飼料中動物源性成分檢測技術(shù)的研究進(jìn)展

戴海潔，唐　煜，梁　斌，張　憬，吳志奇，南玉琴，祝秀梅

（甘肅省獸藥飼料監(jiān)督所，甘肅蘭州 730030）

動物源性飼料是以動物或者動物的副產(chǎn)物為原料，經(jīng)加工制作而成的飼料，它含有豐富的脂肪、維生素、氨基酸以及礦物質(zhì)，在飼料生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。但是，動物源性飼料容易受到微生物的污染，且易攜帶傳染病原體，對畜產(chǎn)品的安全影響甚大。1986年，在英國的牛肉骨粉中首次檢測到牛海綿狀腦?。ǒ偱２。┎≡w（Rogberg等，2013）。為此，許多國家為確保生物安全，禁止在反芻動物飼料中添加肉骨粉，禁止動物源性成分的種內(nèi)循環(huán)。隨著經(jīng)濟(jì)技術(shù)的高速發(fā)展，越來越多的人關(guān)注產(chǎn)品質(zhì)量安全，動物源性飼料的安全不僅關(guān)系到動物安全，同時關(guān)系到人類的正常生活。農(nóng)業(yè)部在《飼料及飼料添加劑管理條例》中明確規(guī)定，禁止在反芻動物飼料中添加乳和乳制品以外的動物源性飼料產(chǎn)品。但由于動物源性飼料的營養(yǎng)成分含量較高，在生產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛應(yīng)用，而動物源性成分的檢測需要較長的時間并有一定的環(huán)境要求，現(xiàn)場檢測及管控有一定的困難度。因此，尋找和研究準(zhǔn)確、快速、靈敏的檢測方法刻不容緩，本文對動物源性成分的傳統(tǒng)檢測技術(shù)以及新型檢測技術(shù)的優(yōu)缺點進(jìn)行綜述。

飼料中動物源性成分的檢測方法主要有理化技術(shù)、基于蛋白質(zhì)的鑒別技術(shù)、基于DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)以及近年來所研究的新型技術(shù)。

1　動物源性成分的主要檢測方法

1.1理化技術(shù)

1.1.1顯微鏡檢法顯微鏡檢法是歐盟（EU）認(rèn)可的唯一檢測動物源性成分的官方方法（Liu等，2011）。該方法主要是利用顯微鏡對各類組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征和細(xì)胞特征進(jìn)行觀察及判斷，用來鑒別物種源性，可以用于動物飼料以及肉類摻假鑒別，例如肉組織切片（孫秀蘭等，2012）。顯微鏡檢法經(jīng)常用于檢測反芻動物飼料中哺乳動物蛋白，但其缺點是不能單獨用來區(qū)分動物源性種類，且需要檢測人員有豐富的經(jīng)驗及較高的顯微鏡操作水平。

1.1.2近紅外光譜法近紅外光譜（NIRS）分析技術(shù)是以量子力學(xué)為基礎(chǔ)，利用分子振動測量其對光的吸收情況，用所得到的紅外圖譜來表示被測物質(zhì)的特征。近年來，NIRS已應(yīng)用在物質(zhì)分析、食品檢測及肉類摻假鑒別等多個領(lǐng)域。Murray等（2001）首次采用NIRS區(qū)分出含有肉骨粉的魚粉，標(biāo)明NIRS可以檢測出2中不同動物的動物蛋白。NIRS其優(yōu)點是檢測快速、所需樣品量少；其缺點是為非直接檢測，需要對大量標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行成分與組分分析建立數(shù)據(jù)庫。

1.1.3顯微近紅外光譜分析技術(shù)（NIRM）顯微近紅外光譜（NIRM）分析技術(shù)是近紅外光譜技術(shù)與光學(xué)顯微鏡檢測技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物。呂程序等（2001）利用12個動物源性成分飼料樣品建立偏最小二乘法（PLS）定標(biāo)模型，采用NIRM對飼料中動物源性成分進(jìn)行檢測。Delgado等（2007）利用NIRM對動物飼料中肉骨粉進(jìn)行了定性研究，結(jié)果表明NIRM可對動物飼料中的肉骨粉含量進(jìn)行檢測。該方法可以檢測飼料中的所有顆粒，但缺點是不能進(jìn)行種類特異性鑒別。

1.1.4色譜鑒別法色譜鑒別法是通過液相、氣相等色譜進(jìn)行源性分析。Schonherr等（2002）分別利用動物種間特異性的短肽類物質(zhì)的分布情況建立用于定性鑒別肉類成分的高效液相色譜技術(shù)。該方法比較敏感，可區(qū)分源性種類特異性，但樣品制備比較繁瑣，操作相對復(fù)雜。

