ，37 ℃孵育10 min，得到FⅧa（終濃度約為0.4 mg/mL）。最后加入1 U 水蛭素（hirudin），防止FⅧa崩解［26］。

1.7.2 抗體對(duì)FⅨa-FⅧa 復(fù)合物激活FⅩ的抑制作用檢測(cè) 首先將50 ng/2 μL PC/PS、5 μL FⅨa（20 nmol/L）、10 μL FⅩ（3 μmol/L）混合，然后加入預(yù)先混合好的8 μL FⅧa（80 μg/mL）和5 μL 抗體，37 ℃孵育15 min。再加入20 μL EDTA（20 mmol/L）終止反應(yīng)，最后加入150 μL 含0.1% PEG8000 的TBS-Ca2+緩沖液（20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L CaCl2、0.1%牛血清白蛋白）稀釋反應(yīng)產(chǎn)物［27］。

將酶標(biāo)儀設(shè)置為37 ℃，選擇動(dòng)力學(xué)循環(huán)總時(shí)間設(shè)置為5 min，間隔10 s，循環(huán)次數(shù)為31次。在96孔板中加入40 μL 反應(yīng)產(chǎn)物，再加入40 μL 發(fā)色底物S2765（1 mmol/L），觸發(fā)反應(yīng)［28］。測(cè)量其在405 nm處吸光值的變化情況ΔD/min。

1.7.3 FⅧa 糾正抗體對(duì)FⅨa-FⅧa 復(fù)合物抑制作用的檢測(cè) 選取“1.7.2”中合適的抗體作用濃度，按照同樣的方法，將上述反應(yīng)體系中的5 μL 抗體換為2.5 μL FⅧa 和2.5 μL抗體（終濃度不變），測(cè)量其在405 nm 處吸光值的變化情況（ΔD/min）。糾正率為加入FⅧa 后對(duì)應(yīng)的FⅩa生成量減去未加入FⅧa 體系的FⅩa 生成量的差除以未加入FⅧa體系的FⅩa生成量。

1.7.4 建立FⅩa 生成量與裂解底物速率的標(biāo)準(zhǔn)曲線 按說(shuō)明書(shū)操作，首先將25 μL FⅩ（200 nmol/L）、25 μL RVV（42 nmol/L）、50 μL TBS-Ca2+緩沖液混合，37 ℃孵育30 min 后，F(xiàn)Ⅹ被激活為FⅩa，此反應(yīng)體系中完全活化的FⅩa終濃度為10 nmol/L。

然后將酶標(biāo)儀設(shè)置為37 ℃，選擇動(dòng)力學(xué)循環(huán)模式，總時(shí)間設(shè)置為5 min，間隔10 s，循環(huán)次數(shù)為31 次。在96 孔板中加入40 μL 不同濃度FⅩa 和40 μL 發(fā)色底物S2765（1 mmol/L），觸發(fā)反應(yīng)，測(cè)量其在405 nm 處吸光值的變化情況（ΔD/min），即為裂解底物速率。根據(jù)FⅩa的終濃度和對(duì)應(yīng)的反應(yīng)速率繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.1 APTT、PT評(píng)估單抗的抗凝作用

先后通過(guò)免疫小鼠、雜交瘤融合、抗體測(cè)序、細(xì)胞表達(dá)與純化技術(shù)得到1 株與人FⅨa 具有高親和力的單克隆抗體（圖1A，EC50=94.67 ng/mL），命名為FⅨa-4。接著檢測(cè)該單抗對(duì)APTT 和PT 的影響，用來(lái)評(píng)估其在內(nèi)源性凝血途徑和外源性凝血途徑中的作用。分別將不同濃度的單克隆抗體（終濃度為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39 μg/mL）加入到APTT 或PT 反應(yīng)體系中。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，F(xiàn)Ⅸa-4使APTT 顯著延長(zhǎng)；且隨著FⅨa-4 濃度的增加，其對(duì)APTT 的延長(zhǎng)效應(yīng)也增強(qiáng)，最大可使APTT 延長(zhǎng)至88.8 s，相當(dāng)于對(duì)照組25.5 s 的3.5 倍（圖1B，IC50=7.71 μg/mL）。這一延長(zhǎng)效應(yīng)明顯高于目前抗栓藥物要求的2.5 倍APTT延長(zhǎng)效應(yīng)。而FⅨa-4 基本不影響PT（圖1C）。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明FⅨa-4 特異性地抑制了內(nèi)源性凝血途徑，而不作用于FⅩ、FⅡ等外源性凝血途徑和共同凝血途徑中的凝血因子。

