部分水解瓜爾豆膠對(duì)高脂高糖飲食誘導(dǎo)小鼠代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用

吳塵萱， 豐 碩， 劉 軍， 李延嘯， 閆巧娟， 江正強(qiáng),*

(1.中國(guó)輕工業(yè)食品生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院， 北京 100083；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué) 工學(xué)院， 北京 100083)

世界范圍內(nèi)2型糖尿病的發(fā)病率正在逐年上升，目前全球有3.74億人存在空腹血糖受損或糖耐量減低等癥狀；此外，全球有19億成年人存在超重現(xiàn)象，肥胖已超過(guò)6億人[1]。高脂高糖飲食是慢性代謝疾病(肥胖、2型糖尿病)的重要風(fēng)險(xiǎn)因素之一。流行病學(xué)調(diào)查表明，飲食調(diào)節(jié)有助于改善高血糖、高血脂或胰島素抵抗，是延遲或預(yù)防肥胖及2型糖尿病的有效干預(yù)措施[2]，因此，開發(fā)具有輔助改善糖脂代謝紊亂功能的食品已迫在眉睫。

膳食纖維無(wú)毒副作用，具有極低的血糖指數(shù)，能降低血糖血脂、提高免疫力和改善腸道環(huán)境，已被用于糖尿病患者的血糖控制以及成人膳食中的能量控制[2]。膳食纖維菊粉和β-葡聚糖已在肥胖、糖尿病等代謝疾病的防治中廣泛應(yīng)用[3]。部分水解瓜爾豆膠(partially hydrolyzed guar gum, PHGG)是一種水溶性膳食纖維，平均分子質(zhì)量為25 kDa，含有總膳食纖維的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.6%，且其黏度低，耐高溫、耐酸、耐鹽并且抗消化酶，在食品工業(yè)中常作為增稠劑或乳液穩(wěn)定劑[4-5]。許多研究發(fā)現(xiàn)，PHGG具有降膽固醇、降血脂和降血糖等利于機(jī)體代謝平衡的生理功效[6-7]。在人體臨床實(shí)驗(yàn)中也證實(shí)，PHGG可被結(jié)腸內(nèi)腸道菌群利用，促進(jìn)擬桿菌門益生菌增殖，增加短鏈脂肪酸(short chain fatty acid，SCFAs)的含量，從而改善腸道功能[7]；在2型糖尿病模型db/db小鼠中，PHGG可顯著調(diào)節(jié)小腸黏膜上有關(guān)免疫防御和膽固醇吸收的基因表達(dá)[8]；在自發(fā)性糖尿病模型OLETF大鼠中，PHGG具有控制體質(zhì)量、降低血脂、緩解組織炎癥以及改善胰島素抵抗的功效[9]。在2型糖尿病或代謝綜合征患者中，日常飲食添加PHGG可降低患者的糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)、游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)以及尿蛋白排泄率，并改善心血管和體內(nèi)代謝情況[10]；在健康受試者中，PHGG可調(diào)節(jié)體內(nèi)血脂水平及餐后2 h血糖，提升受試者的葡萄糖耐量[11]。關(guān)于PHGG調(diào)節(jié)血糖，減少FFA已有較多實(shí)驗(yàn)結(jié)論，然而在高脂高糖飲食條件下，PHGG調(diào)控糖脂代謝的保護(hù)功效及其作用機(jī)制尚不清楚。本研究擬利用高脂高糖飼料喂養(yǎng)誘導(dǎo)小鼠16周，并從誘導(dǎo)喂養(yǎng)的第8周開始加入PHGG干預(yù)，觀察小鼠血糖血脂的變化情況并探討PHGG對(duì)糖脂代謝的調(diào)控機(jī)制，希望為具有防治慢性代謝疾病潛力的PHGG功能性食品開發(fā)提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

ICR(CD- 1)小鼠(雄性，3周齡)，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016- 0006。

PHGG，北京瓜爾潤(rùn)科技有限公司，生產(chǎn)控制參照GB 1886.301—2018《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 半乳甘露聚糖》；小鼠低脂對(duì)照飼料和高脂高糖飼料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司。低脂對(duì)照飼料中脂肪、碳水化合物和蛋白質(zhì)的供能比分別為10%、70%和20%；高脂高糖飼料中脂肪、碳水化合物和蛋白質(zhì)的供能比分別為42%、42.7%和15.2%。

