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    魚源膠原肽特征質(zhì)量指標(biāo)檢測分析

    2021-11-04 15:26:26牛林林袁丹丹蔡久慶張曉元張艷艷
    食品與藥品 2021年5期
    關(guān)鍵詞:羥脯氨酸脯氨酸膠原

    牛林林,袁丹丹,陳 磊,蔡久慶,劉 娟,張 明,陳 勉,張曉元,張艷艷,劉 飛*

    (1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省多糖類藥物工程實(shí)驗(yàn)室 多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 博士后科研工作站,山東 濟(jì)南 250101;2. 東阿生力源阿膠股份有限公司 聊城市阿膠多肽提取技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東 聊城 252218)

    膠原肽,又稱膠原水解物,是由膠原蛋白衍生的短鏈氨基酸,由膠原蛋白經(jīng)過熱處理、酸堿酶酶解,發(fā)生分子鏈解體、斷裂,再經(jīng)加工所得產(chǎn)物[1]。膠原肽主要來源于骨骼、牛皮、豬皮、魚類和家禽等[2-4],作為小分子蛋白肽,具有生物可利用性,易分解,并能很好地被吸收到血液中,可在全身傳播、修復(fù)和提供能量[5-8]。

    Koji等[6]研究表明,口服膠原肽1~2 h后,可在人體血液中檢測到羥脯氨酸濃度升至峰值,以肽的形式存在,主要是三肽Gly-Pro-Hyp。Kim等[9]研究表明,小分子膠原肽可從血管轉(zhuǎn)移到表皮系統(tǒng),從而刺激皮膚成纖維細(xì)胞合成膠原蛋白、彈性纖維和透明質(zhì)酸,改善皮膚的光滑度,增加皮膚的柔韌性和彈性。研究表明[10-11]細(xì)胞可將轉(zhuǎn)移至組織中的多肽構(gòu)建成完整的膠原螺旋,修復(fù)皮膚、骨骼和關(guān)節(jié),對骨質(zhì)疏松有一定預(yù)防和治療作用。由于膠原肽富含多種氨基酸,具有營養(yǎng)和生理調(diào)節(jié)雙重作用,廣泛用于膳食食品、保健食品、美容食品、運(yùn)動營養(yǎng)食品等領(lǐng)域[12-13]。

    隨著膠原肽市場規(guī)模增大,不同來源的膠原肽檢測標(biāo)準(zhǔn)有所差異,表1為不同檢測標(biāo)準(zhǔn)(依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)/行業(yè)標(biāo)準(zhǔn))中膠原肽的理化指標(biāo)。相對分子質(zhì)量、羥脯氨酸的含量是區(qū)別一般食品的關(guān)鍵質(zhì)量參數(shù),國標(biāo)GB 31645-2018中膠原蛋白肽比魚源膠原肽的指標(biāo)范圍寬泛,魚源膠原肽的國家標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的膠原肽相對分子質(zhì)量(Mr)和羥脯氨酸含量差異也較大。

    表1 不同檢測標(biāo)準(zhǔn)中膠原肽理化指標(biāo)

    由于標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)的差異,市售魚源膠原肽的產(chǎn)品質(zhì)量信息基本相似,大多未標(biāo)明低分子量氨基酸(Mr小于1000 )占比,以及包含特征氨基酸羥脯氨酸在內(nèi)的氨基酸組成差異,售價(jià)差異較大,消費(fèi)者難以合理選擇。因此本文選取了4種不同品牌,具有代表性的魚源膠原肽產(chǎn)品與本實(shí)驗(yàn)室研制的膠原肽進(jìn)行特征質(zhì)量指標(biāo)檢測分析,旨在篩選出低分子量占比較高,特征性氨基酸羥脯氨酸較高的魚源膠原肽,為魚源膠原肽產(chǎn)品選擇和功效研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 儀器與試劑