圖1 FⅨa-4與FⅨa的親和力及對(duì)內(nèi)源性和外源性凝血途徑的影響Fig 1 Affinity between FⅨa-4 and FⅨa and its effect on endogenous and exogenous coagulation pathways

2.2 FⅨa-4不直接結(jié)合FⅨa的催化活性位點(diǎn)

在內(nèi)源性凝血途徑中，F(xiàn)Ⅸa作為酶催化FⅩ形成FⅩa來(lái)介導(dǎo)凝血瀑布反應(yīng)的。因此，為了研究FⅨa-4 的抗凝機(jī)制，我們首先檢測(cè)了其對(duì)FⅨa 催化活性的影響，用酶催化底物裂解的速率來(lái)反映酶的催化活性。分別將不同濃度的FⅨa-4（終濃度為1 000、100、10、1、0.1、0.01、0.001 μg/mL）與FⅨa 蛋白混合孵育3 min，再加入FⅨa發(fā)色底物進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)D（405 nm）。ΔD/min 反映了酶的催化活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)Ⅸa-4 對(duì)FⅨa 的酶催化活性無(wú)明顯影響（圖2）。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明FⅨa-4 并不是通過(guò)直接結(jié)合F Ⅸa 的催化活性位點(diǎn)發(fā)揮抗凝活性。

圖2 FⅨa-4對(duì)FⅨa催化活性的影響Fig 2 Effect of FⅨa-4 on FⅨa catalytic activity

2.3 FⅨa-4抗體與FⅨa催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)

為了進(jìn)一步研究FⅨa-4 的抗凝作用機(jī)制，我們利用蛋白對(duì)接的方法對(duì)FⅨa-4 與FⅨa 的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)。由于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)（Protein Data Bank，PDB）中沒(méi)有經(jīng)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的FⅨa 全長(zhǎng)蛋白的完整結(jié)構(gòu)，同時(shí)考慮到我們主要關(guān)注抗體對(duì)于FⅨa 催化活性的影響，因此我們基于一個(gè)FⅨa 催化結(jié)構(gòu)域的抑制劑復(fù)合物結(jié)構(gòu)建立了FⅨa 催化結(jié)構(gòu)域的三維模型；同時(shí)利用抗體結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)工具建立了FⅨa-4 結(jié)合區(qū)域的三維模型，通過(guò)蛋白-蛋白對(duì)接方法預(yù)測(cè)了兩者結(jié)合的最優(yōu)構(gòu)象集合。該構(gòu)象集合中，總共979 個(gè)對(duì)接構(gòu)象形成了30 個(gè)聚類(lèi)。對(duì)每個(gè)聚類(lèi)的代表構(gòu)象觀察發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)FⅨa 與FⅨa-4 的結(jié)合構(gòu)象共享1 個(gè)結(jié)合表面，其中接觸頻率較高的殘基列于表1 中。在所有的構(gòu)象中，F(xiàn)Ⅸa-4 與FⅨa 之間的結(jié)合都不阻礙FⅨa催化位點(diǎn)的底物進(jìn)出（圖3A）。同時(shí)，雖然對(duì)接過(guò)程中并未考慮FⅨa 與抗體本身的構(gòu)象變化，但考慮到結(jié)合位點(diǎn)與催化位點(diǎn)相距較遠(yuǎn)，且催化結(jié)構(gòu)域三維結(jié)構(gòu)比較穩(wěn)定，受結(jié)合影響產(chǎn)生較大形變的可能性不高，因此可以初步推測(cè)FⅨa-4結(jié)合并不直接影響FⅨa的催化。