二甲雙胍，華中海威(北京)基因科技有限公司；葡萄糖(glucose，GLU)、甘油三酯(triacylglyceride，TG)、膽固醇(totalcholesterol，TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL- C)、游離脂肪酸，南京建成生物科技有限公司；胰島素(insulin，INS)、糖化血紅蛋白、脂聯(lián)素(adiponectin)、胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP- 1)和葡萄糖依賴性促胰島素多肽(glucose-dependent insulinotropic polypeptide，GIP)，上海鑫樂(lè)生物科技有限公司；Trizol 試劑，美國(guó)賽默飛公司； GoScriptTMreverse transcription system 反轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國(guó)Promega公司；TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus) qPCR試劑，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司；一抗GPR43和GAPDH，北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔二抗，美國(guó)Cell Signaling Technology公司。

1.2 儀器與設(shè)備

易準(zhǔn)GA- 3型血糖儀及試紙，三諾生物傳感股份有限公司；BS- 330型全自動(dòng)生化分析儀，深圳麥瑞有限公司；CK40型光學(xué)顯微鏡，日本Olympus公司；1260型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司；Multiskan FC型酶標(biāo)儀，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；CFX ConnectTM型實(shí)時(shí)定量PCR儀、ChemiDoc XRS型顯影系統(tǒng)，美國(guó)BIO- RAD公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1模型建立與飼養(yǎng)

小鼠飼養(yǎng)溫度為(23 ± 2) ℃，相對(duì)濕度50%～60%，12 h光照循環(huán)，自由攝食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合國(guó)家《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。飼喂3周齡雄性ICR小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取8只小鼠作為正常組，飼喂低脂對(duì)照飼料，其余小鼠以高脂高糖小鼠飼料喂養(yǎng)8周構(gòu)建模型，與正常組相比體質(zhì)量超重40%的小鼠視為高脂高糖飼料誘導(dǎo)成功的模型。將模型小鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，分別為模型組、二甲雙胍組、PHGG低劑量組(PHGG- L)、PHGG中劑量組(PHGG- M)和PHGG高劑量組(PHGG- H)。灌胃劑量按照小鼠單位體質(zhì)量計(jì)算，根據(jù)團(tuán)隊(duì)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，設(shè)定PHGG- L、PHGG- M和PHGG- H組灌胃PHGG的劑量分別為750、1 500、3 000 mg/(kg·d)，陽(yáng)性對(duì)照組灌胃二甲雙胍，劑量為150 mg/(kg·d)；正常組和模型組給予等體積的生理鹽水，連續(xù)灌胃給藥8周。灌胃期間，正常組飼喂低脂對(duì)照飼料，其余各組小鼠繼續(xù)飼喂高脂高糖飼料，每周測(cè)定小鼠體質(zhì)量。

1.3.2口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)及胰島素耐受實(shí)驗(yàn)

口服葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)在灌胃給藥開始前和灌胃第6周進(jìn)行。參照J(rèn)un等[12]實(shí)驗(yàn)方法，小鼠禁食12 h后，葡萄糖按照2 g/kg劑量灌胃，尾尖采血，測(cè)定小鼠在灌胃葡萄糖后0、30、60、90、120 min的血糖水平。胰島素耐受實(shí)驗(yàn)(insulin tolerance test，ITT)在灌胃第7周進(jìn)行，小鼠禁食4 h后，胰島素按照1 IU/kg劑量腹腔注射，尾尖采血，測(cè)定小鼠在腹腔注射胰島素后0、15、30、45、60、90 min的血糖水平。梯形法計(jì)算曲線下面積。

1.3.3組織采集處理

給藥期結(jié)束后，將小鼠隔夜禁食，眼眶取血后處死，取100 μL血液，收集血紅細(xì)胞，其余室溫靜置1 h，3 500 r/min離心10 min，留取上層血清。取小鼠小腸、盲腸、附睪脂肪。分離的血清和臟器均于-80 ℃保存?zhèn)錂z。

