不同水稻品種幼苗響應(yīng)堿脅迫的生理差異及脅迫等級(jí)構(gòu)建

路旭平，李芳蘭，石亞飛，張娟偉，楊文偉，羅成科，田蕾，李培富

寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院/寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏 銀川 750021

土壤鹽堿化是導(dǎo)致耕地面積減少的重要原因之一，對(duì)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生了負(fù)面的影響。據(jù)報(bào)道，中國鹽堿地主要分布在東北松嫩平原、黃淮海平原、西北干旱半干旱區(qū)和濱海等地（Wang et al.，2017；羅成科等，2019）；面積達(dá)0.99億公頃，約占全世界鹽堿地面積的10.3%，且呈逐年增加的趨勢(shì)（冷春旭等，2020）。水稻（Oryza sativa L.）是中國三大糧食作物之一，中國超過60%的人口以稻米作為主糧（姚棟萍等，2019）。水稻屬中等鹽敏感的作物（Flowers et al.，2008），利用種植水稻來改良鹽堿地，可以使土壤表層的鹽分逐漸下沉，改良土壤結(jié)構(gòu)（冷春旭等，2020）；并且水稻根系具有分泌有機(jī)酸和吸收環(huán)境中鹽分的作用，可以中和堿脅迫引起的高pH并改善土壤板結(jié)情況，使土壤結(jié)構(gòu)變得疏松，提高土壤蓄水能力（梁銀培等，2017）。因此，合理有效地開發(fā)和利用鹽堿地，對(duì)保障國家的糧食安全具有重要意義。

研究表明，土壤鹽堿化包括兩種不同的類型，即中性鹽（NaCl和 Na2SO4）和堿性鹽（NaHCO3和 Na2CO3）引起的兩種不同類型的鹽脅迫，植物對(duì)此有不同的響應(yīng)和耐鹽機(jī)制（Guo et al.，2020）。由中性鹽引起的脅迫稱為鹽脅迫，對(duì)植物的主要傷害是由滲透脅迫和離子毒害引起的（劉建新等，2020）；由堿性鹽引起的脅迫稱為堿脅迫，主要是由于高pH值使土壤中營養(yǎng)元素固化，嚴(yán)重干擾植物根系對(duì)礦質(zhì)營養(yǎng)的吸收，導(dǎo)致植物體內(nèi)營養(yǎng)失衡，新陳代謝紊亂，破壞離子平衡；同時(shí)堿脅迫具有與鹽脅迫相同的滲透脅迫和離子毒害（Guo et al.，2017；Zhang et al.，2017）。

植物遭受堿脅迫時(shí)，由于具有較高pH值，使植物遭受鹽分和高pH值雙重?fù)p傷，堿脅迫對(duì)植物造成的傷害遠(yuǎn)大于鹽脅迫（徐寧等，2017）。高pH會(huì)嚴(yán)重阻礙植物對(duì)水和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，造成滲透脅迫；干擾植物細(xì)胞內(nèi)的電荷平衡和pH內(nèi)穩(wěn)態(tài)，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生活性氧，降低膜脂透性，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，導(dǎo)致生理代謝紊亂，抑制植物生長發(fā)育（穆陽杰等，2020）。國內(nèi)外有關(guān)水稻耐鹽堿研究主要集中在鹽脅迫（黃潔等，2020），對(duì)堿脅迫下水稻體內(nèi)反應(yīng)機(jī)理和調(diào)節(jié)機(jī)制的研究較少（趙懷玉等，2020），關(guān)于堿脅迫對(duì)水稻幼苗生理生化特性的影響缺乏系統(tǒng)性的研究，依據(jù)生理生化指標(biāo)計(jì)算脅迫指數(shù)并確定脅迫等級(jí)的方法更為少見。因此本研究以堿敏感水稻品種和耐堿品種為供試材料，在水稻苗期進(jìn)行堿脅迫處理，通過比較分析供試水稻的葉綠素含量、活性氧代謝、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累和抗氧化防御等生理指標(biāo)，進(jìn)一步明確不同水稻品種在堿脅迫下的生長和生理差異，并根據(jù)生理指標(biāo)劃分水稻苗期堿脅迫等級(jí)，以期為“以稻治堿”和水稻耐堿機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為2個(gè)不同耐堿性的水稻品種，即堿敏感品種“中花 11”（ZH11）和耐堿品種“寧粳52”（NG52），供試水稻種子由寧夏大學(xué)寧夏優(yōu)勢(shì)特色作物現(xiàn)代分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取大小一致、籽粒飽滿的水稻種子，蒸餾水浸泡1 h，75%的乙醇浸泡15 s，15%的NaClO消毒30 min，蒸餾水潤洗6次后用濾紙吸干水分。將消毒后的水稻種子置于長×寬×高為100 cm×50 cm×10 cm，共 32孔的育苗盤中，放置于人工氣候箱（HP1000GS）中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為16 h/8 h（光照/黑暗），溫度28 ℃/25 ℃（白天/夜間）。種子萌發(fā)4 d后，選取長勢(shì)一致幼苗轉(zhuǎn)移到剪去管底的96孔PCR板上，每板48株，將轉(zhuǎn)移到PCR板上各材料置于長×寬×高為21 cm×15 cm×5.2 cm水培盒中進(jìn)行培養(yǎng)。水稻移栽2 d后加入1/2國際水稻所（IRRI）水稻專用營養(yǎng)液，5 d 后加入全營養(yǎng)液，以后每隔3 d更換700 mL水稻營養(yǎng)液，國際水稻所水稻專用營養(yǎng)液配方的質(zhì)量濃度為（mg·L?1）：NH4NO3114.3、NaH2PO4·2H2O 50.4、K2SO489.3、CaCl2110.8、MgSO4·7H2O 405、NaSiO3·9H2O 568、MnCl2·4H2O 1.8 、 Na2MoO4·2H2O 0.126、H3BO41.145、ZnSO4·7H2O 0.044、CuSO4·5H2O 0.039、FeSO4·7H2O 9.93。幼苗生長至第28天進(jìn)行堿脅迫處理。