    1.1 儀器

    1.2 試劑

    甲醇、乙腈(色譜純,賽默飛世爾科技有限公司);超純水(實(shí)驗(yàn)室自制);無水乙醇、鹽酸、苯酚(分析純,天津市大茂化學(xué)試劑廠);三氟乙酸、十二水合磷酸氫二鈉、十水合四硼酸鈉、硼酸(分析純,國藥集團(tuán));18種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液、OPA衍生試劑(島津公司AJS-01 氨基酸柱前衍生化方法包);細(xì)胞色素C(95 %,Mr:12 355);抑肽酶(6000 U/mg,Mr:6511);桿菌酶(Mr:1450);乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(97 %,Mr:451);乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(97 %,Mr:189)。

    產(chǎn)品1~4購于市場中不同品牌的膠原肽,X肽由本實(shí)驗(yàn)室研制,均為魚源膠原肽。

    2 方法

    2.1 微波消解處理

    將產(chǎn)品1~4和X肽每件樣品準(zhǔn)確稱取約0.1 g,各置于微波消解罐中,已有樣品的各消解罐中分別加入5 ml 鹽酸(1 %苯酚)和5 ml 純凈水,進(jìn)行微波消解,1600 W,150 ℃,15 min。微波消解程序完成并冷卻后,分別將消解液定容至100 ml,各取出1 ml液體分別置于蒸發(fā)皿中60 ℃蒸發(fā)干燥后,各加入1 ml的稀鹽酸將溶質(zhì)溶出,置試管中待測。

    2.2 GPC方法測定膠原肽相對分子質(zhì)量

    2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞色素C、抑肽酶、桿菌酶、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸和乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸適量,分別用流動相配制成濃度為1.0 g的不同相對分子質(zhì)量的肽標(biāo)準(zhǔn)品溶液,用孔徑為0.2 μm濾膜過濾后分別進(jìn)樣,得到系列標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖。以相對分子質(zhì)量的對數(shù)(lg Mr)對保留時(shí)間作圖或作線性回歸得到Mr校正曲線及其方程。

    2.2.2 樣品的配制 稱取樣品125.0 mg,用流動相溶解并定容至25 ml,超聲振蕩10 min,使樣品充分溶解混勻,用孔徑為0.2 μm,0.5 μm聚四氟乙烯或尼龍過濾膜過濾,其濾液用于測定。

    2.2.3 色譜條件 色譜柱:TSKgel G2000SWxL凝膠色譜柱(300 mm×7.8 mm,5 μm),流動相:乙腈-水-三氟乙酸(40:60:0.05);檢測波長:220 nm;流速:0.5 ml/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣體積:10 μl;等梯度洗脫。

    2.3 OPA柱前衍生法測定膠原肽氨基酸含量

    2.3.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)混合溶液 含18種氨基酸,Asp(門冬氨酸)、Glu(谷氨酸)、Ser(絲氨酸)、His(組氨酸)、Gly(甘氨酸)、Thr(蘇氨酸)、Arg(精氨酸)、Ala(丙氨酸)、Tyr(酪氨酸)、Val(纈氨酸)、Met(甲硫氨酸)、Ile(異亮氨酸)、Phe(苯丙氨酸)、Lys(賴氨酸)、Leu(亮氨酸)、Hyp(羥脯氨酸)、Pro(脯氨酸)濃度均為2.5 μmol/ml,Cys(半胱氨酸)為1.25 μmol/ml。

    數(shù)控專業(yè)是一門實(shí)踐性很強(qiáng)的專業(yè),其中涉及到很多抽象的理論知識,對于剛剛接觸這些知識的學(xué)生而言,在學(xué)習(xí)時(shí)極易遇到一些困難。所謂數(shù)字化課程,其是將網(wǎng)絡(luò)作為支持環(huán)境,運(yùn)用數(shù)字化學(xué)習(xí)材料,使用數(shù)字化信息傳遞與人際交互方式的一種教學(xué)方式。在科學(xué)技術(shù)發(fā)展之下,數(shù)字化課程成為當(dāng)前教育行業(yè)中一種新型輔助性教學(xué)方式,可以有效提升教學(xué)質(zhì)量與效率。

    2.3.2 衍生用混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 量取氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μl,置入2 ml樣品瓶,加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μl,0.l mol/L鹽酸溶液400 μl,混勻,作為衍生用混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