1.3.4生化指標(biāo)測(cè)定

血清樣本用于測(cè)定TC、TG、LDL、FFA、脂聯(lián)素、GIP和GLP- 1含量，血紅細(xì)胞樣本用于測(cè)定HbA1c含量，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)，并按照試劑盒的相關(guān)說(shuō)明操作。

1.3.5脂肪組織蘇木精-伊紅染色

參照J(rèn)un等[12]的方法進(jìn)行蘇木精- 伊紅染色(H&E染色)。取小鼠腹部脂肪組織，大小約2 mm×15 mm×10 mm，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的多聚甲醛固定；將組織按照從低到高的酒精濃度浸泡脫水，并在二甲苯中透明處理，浸入已溶化的石蠟中包埋并按照5 μm厚度切片；利用二甲苯脫蠟，并由高濃度到低濃度的酒精浸泡漂洗；蘇木精水溶液中染色30 min，酸水及氨水中分色，流水沖洗1 h再浸入體積分?jǐn)?shù)為70%和90%的乙醇中脫水，置于酒精伊紅染色液染色2～3 min，無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。

1.3.6短鏈脂肪酸質(zhì)量濃度的測(cè)定

參考Dostal[13]的方法提取盲腸內(nèi)容物中的SCFAs并利用高效液相色譜分析。稱取一定的樣品，按照4 g/mL質(zhì)量濃度加入超純水勻漿，12 000 r/min離心10 min，收集上清液100 μL。依次加入50 μL濃鹽酸，2.5 mL乙醚，室溫靜止20 min。收集上層有機(jī)相，加入1 mol/L的NaOH 500 μL，室溫靜止20 min，收集下層水相，0.22 μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)行高效液相色譜分析。高效液相色譜分析條件：高效液相色譜儀和Hi- Plex H型色譜柱(300 mm×6.5 mm，80 um)；流動(dòng)相A為純水，流動(dòng)相B為5 mmol/L硫酸，混合體積比為流動(dòng)相A∶B=2∶3，流速為0.5 mL/min，柱溫55 ℃；進(jìn)樣量10 μL；VWD型紫外檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm。

1.3.7小鼠脂肪組織中炎性細(xì)胞標(biāo)記基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定

利用Trizol試劑提取小鼠組織中的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書方法合成cDNA，cDNA合成反應(yīng)體系中包含100 ng總mRNA。cDNA合成PCR參數(shù)設(shè)置為25 ℃,10 min；45 ℃,90 min；85 ℃, 10 min。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系20 μL，包含1×TB Green?Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)染料、0.4 μmol/L上下游引物、100 ng cDNA。95 ℃預(yù)變性30 s，熱循環(huán)條件為95 ℃反應(yīng)5 s，60 ℃反應(yīng)30 s，72 ℃反應(yīng)30 s，交替進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)結(jié)束后測(cè)定熒光強(qiáng)度。引物設(shè)計(jì)參考Pinheiro等[14]的方法，F(xiàn)4/80上游引物5′-CCTGAACATGCAACCTGCCAC-3′、下游引物5′-GGGCATGAGCAGCTGTAGGATC-3′，CD11：上游引物5′-AGCAGGTGGCATTGTGGGAC-3′、下游引物5′-ACCTCTGTTCTCCTCCTCTCCG-3′，β-actin：上游引物5′-GACTCCTATGTGGGTGACGA-3′、下游引物5′-ACGGTTGGCCTTAGGGTTCA-3′。β-actin作為內(nèi)參基因，mRNA相對(duì)表達(dá)量用2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.3.8小鼠小腸中短鏈脂肪酸受體GPR43的蛋白表達(dá)測(cè)定