試驗(yàn)選用兩種堿性鹽（NaHCO3和Na2CO3）混合設(shè)置 3個(gè)堿水平：10、20、30 mmol·L?1；每組處理下，將兩種堿性鹽（NaHCO3、Na2CO3）按照不同物質(zhì)的量比例分別（9∶1、5∶5、1∶9）混合，形成 3個(gè)pH環(huán)境：pH 8.65、pH 9.55和pH 10.50，依次記為A、B、C處理；共模擬出9種堿脅迫環(huán)境（表1），其中10A、10B、10C處理相當(dāng)于輕度堿化土，20A、20B、30A處理相當(dāng)于中度堿化土，20C、30B、30C處理相當(dāng)于重度堿化土（楊佳佳等，2011）。處理液為700 mL含NaHCO3和Na2CO3的營養(yǎng)液，以僅含營養(yǎng)液的處理為對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)，連續(xù)脅迫處理3 d后采集樣品測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。

表1 各處理堿組成和pHTable 1 Alkali composition and pH of each treatment

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 生長指標(biāo)的測(cè)定

葉片相對(duì)含水量（RWC）：取處理3 d后的幼苗葉片，稱量其鮮重（mf）并記錄，葉片浸泡于蒸餾水中過夜，吸干表面水分后稱量其飽和重（mt），將飽和葉片放入烘箱中105 ℃處理15 min，75 ℃烘干至恒重，稱量其干重（md），計(jì)算葉片相對(duì)含水量：w(RWC)=(mf?md)/(mt?md)×100%

1.3.2 生理指標(biāo)的測(cè)定

葉綠素含量的測(cè)定采用乙醇提取法（羅姍姍等，2019），計(jì)算葉綠素 a含量（chlorophyll a，Chla）、葉綠素b含量（chlorophyll b，Chlb）、總?cè)~綠素含量（chlorophyll，Chl）和葉綠素 a/b（chlorophyll a/b，Chla/b）；

游離脯氨酸（proline，Pro）含量采用酸性茚三酮比色法測(cè)定（鄒琦，2000）；采用苯酚法測(cè)定可溶性糖含量（soluble sugar，SS）（鄒琦，2000）；可溶性蛋白（soluble protein，SP）含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法（鄒琦，2000）。

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定（Zhang et al.，2017）；脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活性的測(cè)定參考Huang et al.（2010）的方法；超氧陰離子（O2·-）產(chǎn)生速率采用對(duì)氨基苯磺酸法測(cè)定（Zhang et al.，2017）；H2O2含量采用碘化鉀法測(cè)定（Zhang et al.，2017）。

粗酶液的制備參考Niu et al.（2017）的方法，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）采用氮藍(lán)四唑顯色法測(cè)定（Niu et al.，2017）；過氧化氫酶（catalase，CAT）活性采用紫外比色法測(cè)定（Niu et al.，2017）；過氧化物酶（peroxidase，POD）活性采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定（Wang et al.，2013）。

還原型抗壞血酸（ascorbic acid，ASA）和還原型谷胱甘肽（reduced glutathione，GSH）測(cè)定參照Wang et al.（2013）的方法。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

運(yùn)用Microsoft Excel 2016軟件整理數(shù)據(jù)，SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和主成分分析，差異顯著性定義為 P<0.05，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（±SE）表示 3次重復(fù)測(cè)定結(jié)果；運(yùn)用GraphPad Prism 8作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿脅迫對(duì)水稻葉片葉綠素含量的影響

由圖1A可知，堿水平和pH均顯著影響ZH11的葉綠素a含量（P<0.001），且堿水平和pH對(duì)葉綠素 a含量具有顯著的交互作用（P=0.015），在30C處理時(shí)葉綠素a含量最低，較對(duì)照（CK）降低82.12%。NG52的葉綠素a含量的主效應(yīng)分別受堿水平和 pH影響，但堿水平和 pH的交互作用對(duì)NG52的葉綠素a含量無顯著影響（P=0.289），葉綠素a含量在30C處理下較CK下降61.56%。對(duì)比各處理下的兩種材料發(fā)現(xiàn)，在CK時(shí)ZH11和NG52葉綠素 a含量差異不顯著，但在 10A、10B、10C和30C處理時(shí)存在顯著差異（P<0.05）。