另一方面，這些接觸殘基與之前預(yù)測(cè)的FⅨa-FⅧa結(jié)合面［29］有相當(dāng)部分重疊（圖3B、C）。例如，表1 中FⅨa 的Asn-c 93、Lys-c 132、Arg-c 165 和Thr-c 175 等殘基也參與FⅨa 與FⅧa 的結(jié)合，而且Ala-c 95、Lys-c 98、Asp-c 164、Lys-c 173、Tyr-c 177 殘基在序列上與預(yù)測(cè)的FⅨa-FⅧa結(jié)合殘基也很接近，均間隔少于2個(gè)殘基位點(diǎn)。在三維結(jié)構(gòu)中這些殘基占據(jù)了位于FⅨa蛋白c170-螺旋和c131-螺旋之間的共同表面，這恰恰是FⅨa與FⅧa的558-螺旋相結(jié)合的關(guān)鍵區(qū)域，因此FⅨa-4 可能與FⅧa 在FⅨa的結(jié)合上形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系?？傊?，對(duì)于FⅨa-4 與FⅨa 催化結(jié)構(gòu)域結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)表明FⅨa-4 并不是通過(guò)直接結(jié)合FⅨa 的催化活性位點(diǎn)而降低其活性，而是與FⅧa 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FⅨa，阻礙了FⅧa-FⅨa復(fù)合物的形成，從而抑制內(nèi)源性凝血途徑中FⅧa對(duì)于FⅨa的激活，從而降低了FⅨa的催化活性。t

圖3 FⅨa-4（紅色）與FⅨa催化結(jié)構(gòu)域（藍(lán)色）的結(jié)合面預(yù)測(cè)Fig 3 Binding surface prediction between the antibody FⅨa-4(red)and FⅨa catalytic domains(blue)

表1 FⅨa與FⅨa-4結(jié)合面上的接觸殘基Tab 1 Most frequent residues of FⅨa contacting with FⅨa-4

2.4 FⅨa-4與FⅧa競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FⅨa

假定FⅨa-4與FⅧa競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FⅨa，那么隨著FⅧa濃度的增加，F(xiàn)Ⅸa-4 的作用會(huì)減弱。首先我們建立了模擬體內(nèi)FⅨa-FⅧa復(fù)合物產(chǎn)生FⅩa的體外模型。在此體系中加入PS/PC、FⅨa、FⅧa 與FⅩ，反應(yīng)產(chǎn)生FⅩa，然后向此反應(yīng)體系中加入FⅩa發(fā)色底物來(lái)確定FⅩa的產(chǎn)生量。結(jié)果（圖4A）發(fā)現(xiàn)，將不同濃度的FⅨa-4（終濃度為1 560、780、390、156、78、39、15.6、7.8 pmol/L）加入到此體系中，F(xiàn)Ⅸa-4 以劑量依賴(lài)的方式抑制了FⅩa 的生成。FⅨa-4 的濃度達(dá)到400 pmol/L 就使FⅩa 的生成幾乎完全被抑制。在此體系（抗體濃度為400 pmol/L）中添加FⅧa 至不同濃度（終濃度為1.1、1.6、2.5、3.7、5.6、8.3、12.5 nmol/L），結(jié)果（圖4B）顯示隨著所加FⅧa 濃度的升高，抗體的抑制作用逐漸被糾正，糾正率達(dá)到近50%。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證了FⅨa-4 與FⅧa 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FⅨa發(fā)揮抗凝作用這一推測(cè)。

圖4 FⅨa-4與FⅧa競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合FⅨa的驗(yàn)證Fig 4 Verification of FⅨa-4 competed with FⅧa in combination with FⅨa