    2.3.3 衍生用游離氨基酸樣品溶液的配制 準(zhǔn)確稱取樣品適量,加0.l mol/L鹽酸溶液制成氨基酸總濃度約為100 mg/ml溶液作為檢測游離氨基酸樣品溶液(溶液pH應(yīng)不小于1.0),準(zhǔn)確量取樣品溶液500 μl,置入2 ml樣品瓶,準(zhǔn)確加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μl,混勻,作為衍生用游離氨基酸樣品溶液。

    2.3.4 衍生用微波消解后樣品溶液的配制 準(zhǔn)確稱取樣品適量,加0.l mol/L鹽酸溶液制成氨基酸總濃度約為1 mg/ml溶液作為檢測微波消解后總氨基酸樣品溶液(溶液pH應(yīng)不小于1.0),準(zhǔn)確量取樣品溶液500 μl,置入2 ml樣品瓶,準(zhǔn)確加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μl,混勻,作為衍生用微波消解后樣品溶液。

    2.3.5 色譜條件 色譜柱:AJS-02 氨基酸分析專用柱(4.6 mm×150 mm,5 μm);流動相A:0.45 %Na2HPO3·12H2O-0.475 %Na2B4O7·10H2O,pH 8.2;流動相B:甲醇-乙腈-水(450:450:100,v/v/v);檢測波長:UV 檢測器:338 nm(一級氨基酸),262 nm(二級氨基酸);流速:1.6 ml/min;柱溫:50 ℃;梯度洗脫程序見表2。

    表2 梯度洗脫程序

    3 結(jié)果與分析

    3.1 膠原肽相對分子質(zhì)量結(jié)果與分析

    3.1.1 不同樣品分子質(zhì)量的分布情況 分別測定產(chǎn)品1~4和X肽,結(jié)果見圖1,色譜圖均較好地顯示了5種不同來源膠原肽樣品中不同分子質(zhì)量的分布情況。

    圖1 不同樣品的Mr色譜圖

    采用SHIMADZU GPC數(shù)據(jù)處理軟件分別對以上色譜圖進(jìn)行處理。洗脫物質(zhì)的分子質(zhì)量隨保留時(shí)間增加而減小。由圖1可見,產(chǎn)品1~4的出峰時(shí)間相對一致,則分子質(zhì)量大小差別不大,X肽出峰時(shí)間較晚,峰型相對單一,則X肽分子質(zhì)量較小。產(chǎn)品1~4及X肽中一些主要色譜峰的保留時(shí)間、重均相對分子質(zhì)量(Mw)、數(shù)均相對分子質(zhì)量(Mn)、多分散系數(shù)d(Mw/Mn)的基本情況見表3。

    由表3可見,產(chǎn)品1~4的Mw主要集中在1000~2000之間,X肽的Mw相對較小,主要集中在1000以下,占比約為88.47 %,比產(chǎn)品1~4Mw小于1000的低分子量組分占比高約92.75 %~115.62 %。

    表3 不同產(chǎn)品相對分子質(zhì)量及其分布測定結(jié)果

    3.1.2 不同樣品相對分子質(zhì)量占比 對產(chǎn)品1~4和X肽進(jìn)行了相對分子質(zhì)量占比統(tǒng)計(jì),結(jié)果見圖2。