圖1 堿脅迫對(duì)水稻葉片葉綠素含量的影響Fig. 1 Effects of alkali stress on chlorophyll contents of rice leaves

由圖1B可得，堿水平和pH對(duì)ZH11的葉綠素b含量的主效應(yīng)具有顯著影響（P<0.001，P<0.001），但堿水平和pH的交互作用對(duì)ZH11的葉綠素b含量無顯著影響（P=0.157）。堿水平和pH對(duì)NG52的葉綠素b含量的主效應(yīng)具有顯著影響（P=0.002，P<0.001），但堿水平和pH的交互作用對(duì)NG52的葉綠素 b含量無顯著影響（P=0.470）。ZH11和NG52的葉綠素b含量在30C處理時(shí)下降至最低點(diǎn)，分別較CK降低63.29%和59.50%。比較兩種材料葉綠素b含量可得，在10A、10B和10C處理時(shí)，NG52葉綠素b含量顯著高于ZH11（P<0.05），而在其他處理時(shí)無顯著差異。

由圖1C可知，堿水平和pH對(duì)ZH11的總?cè)~綠素含量的主效應(yīng)具有顯著影響（P<0.001），但堿水平和pH的交互作用對(duì)ZH11的總?cè)~綠素含量無顯著影響（P=0.051）。堿水平和pH對(duì)NG52的總?cè)~綠素含量的主效應(yīng)具有顯著影響（P=0.002，P<0.001），但堿水平和pH的交互作用對(duì)NG52的總?cè)~綠素含量無顯著影響（P=0.462）。ZH11和NG52的總?cè)~綠素在30C處理時(shí)降至最低點(diǎn)，降幅分別為76.63%和60.94%。對(duì)比兩種材料在各處理下的葉綠素含量發(fā)現(xiàn)，在CK處理下，ZH11和NG52葉綠素含量差異不顯著；但在 10A、10B、10C和30C處理時(shí)，NG52葉綠素含量顯著大于 ZH11（P<0.05）。

分析圖1D可得，ZH11的葉綠素a/b的主效應(yīng)受堿水平和pH顯著影響（P<0.001），堿水平和pH對(duì)葉綠素a/b具有顯著的交互作用（P<0.001）。堿水平和pH對(duì)NG52的葉綠素a/b的主效應(yīng)具有顯著影響（P=0.002，P=0.001），堿水平和 pH的交互作用對(duì) NG52的葉綠素 a/b具有顯著影響（P<0.001）。ZH11和NG52的葉綠素a/b在30C處理較CK分別降低51.30%和5.07%；在30A處理時(shí)，NG52葉綠素a/b顯著增加（P<0.05），較CK增加15.43%。對(duì)比兩種材料發(fā)現(xiàn)，在CK時(shí)ZH11和NG52葉綠素a/b無顯著差異，但從10C至30C處理時(shí)，NG52葉綠素a/b顯著大于ZH11（P<0.05）。

綜合分析圖1A、C、D發(fā)現(xiàn)，在30A處理下ZH11和NG52的葉綠素a含量、總?cè)~綠素含量和葉綠素 a/b較20C處理均有增加，說明當(dāng)堿水平大于20 mmol·L?1時(shí)，低堿水平和高pH的交互作用對(duì)水稻葉綠素的影響大于高堿水平低 pH的交互作用。

2.2 堿脅迫對(duì)水稻葉片相對(duì)含水量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖2A可知，堿水平和pH對(duì)ZH11和NG52葉片相對(duì)含水量的主效應(yīng)均具有顯著的影響，且堿水平和pH的交互作用對(duì)ZH11和NG52葉片相對(duì)含水量具有顯著影響（P=0.001，P=0.004）。ZH11和NG52葉片相對(duì)含水量在30C處理較CK分別降低了41.18%和29.53%。分析兩種材料葉片相對(duì)含水量發(fā)現(xiàn)，在CK時(shí)ZH11和NG52葉片相對(duì)含水量無顯著差異，但隨著脅迫程度的增加，在30A、30B和30C處理時(shí)，NG52葉片相對(duì)含水量顯著大于ZH11（P<0.05）。

圖2 堿脅迫對(duì)水稻葉片相對(duì)含水量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響Fig. 2 Effects of alkali stress on relative water content and osmotic adjustment substances of rice leaves

分析圖2B可知，堿水平和pH對(duì)ZH11和NG52的Pro含量主效應(yīng)均具有顯著的影響（P<0.001）。堿水平和pH的交互作用對(duì)ZH11的Pro含量具有顯著影響（P=0.004），對(duì)NG52的Pro含量無顯著影響（P=0.695）。ZH11和NG52的Pro含量在30C處理時(shí)達(dá)到最大值，分別較 CK增加 326.83%和368.99%。比較兩種材料在各處理下的 Pro含量可得，在CK時(shí)ZH11和NG52的Pro含量差異不顯著；在10B、10C、20A、20B和30C處理時(shí)，NG52的Pro含量顯著高于ZH11（P<0.05）。