利用含蛋白酶抑制劑的RAPI(中等強(qiáng)度)裂解液冰上裂解100 mg小腸組織30 min，4 ℃離心(12 000 r/min，15 min)，收集上清液。按照BCA蛋白定量試劑盒使用說(shuō)明書測(cè)定蛋白含量。以50 μg的上樣量，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行十二烷基硫酸鈉- 聚丙烯酰胺(SDS- PAGE)電泳。400 mA濕轉(zhuǎn)90 min轉(zhuǎn)到硝化纖維膜，使用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的脫脂奶粉的TBS- T溶液(Tris 10 mmol/L，NaCl 150 mmol/L，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Tween20，pH值8.0)封閉1 h；按照1∶1 000比例稀釋一抗GPR43和GAPDH，4 ℃孵育過(guò)夜后洗膜3次；將辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔二抗，按1∶5 000的比例稀釋，室溫孵育2 h；TBST 洗滌； ECL化學(xué)發(fā)光顯影、定影，ChemiDoc XRS系統(tǒng)進(jìn)行顯影處理，并用ImageJ軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行定量分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad prism 7軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示；采用One-Way ANOVA的Tukey’s多重檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，P<0.05表示顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PHGG對(duì)高脂高糖飲食小鼠體質(zhì)量變化的影響

PHGG對(duì)小鼠體質(zhì)量及增長(zhǎng)率的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1顯示，高脂高糖飼料喂養(yǎng)8周后小鼠體質(zhì)量顯著升高。開始灌胃后，各組的飲食條件不變。與正常組相比，模型組小鼠在高脂高糖飼料喂養(yǎng)下體質(zhì)量及增長(zhǎng)率持續(xù)升高。灌胃二甲雙胍后小鼠的體質(zhì)量比初始下降4.34%。灌胃8周不同劑量PHGG后，小鼠的體質(zhì)量均顯著低于模型組，體質(zhì)量增長(zhǎng)率降低，表明PHGG可控制高脂高糖飲食下的小鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)。

表1 PHGG對(duì)小鼠體質(zhì)量及增長(zhǎng)率的影響Tab.1 Effect of PHGG on mice bodyweight

2.2 PHGG對(duì)高脂高糖飲食小鼠葡萄糖及胰島素耐量的影響

PHGG對(duì)高脂高糖飲食小鼠葡萄糖及胰島素耐量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1(a)、(b)可見(jiàn)，灌胃初始時(shí)，高脂高糖飲食誘導(dǎo)的小鼠空腹血糖升高且糖耐量受損。由圖1(c)可見(jiàn)，在灌胃6周后，模型組小鼠的空腹血糖為8.63 mmol/L，高于正常組94.51%，OGTT曲線下面積(area under curve，AUC)顯著升高。與模型組相比，PHGG和二甲雙胍均降低了高脂高糖飲食誘導(dǎo)小鼠的空腹血糖。由圖1(d)可見(jiàn)，PHGG- L、PHGG- M、PHGG- H和二甲雙胍組小鼠的OGTT曲線下面積分別比模型組降低20.6%、35.49%、28.62%和41.80%，說(shuō)明PHGG可以改善高脂高糖飲食誘發(fā)的空腹血糖受損及糖耐量減低，有助于延緩2型糖尿病的發(fā)生。

ITT曲線反映小鼠的胰島素耐量。由圖1(e)和圖1(f)可見(jiàn)，正常組小鼠在注射胰島素后血糖值最大下降至初始血糖值的49.98%。與模型組小鼠相比，PHGG- L、PHGG- M、PHGG- H和二甲雙胍組的ITT曲線各時(shí)間點(diǎn)的血糖更低，曲線下面積分別下降了8.2%、29.51%、17.32%和42.10%，顯著改善小鼠的胰島素耐量和敏感性。

2.3 PHGG對(duì)高脂高糖飲食小鼠血糖穩(wěn)態(tài)的影響

PHGG對(duì)小鼠血糖穩(wěn)態(tài)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，模型組小鼠在攝入高脂高糖飲食16周后，空腹血清葡萄糖和胰島素水平顯著高于正常組小鼠，胰島素抵抗指數(shù)(4.70 mol/IU)比正常組(0.92 mol/IU)增加了5.1倍， 糖化血紅蛋白(HbAlc)含量(998.97 μg/mL)是正常組小鼠的(299.21 μg/mL)3.3倍。二甲雙胍及PHGG干預(yù)后各組小鼠體內(nèi)HbAlc含量顯著降低。PHGG- L組的血清葡萄糖含量和胰島素抵抗指數(shù)顯著下降，但血清胰島素含量未出現(xiàn)明顯變化。二甲雙胍、PHGG- M及PHGG- H組小鼠的血清葡萄糖含量分別下降至4.48、5.24、5.37 mmol/L，胰島素含量分別下降至10.58、11.94、12.17 pmol/L，胰島素抵抗指數(shù)比模型組分別下降了61.36%、49.68%、48.11%。研究結(jié)果表明，PHGG可維持小鼠基礎(chǔ)狀態(tài)胰島素分泌的穩(wěn)定以及葡萄糖穩(wěn)態(tài)。