    圖2 不同膠原肽產(chǎn)品Mr占比

    由圖2可見,產(chǎn)品1~4中相對分子質(zhì)量的占比大小基本相同,X肽中低分子量占比遠(yuǎn)高于市售樣品的魚源膠原肽。

    3.2 膠原肽氨基酸結(jié)果與分析

    3.2.1 氨基酸對照品 對20種氨基酸對照品進(jìn)行高效液相分析,結(jié)果見圖3。

    圖3 混合氨基酸對照品HPLC圖

    3.2.2 不同樣品中游離氨基酸含量 將產(chǎn)品1~4和 X肽進(jìn)行氨基酸分析,結(jié)果見圖4。

    由圖4可見,各產(chǎn)品中游離氨基酸含量較少。產(chǎn)品1中精氨酸含量最高為67.37 μg/ml,其他17種氨基酸的含量均不超過50 μg/ml;產(chǎn)品2中丙氨酸的含量最高為112.18 μg/ml,其他均不超過50 μg/ml;產(chǎn)品3和產(chǎn)品4中氨基酸含量均不超過50 μg/ml;X肽中亮氨酸含量最高為65.79 μg/ml,其它均未超過40 μg/ml,其中羥脯氨酸的含量為0。上述結(jié)果表明,產(chǎn)品1~4和X肽中游離氨基酸濃度為0.2 %~0.5 %,表明樣品主要以低聚肽的形式存在。

    圖4 市售樣品和X肽中游離氨基酸含量

    3.2.3 水解后不同樣品游離氨基酸含量 對產(chǎn)品1~4和X肽按照“2.1”項(xiàng)方法微波消解后進(jìn)行氨基酸分析,結(jié)果見圖5。

    圖5 水解后不同樣品中氨基酸含量

    由圖5可見,將市售樣品和X肽水解后,各種氨基酸的含量均明顯增加,多數(shù)氨基酸含量高于100 μg/ml,產(chǎn)品1~4和X肽氨基酸含量變化趨勢較相似。產(chǎn)品2、產(chǎn)品3、產(chǎn)品4和X肽中谷氨酸含量約為300 μg/ml,產(chǎn)品1谷氨酸含量為229.67 μg/ml;各樣品中甘氨酸含量約為500 μg/ml,精氨酸含量約為150 μg/ml,丙氨酸含量約為200 μg/ml。其中特征氨基酸羥脯氨酸和脯氨酸含量差別較大,X肽的羥脯氨酸(228.71 μg/ml)和脯氨酸(286.98 μg/ml)含量明顯高于市售樣品。

    3.2.4 不同樣品中肽氨基酸組成含量 各樣品水解之后氨基酸含量減去未水解之前的氨基酸含量,得樣品的肽氨基酸組成含量,結(jié)果見圖6。

    圖6 不同樣品中肽氨基酸組成含量

    由圖6可見,本次實(shí)驗(yàn)共檢測18種氨基酸,X肽中有17種氨基酸含量高于產(chǎn)品1,13種氨基酸含量高于產(chǎn)品2,14種氨基酸含量高于產(chǎn)品3,13種氨基酸含量高于產(chǎn)品4;尤其特征性氨基酸羥脯氨酸和脯氨酸的含量(分別為228.71,166.41 μg/ml)遠(yuǎn)高于市售4種產(chǎn)品(羥脯氨酸分別為145.58,75.81,52.66,122.49 μg/ml,脯氨酸分別為208.3,170.57,166.41,196.16 μg/ml)。

    3.2.5 羥脯氨酸在不同膠原肽產(chǎn)品中的比例 根據(jù)HPLC檢測出的羥脯氨酸和脯氨酸的含量,計(jì)算羥脯氨酸和脯氨酸在膠原肽中的占比,結(jié)果見圖7。

    圖7 羥脯氨酸和脯氨酸占比

    由圖7可見,X肽中羥脯氨酸含量較高,比產(chǎn)品1~4高約50.91% ~332.11 %;脯氨酸含量比產(chǎn)品1~4中含量高約33.91 %~71.41 %。

    4 結(jié)論和討論

    不同魚源膠原肽產(chǎn)品的低分子量組分占比、特征性氨基酸和其他氨基酸含量存在明顯差別。本文以實(shí)驗(yàn)室研制的X肽與4種市售魚源膠原肽微波消解后進(jìn)行分子量大小和氨基酸含量比較。結(jié)果表明,X肽具有低分子量組分、羥脯氨酸、脯氨酸含量高的特點(diǎn),更易被人體吸收和發(fā)揮功效。以上述關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)為指針,通過優(yōu)化不同來源底物、酶解工藝和篩選高活性肽段,達(dá)到降低產(chǎn)品用量提高產(chǎn)品功效的效果,將是以后研究的重點(diǎn)。同時(shí),本文為膠原肽質(zhì)量控制方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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