由圖2C可得，堿水平和pH對(duì)ZH11和NG52的SS含量主效應(yīng)均具有顯著的影響（P<0.001），且堿水平和pH的交互作用對(duì)ZH11和NG52的SS含量具有顯著影響（P<0.001）。ZH11和NG52的SS含量在30C處理時(shí)達(dá)到最大值，分別較CK增加49.49%和77.40%。比較各處理下兩種材料的SS含量發(fā)現(xiàn)，在CK時(shí)ZH11的SS含量顯著大于NG52（P<0.05），但隨著脅迫程度的增加，NG52的 SS含量的增幅逐漸大于ZH11，其中在10C、30A、30B和30C處理時(shí)顯著大于ZH11（P<0.05）。

分析圖2D可得，堿水平和pH對(duì)ZH11和NG52的SP含量主效應(yīng)均具有顯著的影響（P<0.001）。堿水平和pH的交互作用對(duì)ZH11和NG52的SP含量具有顯著影響（P=0.001，P=0.007），ZH11和NG52的SP含量在30C處理時(shí)達(dá)到最大值，分別較CK增加54.67%和129.00%。對(duì)比各處理下兩種材料的SP含量發(fā)現(xiàn)，在CK時(shí)ZH11的SP含量是NG52的1.60倍，但在30C處理時(shí)ZH11的SP含量是NG52的1.08倍。

綜合分析圖2A、B、C、D發(fā)現(xiàn)，ZH11和NG52的相對(duì)含水量在30A處理下較20C處理均有增加，SS含量在 30A處理下較 20C處理顯著降低（P<0.05），Pro和SP含量30A處理與20C處理相比無顯著差異。

2.3 堿脅迫對(duì)水稻葉片脂質(zhì)過氧化和活性氧含量的影響

分析圖3A可得，堿水平和pH均顯著影響ZH11和NG52的MDA含量（P<0.001），且兩者的交互作用也顯著影響 ZH11和 NG52的 MDA含量（P=0.014，P=0.047）。ZH11和NG52的MDA含量在 30C處理時(shí)升高至最大值，較 CK分別增加86.32%和50.02%。對(duì)比各處理下兩種材料的MDA含量發(fā)現(xiàn)，在CK時(shí)，ZH11和NG52 MDA含量差異不顯著；但隨著脅迫程度的增加，ZH11 MDA含量均大于NG52，除20B和30A處理外，其余各處理ZH11 MDA含量均顯著高于NG52（P<0.05）。

圖3 堿脅迫對(duì)水稻葉片脂質(zhì)過氧化和活性氧含量的影響Fig. 3 Effects of alkali stress on lipid peroxidation and reactive oxygen species of rice leaves

由圖3B可知，堿水平和pH均顯著影響ZH11和NG52的LOX活性（P<0.001），但兩者的交互作用未顯著影響 ZH11和 NG52的 LOX活性（P=0.775，P=0.144）。ZH11和NG52的LOX活性在30C處理時(shí)增幅分別為277.92%和191.55%。分析兩種材料在各處理下的LOX活性發(fā)現(xiàn)，ZH11和NG52 LOX活性在CK時(shí)差異不顯著；但隨著脅迫程度的增加，從10B—30C處理ZH11 LOX活性均顯著大于NG52（P<0.05）。

分析圖3C可得，堿水平和pH均顯著影響ZH11和NG52的O2·-產(chǎn)生速率（P<0.001），且兩者的交互作用對(duì) ZH11和 NG52的 O2·-產(chǎn)生速率具有顯著影響（P=0.004，P=0.007）。ZH11和NG52的O2·-產(chǎn)生速率在30C處理時(shí)升高至最大值，增幅分別為161.70%和130.39%。比較各處理下兩種材料的O2·-產(chǎn)生速率發(fā)現(xiàn)，在整個(gè)脅迫期間，ZH11的O2·-產(chǎn)生速率均顯著高于NG52（P<0.05）。

由圖3D可得，堿水平和pH均顯著影響ZH11和NG52的H2O2含量（P<0.001），且兩者的交互作用對(duì)ZH11和 NG52的 H2O2含量具有顯著影響（P=0.001，P<0.001）。ZH11和NG52的H2O2含量在30C處理時(shí)升高至最大，增幅分別為291.40%和124.06%。分析各處理下兩種材料的H2O2含量發(fā)現(xiàn)，ZH11和NG52的H2O2含量在CK時(shí)差異不顯著；但隨著脅迫程度的增加，從10C到30C處理ZH11的H2O2含量均顯著大于NG52（P<0.05）。

綜合分析圖3A、B、C、D發(fā)現(xiàn)，ZH11和NG52的O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量以及ZH11的MDA含量和LOX活性在30A處理下較20C處理顯著降低（P<0.05），NG52的MDA含量和LOX活性在30A處理與20C處理相比無顯著差異。