2.4 PHGG對(duì)高脂高糖飲食小鼠脂質(zhì)代謝的影響

PHGG干預(yù)對(duì)高脂高糖飲食小鼠的血脂代謝影響情況見(jiàn)表3。不同劑量PHGG干預(yù)后，小鼠血清中的TG含量下降效果與二甲雙胍組(1.54 mmol/L)一致。與模型組相比，PHGG- M和PHGG- H組的TC、LDL- C和FFA水平均顯著下降，其中，PHGG- M組的TG、TC、LDL- C和FFA水平比模型組分別降低了21.56%、32.67%、25.66%和22.91%；此外，高脂高糖誘導(dǎo)后小鼠體內(nèi)脂聯(lián)素的質(zhì)量濃度(8.44 mg/L)比正常組的(11.76 mg/L)下降28.23%，而二甲雙胍、PHGG- M及PHGG- H組小鼠的脂聯(lián)素水平與正常組無(wú)顯著性差異。該結(jié)果提示，PHGG可改善小鼠體內(nèi)脂代謝紊亂，并且PHGG血糖調(diào)節(jié)作用與脂肪組織相關(guān)。

PHGG對(duì)小鼠脂肪組織及體脂率的影響見(jiàn)圖2。圖2表明，模型組小鼠腹部脂肪及皮下脂肪質(zhì)量顯著高于正常組；與模型相比，PHGG- L組小鼠的腹部脂肪和皮下脂肪質(zhì)量未出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)，但PHGG- M組腹部脂肪降低35.56%，皮下脂肪降低41.20%，效果接近二甲雙胍組。該結(jié)果與血清脂代謝數(shù)據(jù)變化規(guī)律一致，表明PHGG對(duì)小鼠體質(zhì)量的調(diào)控可能與控制小鼠脂肪含量相關(guān)，但不存在劑量依賴關(guān)系，其中1 500 mg/(kg·d)的PHGG(PHGG- M組)效果較佳。

##表示模型組與正常組相比差異極顯著(p<0.01)；*表示與模型組相比差異顯著(P<0.05)；**表示與模型組相比差異極顯著(p<0.01)。AUC表示曲線下面積。圖1 PHGG對(duì)小鼠葡萄糖耐量和胰島素耐量的影響Fig.1 Effect of PHGG on OGTT and ITT of mice

選定PHGG- M組劑量開展研究。利用H&E染色觀察PHGG對(duì)小鼠腹部脂肪組織形態(tài)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3(a)、圖3(b)可知，正常組小鼠腹部脂肪組織的細(xì)胞大小排列整齊，有完整的脂肪小葉結(jié)構(gòu)；模型組脂肪細(xì)胞明顯增生肥大，細(xì)胞平均直徑比正常組增大88.70%，脂肪細(xì)胞成團(tuán)狀分布，邊緣模糊。與模型組相比，二甲雙胍組和PHGG中劑量組的脂肪細(xì)胞平均直徑分別減少27.10%和17.00%，脂肪積累明顯被抑制。脂肪組織mRNA表達(dá)情況見(jiàn)圖3(c)，模型組的腹部脂肪組織中巨噬細(xì)胞的標(biāo)記基因F4/80和CD11表達(dá)顯著上升，而二甲雙胍與PHGG- M處理后F4/80和CD11的表達(dá)分別下降42.30%和63.80%，推測(cè)PHGG減輕了小鼠腹部脂肪組織的炎性細(xì)胞。

表2 PHGG對(duì)小鼠血糖穩(wěn)態(tài)的影響Tab.2 Effect of PHGG on glucose homeostasis in mice