高效變性液相色譜技術(shù)（DHPLC）是一項在單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）和變性梯度凝膠電泳（DGGE）基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新的雜合雙鏈突變檢測技術(shù)。DHPLC實現(xiàn)了高通量自動化檢測，具有較高的靈敏度和特異性，且檢測DNA片段和長度變動范圍廣，能夠純化DNA片斷，但只能檢測雜合突變。我國學(xué)者采用DHPLC對動物成分特異性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析。王金玲等（2010）應(yīng)用PCR反應(yīng)結(jié)合變性高效液相色譜（DHPLC）技術(shù)建立飼料中雞源性成分的快速檢測方法，結(jié)果表明，PCR-DHPLC檢測靈敏度在DNA水平上達(dá)到了2.04 ng/μL。王秋艷等（2010）建立了關(guān)于食品及動物飼料中牛源性成分PCR-DHPLC，得到牛源性成分PCR-DHPLC特征峰型圖，樣本檢測的峰型圖可用于定性或定量監(jiān)測樣本中牛源性成分的動態(tài)變化。

1.2基于蛋白質(zhì)的鑒別技術(shù)

1.2.1十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。SDS-PAGE法是將蛋白質(zhì)用十二烷基硫酸鈉（SDS）變性和溶解，再進(jìn)行凝膠電泳。該方法是根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同來進(jìn)行區(qū)分蛋白質(zhì)，一般采用的是不連續(xù)緩沖系統(tǒng)，有較高的分辨率，但現(xiàn)一般用于肉品種屬鑒定（李冰玲等，2008）。

1.2.2酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）法ELISA又稱酶標(biāo)法，是酶的高效催化作用和抗原抗體免疫反應(yīng)的特異性有機(jī)結(jié)合。根據(jù)試劑來源、樣品情況以及檢測條件，ELISA技術(shù)主要有直接法、間接法、雙抗體夾心法、直接競爭法、間接競爭法、捕獲包被法、斑點免疫吸附法和組織印跡法等多種類型（Arif等，2009）。ELISA法的優(yōu)點是測定速度快、操作簡單，缺點是有一定的局限性（例如：與植物蛋白存在交叉反應(yīng)以及具有熱敏性，易導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性結(jié)果），因此ELISA法可作為初步篩選方法。

1.3基于DNA序列的分子生物學(xué)技術(shù)

1.3.1DNA 雜交技術(shù)DNA雜交技術(shù)是基于DNA序列特征識別動物源性的鑒別技術(shù)，是應(yīng)用核酸分子的變性及復(fù)性的性質(zhì)，依據(jù)堿性互補(bǔ)的關(guān)系使得DNA片段形成的雜交雙鏈分子。石豐運等（2010）利用 DNA 分子雜交原理建立了能同時檢測牛、山羊、豬、雞4種動物成分的基因芯片法，實現(xiàn)了對多種動物源性成分的種類檢測。DNA雜交技術(shù)靈敏性較高，但操作復(fù)雜且不能自動化。

1.3.2PCR技術(shù)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）是利用DNA聚合酶和引物對DNA模板進(jìn)行復(fù)制擴(kuò)增。

1.3.2.1傳統(tǒng)PCR法傳統(tǒng)的PCR法主要采用凝膠電泳分離以及熒光染色來檢測PCR反應(yīng)的最終擴(kuò)增產(chǎn)物。傳統(tǒng)的PCR法一般分為內(nèi)參照法、競爭法、PCR-ELISA法。使用內(nèi)標(biāo)法也可對傳統(tǒng)PCR法進(jìn)行定量檢測，但由于待測樣本的起始拷貝數(shù)未知，所以無法加入適量的已知模板作為內(nèi)標(biāo)，故而只能算作半定量的。劉烜等（2009）同時對含有牛、羊、豬等 6 種動物源性成分飼料中的 DNA提取產(chǎn)物進(jìn)行六重擴(kuò)增，對紫外透射光下凝膠成像系統(tǒng)的電泳結(jié)果進(jìn)行特異性鑒定，證明多重PCR方法具有較高的特異性和靈敏度。傳統(tǒng)PCR法的優(yōu)點是具有很高的靈敏度，但存在定量效果差，電泳污染等問題，并有大量繁瑣的后續(xù)工作。

1.3.2.2實時熒光定量PCR法實時熒光定量PCR（PCR）是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，以熒光化學(xué)物質(zhì)測每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）循環(huán)后產(chǎn)物總量的方法。通過內(nèi)參或者外參法對待測樣品中的特定DNA序列進(jìn)行定量分析的方法。根據(jù)熒光物質(zhì)的不同可分為Taqman熒光探針法和SYBR GreenⅠ熒光染料法。探針法可通過探針增加反應(yīng)收集信號的特異性，能夠用于多重體系反應(yīng)，可預(yù)測和提前進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化；染料法經(jīng)濟(jì)實惠，可做溶解曲線，但特異性不高。趙冉等（2012）使用Taq Man探針對線粒體 DNA（mt DNA）進(jìn)行提取擴(kuò)增，建立了定性三重?zé)晒?PCR檢測方法，且該方法檢出限可達(dá)10-5。PCR法采用陽性對照、陰性對照以及空白對照，可對環(huán)境進(jìn)行實時監(jiān)測，并具有簡便、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點，有效地提高了飼料檢測的工作效率。