2.4 堿脅迫對(duì)水稻葉片抗氧化酶活性的影響

由圖4A可知，堿水平和pH均顯著影響ZH11和NG52的SOD活性（P<0.001），兩者的交互作用對(duì)NG52的SOD活性具有顯著影響（P=0.001），對(duì)ZH11的SOD活性無顯著影響（P=0.081）。ZH11和 NG52的 SOD活性在 30C處理下增幅分別為99.71%和 145.61%。分析兩種材料在各處理下的SOD活性發(fā)現(xiàn)，在CK時(shí)ZH11的SOD活性顯著大于 NG52（P<0.05），但隨著脅迫程度的增加，NG52的SOD活性的增幅逐漸大于ZH11，其中在20C、30B和30C處理時(shí)顯著大于ZH11（P<0.05）。

圖4 堿脅迫對(duì)水稻葉片抗氧化酶活性的影響Fig. 4 Effects of alkali stress on antioxidant enzyme activities of rice leaves

分析圖4B可知，堿水平和pH對(duì)ZH11和NG52的 POD活性的主效應(yīng)均產(chǎn)生顯著影響，兩者的交互作用對(duì)ZH11和NG52的POD活性無顯著影響（P=0.281，P=0.305）。ZH11和NG52的在30C處理時(shí)較CK增幅最大，分別為17.60%和37.30%。比較各處理下兩種材料的 POD活性得，在各個(gè)處理下，NG52的POD活性均顯著大于ZH11的POD活性（P<0.05）。

由圖4C可知，堿水平和pH均顯著影響ZH11和NG52的CAT活性，兩者的交互作用對(duì)NG52的CAT活性具有顯著影響（P=0.005），對(duì) ZH11的CAT活性無顯著影響（P=0.775）。ZH11和NG52的CAT活性在30C處理時(shí)較CK增幅最大，分別較較CK增加79.25%和116.22%。分析各處理下兩種材料的CAT活性發(fā)現(xiàn)，在CK時(shí)ZH11的CAT活性顯著大于 NG52（P<0.05），隨著脅迫程度的增加，ZH11和NG52的CAT活性差距逐漸減小，在20A和30A時(shí)達(dá)到無顯著差異水平。

綜合分析圖 4A、B、C發(fā)現(xiàn)，ZH11和 NG52的SOD活性以及ZH11的POD活性在30A處理下較 20C處理顯著降低（P<0.05），ZH11和 NG52的CAT活性以及NG52的POD活性在30A處理與20C處理相比無顯著差異。

2.5 堿脅迫對(duì)水稻葉片還原型抗壞血酸（ASA）和還原型谷胱甘肽（GSH）含量的影響

分析圖5A可知，堿水平和pH均顯著影響ZH11和NG52的ASA含量（P<0.001），兩者的交互作用對(duì) ZH11和 NG52的 ASA含量具有顯著影響（P<0.001，P<0.001）。ZH11和NG52的ASA含量在30C處理時(shí)增至最大，分別較CK增加83.33%和126.95%。比較兩種材料在各個(gè)處理下ASA含量發(fā)現(xiàn)，在CK時(shí)ZH11的ASA含量顯著大于NG52（P<0.05），隨著脅迫程度的增加，ZH11和 NG52的ASA含量差距逐漸減小，從20B至30C處理時(shí)兩種材料的ASA含量無顯著差異。

由圖5B可知，堿水平和pH均顯著影響ZH11和NG52的GSH含量（P<0.001），兩者的交互作用對(duì)NG52的GSH含量具有顯著影響（P<0.001），對(duì)ZH11的GSH含量無顯著影響（P=0.056）。ZH11和NG52的GSH含量在30C處理時(shí)增至最大，分別較CK增加32.12%和61.61%。分析各個(gè)處理下兩種材料的GSH含量發(fā)現(xiàn)，在CK時(shí)ZH11的GSH含量顯著大于NG52（P<0.05），但從10A至30C處理時(shí) NG52的 GSH含量顯著大于 ZH11（P<0.05）。

綜合分析圖5A、B發(fā)現(xiàn)，ZH11和NG52的GSH含量以及ZH11的ASA含量在30A處理下較20C處理顯著降低（P<0.05），NG52的ASA含量在30A處理與20C處理相比無顯著差異。

圖5 堿脅迫對(duì)水稻葉片ASA和GSH含量的影響Fig. 5 Effects of alkali stress on ASA and GSH contents of rice leaves