表3 PHGG對(duì)小鼠脂質(zhì)代謝的影響Tab.3 Effect of PHGG on lipid metabolism in mice

#表示模型組與正常組相比差異顯著(P<0.05)，*表示與模型組相比差異顯著(P<0.05)，**表示與模型組相比差異極顯著(P<0.01)。圖2 PHGG對(duì)小鼠脂肪組織及體脂率的影響Fig.2 Effects of PHGG on adipose tissue and body fat percentage in mice

2.5 PHGG對(duì)小鼠GIP及GLP- 1分泌的影響

GIP和GLP- 1是具有降糖降脂功能的腸源性激素，對(duì)胰島素及脂聯(lián)素的分泌有促進(jìn)作用。PHGG對(duì)小鼠GIP及GLP- 1分泌的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。表4顯示：模型組小鼠的GLP- 1濃度(33.26 pmol/L)比正常組(80.32 pmol/L)減少58.59%(P>0.05)；二甲雙胍、PHGG- M和PHGG- H組小鼠的GLP- 1濃度分別上升到75.86、67.76、63.82 pmol/L，與正常組之間無(wú)顯著性差異，表明PHGG可促進(jìn)GLP- 1分泌。各組之間GIP含量無(wú)顯著性差異。

2.6 PHGG對(duì)小鼠體內(nèi)的短鏈脂肪酸及其受體表達(dá)的影響

SCFAs由腸道菌群代謝產(chǎn)生，被腸內(nèi)分泌細(xì)胞上的SCFAs受體識(shí)別后可誘導(dǎo)GLP- 1等腸道激素分泌。由表3可知，PHGG- M組調(diào)控代謝的效果較佳，故選定該劑量開展以下研究。PHGG對(duì)小鼠體內(nèi)SCFAs含量的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可見(jiàn)，模型組小鼠盲腸內(nèi)容物中的乙酸、丙酸和丁酸含量均低于正常組小鼠。灌胃PHGG后，小鼠盲腸中丙酸含量(0.47 mg/g)比模型組(0.13 mg/g)提升2.61倍，丁酸含量(1.79 mg/g)比模型組(0.22 mg/g)提升7.14倍。

圖(a)中：A.正常組；B.模型組；C. 二甲雙胍組；D. PHGG- M組。##表示模型組與正常組相比差異極顯著(P<0.01)；**表示與模型組相比差異極顯著(P<0.01)。圖3 PHGG對(duì)小鼠脂肪細(xì)胞的影響Fig.3 Effect of PHGG on adipose tissue in mice

表4 PHGG對(duì)小鼠GLP- 1及GIP分泌的影響Tab.4 Effect of PHGG on secretion of GLP- 1 and GIP in mice

蛋白免疫印跡檢測(cè)小腸中SCFAs受體的表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可見(jiàn)，模型組小鼠小腸的SCFAs受體GPR43的表達(dá)水平低于正常組。灌胃8周PHGG后，小鼠腸道內(nèi)GPR43的蛋白表達(dá)上升63.30%。由此說(shuō)明，PHGG提升了高脂高糖飲食小鼠的腸道中SCFAs的含量，同時(shí)上調(diào)了SCFAs受體的表達(dá)。

表5 PHGG對(duì)小鼠盲腸內(nèi)短鏈脂肪酸含量的影響Tab.5 Effect of PHGG on several SCFAs concentrations in cecal of mice mg/g

#表示模型組與正常組相比差異顯著(P<0.05)；*表示與模型組相比差異顯著(P<0.05)；##表示模型組與正常組相比差異極顯著(p<0.01)；**.與模型組相比差異極顯著(p<0.01)。圖4 PHGG對(duì)小鼠腸道中短鏈脂肪酸受體表達(dá)的影響Fig.4 Effect of PHGG on expression of SCFAs receptors in mice