1.3.3環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）法環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）是一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，利用一種鏈置換DNA聚合酶，在等溫條件（63℃左右）保溫30～60 min，即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)。LAMP 是一種全新的核酸擴(kuò)增方法，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)、電泳及紫外觀察等過程。徐淑菲等（2016）以環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（LAMP）熒光檢測方法為基礎(chǔ)，建立并優(yōu)化了牛源性成分 LAMP 檢測方法，該方法操作簡單、特異性強(qiáng)，有較強(qiáng)的靈敏度、反應(yīng)時間短等優(yōu)點，且檢測成本遠(yuǎn)低于熒光定量PCR。

1.3.4限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）是發(fā)展最早的DNA標(biāo)記技術(shù)。RFLP是指基因之間因限制性酶切位點上堿基的插入、缺失、重排或點突變所引起的的差異。CAPs技術(shù)又稱為限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR-RFLP）技術(shù)，是利用引物進(jìn)行擴(kuò)增，對相應(yīng)PCR擴(kuò)增片段使用內(nèi)切酶進(jìn)行酶切處理，以檢測其多態(tài)性。由于使用限制性內(nèi)切酶導(dǎo)致酶切分析不便（李林等，2006），增加了研究成本，所以限制了該技術(shù)的廣泛應(yīng)用。

末端限制性片段長度多態(tài)性（T-RFLP）分析是一種在通用引物的末端標(biāo)記熒光，利用限制性酶切片段長度差異檢測生物個體間差異的分子標(biāo)記技術(shù)。該技術(shù)具有高效可重復(fù)性，可以對一個生物群體的特定基因進(jìn)行定性和定量測定。汪琦等（2010）利用12S rRANA 基因的限制性酶切末端片段長度多態(tài)性建立一種精確可靠的鑒定常見動物種類的方法，實驗得到的末端片段長度與理論值非常接近。T-RFLP法操作簡單、結(jié)果精確，適用于鑒定動物種類。T-RFLP法具有較高的分辨率、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，并能簡化結(jié)果分析，但對實驗室的儀器要求比較高（孫婕等，2014）。

1.4新型技術(shù)

1.4.1可視化環(huán)狀等溫擴(kuò)增技術(shù)（vLAMP）可視化環(huán)狀等溫擴(kuò)增技術(shù)（vLAMP）是一種現(xiàn)場可視化的篩查方法。朱珠等（2014）采用鈣黃綠素染料，應(yīng)用vLAMP技術(shù)對牛、羊源性成分進(jìn)行快速擴(kuò)增并完成現(xiàn)場可視化檢測，同時建立牛、羊源成分人工污染的飼料模型，對靈敏度進(jìn)行考察，靈敏度高達(dá) 0.001%。vLAMP技術(shù)的特異性與靈敏度比較高，且具有操作簡單快速等優(yōu)點，可用于現(xiàn)場源性成分檢測。

1.4.2微滴式數(shù)字PCR方法微滴式數(shù)字PCR方法是在傳統(tǒng)的PCR擴(kuò)增前對樣品進(jìn)行微滴化處理，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，逐個對每個微滴進(jìn)行檢測，對微滴的熒光信號進(jìn)行判別陰陽性，根據(jù)泊松分布原理得出起始濃度。王珊等（2015）首次建立一種定量檢測羊肉制品中羊源和豬源性成分的微滴式數(shù)字PCR方法。任君安（2017）采用微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，建立了針對羊肉及其多種動物源性摻假成分的定性及精準(zhǔn)定量檢測方法。微滴式數(shù)字PCR方法實現(xiàn)了精準(zhǔn)定量，計算直接準(zhǔn)確且無需標(biāo)準(zhǔn)曲線（Hindson等，2013）。

2　小結(jié)

動物源性成分的檢測不僅用于獸醫(yī)學(xué)的研究，還可以控制人畜共患病及動物傳染疾病的傳播，因此，必須加強(qiáng)動物源性飼料的質(zhì)量安全監(jiān)督管理。目前用于動物源性成分的檢測方法有很多，繼續(xù)研究和開發(fā)多種簡單、快捷、高效、經(jīng)濟(jì)的源性成分檢測技術(shù)或手段，是促進(jìn)我國動物源性飼料安全的一項重要技術(shù)舉措。此外，現(xiàn)有的動物源性檢測技術(shù)對所添加的物質(zhì)不能區(qū)分，未來動物源性檢測技術(shù)將致力于提高靈敏度和特異性，應(yīng)進(jìn)一步開發(fā)現(xiàn)場檢測技術(shù)以及相應(yīng)的檢測試劑盒，對動物源性成分飼料做到隨時隨地監(jiān)管和評估。