2.6 水稻幼苗受害等級(jí)的建立

2.6.1 主成分分析及生理參數(shù)的選擇

對(duì)所有生理指標(biāo)進(jìn)行主成分分析（表 2）。在ZH11中提取出1個(gè)主成分，特征根為15.787，累計(jì)貢獻(xiàn)率為92.867%。在NG52中共提取出2個(gè)主成分，第1主成分主要包括Chla、Chlb、Chl、RWC、抗氧化酶、脂質(zhì)過氧化、活性氧、滲透調(diào)劑物質(zhì)、ASA和 GSH，特征根為 14.901，累計(jì)貢獻(xiàn)率為87.653%。第 2主成分以 Chla/b為主，特征根為1.321，累計(jì)貢獻(xiàn)率為95.422%。因此，兩種材料提取出的主成分均可以描述所有指標(biāo)，但由前文可知，許多指標(biāo)反映結(jié)果相關(guān)性較高、重疊性較大，為簡化計(jì)算，綜合各指標(biāo)得分的絕對(duì)值，在葉綠素含量、抗氧化酶、脂質(zhì)過氧化、活性氧、滲透調(diào)劑物質(zhì)和非酶類抗氧化物質(zhì)等6類生理指標(biāo)中，挑選Chla、SOD、MDA、H2O2、SS、ASA 作為受害等級(jí)劃分的判定依據(jù)。

表2 兩種水稻葉片生理參數(shù)的主成分分析Table 2 Principal component analysis of physiological parameter in rice leaves

2.6.2 已選生理參數(shù)權(quán)重的確定和受害等級(jí)構(gòu)建

將Chl a、SOD、MDA、H2O2、SS、ASA等6個(gè)指標(biāo)進(jìn)行極值標(biāo)準(zhǔn)化，然后用熵權(quán)法求得各指標(biāo)權(quán)重如表3所示。

表3 Chla、SOD、MDA、H2O2、SS和ASA的權(quán)重Table 3 Weight coefficient of Chla, SOD, MDA, H2O2, SS and ASA

參考徐超等（2021）的方法引入堿脅迫指數(shù)Z，公式如下：

Z=(ZA×|ACK?A|/ACK+ZB×|BCK?B|/BCK+ZC×|CCK?

C|/CCK+ZD×|DCK?D|/DCK+ZE×|ECK?E|/ECK+ZF×|

FCK?F|/FCK)×10

式中：

Z——堿脅迫指數(shù)；

ZA、ZB、ZC、ZD、ZE、ZF——Chl a、SOD、MDA、H2O2、SS、ASA的權(quán)重；

ACK、BCK、CCK、DCK、ECK、FCK——對(duì)照下Chl a、SOD、MDA、H2O2、SS、ASA的值；

A、B、C、D、E、F——分別堿脅迫下Chl a、SOD、MDA、H2O2、SS、ASA的值。

根據(jù)上述公式計(jì)算出堿脅迫指數(shù)變化規(guī)律如圖6所示，水稻正常生長時(shí)，其堿脅迫指數(shù)為0。隨著堿水平和pH的增加，堿脅迫程度逐漸加重。根據(jù)Z值的變化規(guī)律，把水稻受害等級(jí)劃分為正常、輕度、中度、重度和特重度 5個(gè)脅迫等級(jí)。即當(dāng)0≤Z<1為正常水平，當(dāng)1≤Z<4為輕度脅迫，當(dāng)4≤Z<7為中度脅迫，當(dāng)7≤Z<10為重度脅迫，當(dāng)10≤Z為特重度脅迫。

圖6 水稻受害等級(jí)的劃分Fig. 6 Classification of injury grades in Rice

根據(jù)上述劃分的等級(jí)得出各個(gè)處理所對(duì)應(yīng)的堿脅迫等級(jí)（表4）。對(duì)ZH11來說，10A和10B處理為輕度脅迫，10C、20A、20B和 30A處理為中度脅迫，20C和30B處理為重度脅迫，30C處理為特重度脅迫。對(duì)NG52來說，10A、10B和10C處理為輕度脅迫，20A、20B、20C和 30A處理為中度脅迫，30B和30C處理為重度脅迫，無特重度脅迫。

表4 堿脅迫指數(shù)在不同處理下的變化規(guī)律Table 4 Changes of alkali stress index with different treatments

3 討論

3.1 不同水稻品種幼苗響應(yīng)堿脅迫的生理差異

鹽堿脅迫引起的滲透脅迫不僅影響葉綠素的合成，同時(shí)也加速已合成葉綠素的降解（Huang et al.，2019）。鹽堿脅迫引起的高 pH，破壞了離子穩(wěn)態(tài)，使與葉綠素合成有關(guān)離子如Fe2+、Mg2+、Cu2+等沉淀，進(jìn)而打破了葉綠素合成與分解的動(dòng)態(tài)平衡，導(dǎo)致葉綠素含量降低（高立楊等，2020）。葉綠素含量是體現(xiàn)植物光合速率的重要生理參數(shù)（Izadi-Darbandi et al.，2018）。在本研究中，堿脅迫減少了Chl a、Chl b和Chl的含量，并且隨著脅迫程度的增加而顯著降低，這可能是因?yàn)閴A脅迫降低了葉綠素合成酶的活性，或是破壞了葉綠素的結(jié)構(gòu)使其降解，這與賈旭梅（2019）和 Huang et al.（2019）的研究結(jié)果一致。此外，在堿敏感品種“中花11”中，Chl a/b在脅迫期間整體上呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；而耐堿品種“寧粳52”的Chl a/b呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)樵诿{迫初期，堿脅迫引起的Chl b含量的下降程度高于Chl a，即Chl a/b的比值增加，隨著脅迫程度的增加，Chl a/b的比值開始降低，可能是不同耐堿材料響應(yīng)堿脅迫的不同生理策略，這與賈婷婷等（2018）在鹽脅迫下沙棗（Elaeagnus angustifolia）中Chl a/b的變化趨勢(shì)相同。在本研究中，Chl a和Chl含量以及Chl a/b的比值在30A處理下較20C處理有顯著升高，且在隨后的處理下又開始降低，說明20C處理的脅迫程度大于30A處理，即20C處理對(duì)水稻幼苗葉綠素含量的損傷大于30A處理。