3 討 論

攝入適量的膳食纖維能降低糖尿病的患病風(fēng)險(xiǎn)，其臨床試驗(yàn)效果可與目前的藥物媲美[15-16]。PHGG被視為一種安全、天然的可溶性膳食纖維，具有降糖、降脂和改善腸道健康的生理作用[6,17]；此外，當(dāng)PHGG以36 g/d的劑量對(duì)成年男性給藥4周時(shí)，沒(méi)有出現(xiàn)副作用[18]。結(jié)合前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)設(shè)定PHGG的劑量為750、1 500、3 000 mg/(kg·d)，發(fā)現(xiàn)PHGG可以發(fā)揮穩(wěn)定有效的代謝調(diào)節(jié)作用。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用高脂高糖飼料喂養(yǎng)小鼠16周，誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)體質(zhì)量及體脂率增加，空腹血糖受損和糖耐量減低等癥狀。每天灌胃1 500 mg/(kg·d)的PHGG后，模型小鼠的糖耐量及胰島素耐量提升，空腹血糖、空腹胰島素、HbA1c以及胰島素抵抗指數(shù)下調(diào)，生理狀態(tài)接近二甲雙胍干預(yù)組(圖1和表2)，表明PHGG可增強(qiáng)胰島素敏感性，降低高脂高糖飲食引發(fā)的胰島素代償性上升，改善高脂高糖飲食小鼠的血糖穩(wěn)態(tài)。相同的是，有研究表明，給非胰島素依賴的糖尿病OLETF大鼠補(bǔ)充PHGG后，大鼠的空腹血糖、OGTT的2 h血糖和血漿葡萄糖有顯著改善[9]。

高脂高糖飲食誘發(fā)的脂代謝紊亂是加重胰島素抵抗的危險(xiǎn)因素之一。一方面，肥大增生的脂肪細(xì)胞會(huì)釋放過(guò)量FFA[19]；另一方面，脂肪組織可產(chǎn)生慢性炎癥，抑制脂聯(lián)素的分泌[20]，從而降低靶組織的胰島素敏感性[21-22]。增加膳食纖維的攝入量可改善機(jī)體的脂代謝，如Wistar大鼠連續(xù)47 d食用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%的發(fā)酵藜麥的飼料后，血糖、血脂水平以及附睪脂肪組織的積累均有所降低[23]；由117名超重或肥胖年輕人的一周飲食調(diào)查記錄中發(fā)現(xiàn)，膳食纖維攝入量與TG含量呈負(fù)相關(guān)[24]；12名健康志愿者每餐補(bǔ)充6 g PHGG后，體內(nèi)的TC、TG和LDL水平降低，同時(shí)糖耐量提升[11]。此外，在一項(xiàng)關(guān)于2型糖尿病和代謝綜合征患者的臨床研究中表明，患者的日常飲食中添加PHGG對(duì)TC和LDL- C無(wú)效，但能減輕患者體質(zhì)量，降低HbA1c和反式FA。與其他膳食纖維相比，本實(shí)驗(yàn)中PHGG不僅能維持高脂高糖飲食小鼠的脂肪組織的正常形態(tài)，降低血清中的游離FA(圖2，圖3和表3)，更值得注意的是，高脂高糖飲食小鼠補(bǔ)充PHGG后脂肪細(xì)胞中的脂聯(lián)素可以恢復(fù)到正常分泌水平(表3)，有助于提高胰島素敏感性，從而緩解胰島素抵抗，對(duì)改善體質(zhì)量及胰島素抵抗具有積極意義。

此外，腸道激素促進(jìn)胰島素和脂聯(lián)素的分泌，PHGG的代謝調(diào)節(jié)作用與之密切相關(guān)[11]。研究表明，PHGG影響GIP及GLP- 1等傳遞飽腹感信號(hào)的腸肽激素分泌，進(jìn)而減慢健康受試者的胃排空速度，增加受試者的飽腹感[25]。補(bǔ)充GLP- 1受體激動(dòng)劑被確認(rèn)為是2型糖尿病和肥胖的有效治療策略[26]，例如飼喂正常大鼠含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的瓜爾豆膠的飼料后，血清中GLP- 1含量隨喂養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而升高[27]；抗性淀粉可通過(guò)刺激GLP- 1和PYY的分泌減少脂肪[28-29]。此外，膳食纖維的黏度及水溶性影響GLP- 1的分泌，而甘露聚糖類的水溶性膳食纖維對(duì)GLP- 1的刺激效果顯著優(yōu)于纖維素和菊粉等膳食纖維[30]。PHGG是含有β-半乳糖苷取代側(cè)鏈的甘露聚糖類水溶性膳食纖維，額外補(bǔ)充1 500 mg/(kg·d)的PHGG的小鼠比高脂高糖飲食小鼠血清中的GLP- 1提升1倍，使其恢復(fù)到正常水平(表4)，表明PHGG的干預(yù)刺激了小鼠GLP- 1的分泌。