3 討論

目前使用的抗凝劑有多種局限性，包括不可預(yù)測(cè)的藥代動(dòng)力學(xué)、缺乏可逆性，在某些情況下還有免疫原性［30］；開(kāi)發(fā)安全有效的抗栓藥物仍是當(dāng)代醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。在選擇靶向的凝血因子時(shí)，有2個(gè)重要的考慮因素。首先，在凝血瀑布反應(yīng)顯著放大發(fā)生之前阻斷該通路。第二，以限速步驟為目標(biāo)，應(yīng)在最寬的治療范圍內(nèi)提供有效的抗凝作用［31］。FⅨa 是內(nèi)源性凝血途徑中關(guān)鍵的凝血因子［4］。有研究［32］表明，靶向FⅨa 是有效降低缺血性并發(fā)癥而不增加出血并發(fā)癥的非常有前景的治療方法。

單克隆抗體具有結(jié)合抗原特異性強(qiáng)、半衰期長(zhǎng)等特性。隨著單克隆抗體技術(shù)的不斷發(fā)展，抗體藥物在疾病預(yù)防、診斷和治療方面發(fā)揮著舉足輕重的作用。本研究中先后通過(guò)雜交瘤技術(shù)、抗體測(cè)序、細(xì)胞表達(dá)與純化技術(shù)得到了一種新型的抗FⅨa 單克隆抗體FⅨa-4，并通過(guò)APTT、PT 功能檢測(cè)，描述了FⅨa-4 的抗栓特性。雖然FⅨa-4 延長(zhǎng)APTT的作用是劑量依賴(lài)性的，但大量增加抗體濃度并未使APTT 不受控制地延長(zhǎng)，而是將APTT 延長(zhǎng)比例限定在3.5倍的范圍內(nèi)。這一結(jié)果表明FⅨa-4有效治療濃度窗口較大，不易增加出血風(fēng)險(xiǎn)，符合臨床應(yīng)用需求。

在探究其抗栓活性的作用機(jī)制時(shí)我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)Ⅸa-4與之前報(bào)道的FⅨa 抑制劑不同，它并不直接作用于FⅨa的酶催化活性位點(diǎn)，而是占據(jù)了FⅨa 和FⅧa 之間的大部分結(jié)合區(qū)域，阻斷了FⅨa-FⅧa復(fù)合物形成，進(jìn)而影響其催化FⅩ向FⅩa 的轉(zhuǎn)化而引發(fā)抗凝作用。更有意思的是，F(xiàn)Ⅸa-4 可基本阻斷體外FⅩa 的產(chǎn)生，而補(bǔ)充FⅧa 可使這一抑制作用得到糾正；也就是說(shuō)FⅨa-4 的抗栓作用隨著FⅧa 濃度的增加得到部分逆轉(zhuǎn)。與現(xiàn)有抗栓藥物相比，抗栓作用可逆是現(xiàn)今開(kāi)發(fā)新型安全有效抗栓藥物需要考慮的，因?yàn)樵谂R床用藥過(guò)程中可利用這一特性預(yù)防或治療過(guò)度抗凝而引起的不可控出血。在接下來(lái)的研究中，我們將測(cè)試食蟹猴、鼠、犬等不同動(dòng)物種屬的FⅨa 與FⅨa-4 反應(yīng)，以找到可與FⅨa-4 相互作用的動(dòng)物模型，評(píng)測(cè)靶向FⅨa-FⅧa結(jié)合位點(diǎn)的單克隆抗體FⅨa-4在體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)及安全性。

綜上所述，本研究制備了一種新型抗栓抗體，其作用機(jī)制為通過(guò)與FⅧa競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合FⅨa上的位點(diǎn)，抑制FⅧa-FⅨa 復(fù)合物的形成進(jìn)而發(fā)揮抗凝作用。該研究成果不僅為治療血栓提供了新的思路，也為目前仍未明確的FⅧa與FⅨa結(jié)合位點(diǎn)提供了間接證據(jù)。