相對(duì)含水量用于體現(xiàn)植物在不同環(huán)境條件下的含水量和滲透調(diào)節(jié)能力，相對(duì)較高的水分含量可以維持蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定（Ravikumar et al.，2014）。滲透脅迫是植物遭受鹽堿脅迫時(shí)最先引發(fā)的次級(jí)鹽害，積累溶質(zhì)來進(jìn)行滲透調(diào)節(jié)是緩解鹽堿脅迫的主要途徑；目前，細(xì)胞內(nèi)合成的有機(jī)溶質(zhì)主要有脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白和甜菜堿等（Deinlein et al.，2014）。在本研究中，堿脅迫下兩種水稻葉片相對(duì)含水量均有降低，脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量均持續(xù)增加；其中“中花11”相對(duì)含水量降幅大于“寧粳52”，脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白含量的增幅均小于“寧粳52”，可見，耐堿材料是通過積累較多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來減緩含水量的降低，這與曹齊衛(wèi)等（2015）在黃瓜（Cucumis sativus）中的研究結(jié)果類似。此外，水稻葉片相對(duì)含水量在30A處理下較20C處理顯著升高，可溶性糖含量在30A處理下較20C處理有顯著降低，說明30A處理對(duì)水稻含水量和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響大于20C處理。

植物在鹽堿脅迫下，由于氣孔關(guān)閉，葉片內(nèi)CO2濃度降低，導(dǎo)致植物光合作用被抑制，碳同化受阻，為保持光合電子傳遞鏈的正常運(yùn)行，O2被直接還原為O2·-，最終引起體內(nèi)包括過氧化氫（H2O2），羥基自由基（OH-），超氧自由基（O2·-）和單線性氧（1O2）在內(nèi)的活性氧（ROS）不斷積累（Baxter et al.，2014；Ye et al.，2021）。大量積累的ROS可作用于細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)和磷脂雙分子層，致使膜上多聚不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acids，PUFAs）發(fā)生降解。脂氧合酶（LOX）催化膜上PUFAs的氧化反應(yīng)，導(dǎo)致膜脂過氧化，丙二醛（MDA）是PUFAs過氧化的產(chǎn)物（Doderer et al.，1992）。在本研究中，MDA、LOX和H2O2含量以及O2·-產(chǎn)生速率均隨堿脅迫程度的增加而增加，說明堿脅迫對(duì)引起的氧化損傷對(duì)水稻的生長產(chǎn)生了影響；堿敏感品種“中花11”MDA、LOX和H2O2含量以及O2·-產(chǎn)生速率增幅大于耐堿品種“寧粳52”，說明耐堿性水稻品種通過降低細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化和產(chǎn)生更少的ROS來提高植株的耐堿性，這與Kumar et al.（2020）的研究結(jié)果相似。此外30A處理下的MDA、LOX和H2O2含量以及O2·-產(chǎn)生速率較20C處理顯著降低，說明30A處理下水稻受傷害程度較輕。

植物在清除 ROS的過程中會(huì)啟動(dòng)由多種抗氧化酶和非酶類抗氧化劑組成的抗氧化防御系統(tǒng)，其中酶類的抗氧化劑被認(rèn)為是清除 ROS最直接、最有效的途徑（Apel et al.，2004），SOD是抵抗ROS的第一道防線。SOD 催化 2O2·-+2H+→H2O2+O2的反應(yīng)，H2O2進(jìn)一步被POD和CAT分解（Qin et al.，2018；鐘嘉文等，2021）?？箟难幔ˋSA）是主要的抗氧化劑，可以直接淬滅ROS（Tuteja et al.，2010）。在不同的抗氧化反應(yīng)，ASA供給電子并通過清除O2·-和OH-保護(hù)植物細(xì)胞膜（Hasanuzzaman et al.，2014）。谷胱甘肽（GSH）是另一種重要的抗氧化劑，可以通過谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GPX）和谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase，GST）酶清除ROS或有毒化合物，從而提高植物對(duì)逆境耐受性（SzalaI et al.，2009）。本研究結(jié)果表明，隨著堿脅迫程度的增加，SOD、POD和CAT活性以及ASA和GSH含量均持續(xù)增加，堿敏感品種“中花11”SOD、POD和CAT活性以及ASA和GSH含量增幅小于耐堿品種“寧粳52”，說明耐堿性水稻品種通過合成更多的抗氧化酶和抗氧劑來清除ROS，進(jìn)而提高自身的耐受性，Zhang et al.（2017）的研究也得出了相似的結(jié)論。此外，SOD和POD活性以及GSH含量在30A處理時(shí)顯著降低，暗示30A處理下植株合成較少的ROS，進(jìn)而致使SOD和POD活性以及GSH含量相對(duì)較低。