內(nèi)源性GLP- 1的分泌與腸道菌群代謝產(chǎn)物密不可分[26]。腸道菌群可利用膳食纖維代謝生成SCFAs，激活腸道內(nèi)分泌細(xì)胞上相應(yīng)的G蛋白偶聯(lián)受體GPR43，刺激腸內(nèi)分泌細(xì)胞，提升腸道激素分泌，緩解胰島素抵抗[31]。在體外結(jié)腸培養(yǎng)模型中，SCFAs對(duì)分泌GLP- 1的腸L細(xì)胞有持續(xù)的刺激效果[32]。給大鼠結(jié)腸灌注SCFAs可刺激GLP- 1急性釋放[33]；在小鼠體內(nèi)，SCFAs刺激GPR43使分泌GLP- 1的細(xì)胞數(shù)量增加2倍[34]；給無(wú)菌豬補(bǔ)充外源性SCFAs，可有效增加豬血清中的脂聯(lián)素水平，同時(shí)增加GPR43蛋白的表達(dá)[35]。目前關(guān)于GPR43在代謝調(diào)節(jié)中的作用存在著相互矛盾的研究文獻(xiàn)，有研究表明，高脂飼養(yǎng)的GPR43基因敲除小鼠與野生型小鼠相比，具有較高的葡萄糖耐量和較輕的體質(zhì)量[36]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，可溶性膳食纖維PHGG將胰島素抵抗小鼠盲腸中的丁酸含量提高7.14倍(表5)，大幅提升了腸道組織中短鏈脂肪酸受體GPR43的表達(dá)(圖4)，推測(cè)該作用對(duì)腸道激素的分泌可產(chǎn)生有利影響。類似的是，青錢柳多糖處理大鼠后SCFA受體GPR41和GPR43表達(dá)明顯增多，同時(shí)上調(diào)GLP- 1和PYY的表達(dá)[37]。糖尿病、腎病大鼠在飼喂含有抗性淀粉或纖維素的飼料后，腸道菌群明顯改善，SCFAs產(chǎn)量增多，并且膳食纖維通過(guò)GPR43介導(dǎo)對(duì)大鼠的保護(hù)作用[38]。不僅如此，有研究表明PPHGG提升db/db雄性小鼠結(jié)腸黏膜的宿主防御功能，該功能可以影響小鼠的脂質(zhì)代謝[8]，但也有研究發(fā)現(xiàn)，菊粉改善糖脂代謝紊亂的作用不依賴于SCFAs或GPR43介導(dǎo)[12]。鑒于不同膳食纖維的結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變，誘導(dǎo)糖脂代謝紊亂的因素眾多，在未來(lái)需要更多有關(guān)膳食纖維精準(zhǔn)化利用的研究支撐。

4 結(jié) 論

本研究利用PHGG對(duì)高脂高糖飲食誘導(dǎo)小鼠的糖脂代謝穩(wěn)態(tài)及腸道環(huán)境進(jìn)行調(diào)節(jié)。研究結(jié)果表明：PHGG可控制體質(zhì)量增加、降低空腹血糖、提升糖耐量、改善血脂異常并保護(hù)脂肪組織形態(tài)，具有良好的降糖降脂功效；同時(shí)，PHGG可增加腸道中短鏈脂肪酸的含量，將腸道中短鏈脂肪酸受體GPR43的蛋白表達(dá)提升了63.30%，促進(jìn)了GLP- 1的分泌，有效改善腸道環(huán)境。本研究表明，PHGG可改善高脂高糖飲食誘發(fā)小鼠的代謝紊亂，降低糖尿病、肥胖等發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。將PHGG作為防治糖尿病及肥胖的功能性食品具有廣闊的應(yīng)用前景。