3.2 水稻應(yīng)答堿脅迫的階段性變化及受害等級(jí)構(gòu)建

安玉艷等（2012）提出植物在應(yīng)對(duì)不同程度的逆境脅迫時(shí)存在階段性變化，在不同的階段著重點(diǎn)不同。王慧等（2017）研究發(fā)現(xiàn)檉柳（Tamarix chinensis Lour.）總有機(jī)碳和營養(yǎng)元素在不同程度的鹽堿脅迫階段差異較大，其中在中度鹽堿脅迫階段總有機(jī)碳和全鉀含量最高，及在此階段植株主要通過增加總有機(jī)碳和全鉀含量來提高對(duì)鹽堿脅迫的適應(yīng)性。本研究通過主成分分析提取6個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)，將堿脅迫傷害劃分為正常（0≤Z<1）、輕度（1≤Z<4）、中度（4≤Z<7）、重度（7≤Z<10）、特重度（10≤Z）5 個(gè)等級(jí)。在 10C（10 mmol·L?1、pH 10.50）、20C（20 mmol·L?1、pH 10.50）、30C（30 mmol·L?1、pH 10.50）時(shí)，堿敏感水稻ZH11受害等級(jí)分別為中度、重度、特重度，而對(duì)應(yīng)的耐堿材料NG52受害等級(jí)則為輕度、中度、重度。說明不同堿敏感水稻在不同脅迫階段會(huì)啟動(dòng)不同的防御機(jī)制，進(jìn)而影響水稻的抗堿性。在 20C（20 mmol·L?1、pH 10.50）處理下，兩種材料應(yīng)答堿脅迫的差異較大，因此可作為篩選不同堿敏感水稻的閥值。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從10A處理到20C處理階段，葉綠素（Chla、Chlb、Chl）含量、葉綠素 a/b（Chla/b）和葉片相對(duì)含水量呈降低趨勢(shì)；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（Pro、SS、SP）含量、丙二醛（MDA）含量、脂氧合酶（LOX）活性、活性氧（O2·-和 H2O2）、抗氧化酶（SOD、POD和CAT）活性、還原型抗壞血酸（ASA）和還原型谷胱甘肽（GSH）含量不斷升高。在30A處理下，Chl a和Chl含量以及Chl a/b的比值、葉片相對(duì)含水量較20C處理有顯著升高，可溶性糖、MDA、LOX、H2O2、O2·-產(chǎn)生速率、SOD、POD、GSH較20C處理有顯著降低；通過堿脅迫等級(jí)的劃分發(fā)現(xiàn)，堿敏感品種“中花11”20C處理下為重度脅迫，30A為中度脅迫，說明中等堿水平（20 mmol·L?1）高 pH（10.50）組合對(duì)水稻的傷害大于高堿水平（30 mmol·L?1）低 pH（8.65）組合，即當(dāng)堿水平大于20 mmol·L?1時(shí)，堿水平和高pH之間有明顯的相互作用。Zhang et al.（2020）的研究也發(fā)現(xiàn)，在低鹽堿水平下，pH值增加對(duì)桑樹（Morus alba）幼苗葉片光系統(tǒng)Ⅱ（photosystem Ⅱ complex，PSⅡ）的影響很小，但是，在高鹽堿水平下，較高的pH值對(duì)鹽堿脅迫下PSⅡ反應(yīng)中心的光化學(xué)活性產(chǎn)生較大的影響。

4 結(jié)論

（1）堿脅迫引起水稻各生理參數(shù)的變化，兩種水稻品種在堿脅迫程度下會(huì)啟動(dòng)不同的防御機(jī)制以響應(yīng)堿脅迫。耐堿品種“寧粳52”通過保持較高葉綠素含量和葉片相對(duì)含水量，以及合成較多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，并提高抗氧化防御系統(tǒng)的能力來清除多余的ROS來增強(qiáng)植株的耐堿性。

（2）運(yùn)用主成分分析，挑選出 Chla、SOD、MDA、H2O2、SS、ASA等關(guān)鍵指標(biāo)，通過計(jì)算脅迫指數(shù)Z，將水稻受害等級(jí)劃分為正常（0≤Z<1）、輕度（1≤Z<4）、中度（4≤Z<7）、重度（7≤Z<10）、特重度（10≤Z）5個(gè)等級(jí)。

（3）在低堿水平（10 mmol·L?1）下，pH 對(duì)水稻的生理參數(shù)和脅迫等級(jí)影響較小，但在堿水平大于20 mmol·L?1時(shí)，堿水平和高pH有明顯的相互作用，對(duì)水稻的生理參數(shù)和脅迫等級(jí)的影響增大。因此，在鹽堿地種植水稻時(shí)應(yīng)考慮總鹽堿水平和 pH共同對(duì)水稻生長的影響。