聚酰胺用于選擇性激光燒結(jié)3D打印截骨導(dǎo)板的性能研究

項(xiàng)巍巍，黃野，劉國彬，柳劍，張名俊，王卿，雷鵬坤，王郁琪，王小龍，萬翔*

[(1.強(qiáng)生(蘇州)醫(yī)療器材有限公司，江蘇 蘇州 215126；2.北京積水潭醫(yī)院，北京 100035；3.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，河北 石家莊 050000；4.強(qiáng)生(上海)醫(yī)療器材有限公司，上海 200030)]

聚酰胺材料通過選擇性激光燒結(jié)技術(shù)加工成型，是3D打印截骨導(dǎo)板常用的一種加工方式。3D打印截骨導(dǎo)板在手術(shù)中起定位、導(dǎo)向和保護(hù)的作用，會(huì)與骨表面直接接觸。導(dǎo)板設(shè)計(jì)需要與手術(shù)部位相匹配，滿足力學(xué)性能的要求[6]。應(yīng)使用具有一定硬度、韌性、受力后不易變形的材質(zhì)[7]，且在使用前需要對導(dǎo)板進(jìn)行滅菌，制造導(dǎo)板的材料應(yīng)生物相容性檢測合格。

然而，目前針對3D打印截骨導(dǎo)板及其材料的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)尚不完善，關(guān)于3D打印截骨導(dǎo)板的材料要求也不明確。因此，本文針對目前廣泛應(yīng)用于醫(yī)療3D打印的聚酰胺材料進(jìn)行了機(jī)械性能、化學(xué)性能、生物學(xué)相容性的研究。

1 資料與方法

1.1 試驗(yàn)用材料和儀器

1.1.1 機(jī)械性能測試 測試樣品為強(qiáng)生(蘇州)醫(yī)療器材有限公司使用EOS P110 3D打印機(jī)，由高分子聚酰胺材料打印，再經(jīng)132℃、4 min高壓蒸汽滅菌的截骨導(dǎo)板。參考國家標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置拉伸性能測試(包括斷裂延伸率、拉伸模量和抗拉強(qiáng)度)、維卡軟化溫度測定、負(fù)荷變形溫度測試和滾動(dòng)磨損實(shí)驗(yàn)。拉伸性能測試設(shè)置30個(gè)試樣，狗骨狀試件寬度(10.0±0.2)mm，厚度(4.0±0.2)mm，初始夾具間距(115.0±1.0)mm。維卡軟化溫度測定實(shí)驗(yàn)設(shè)置15個(gè)試樣，為厚3.0～6.5 mm，邊長10 mm的正方形。負(fù)荷變形溫度測試設(shè)置15個(gè)試樣，橫截面為矩形，長度為80 mm，寬度為10 mm，厚度為4 mm的樣條。滾動(dòng)磨損實(shí)驗(yàn)設(shè)置6個(gè)試樣，為直徑100 mm的圓形。

1.1.2 化學(xué)性能測試 按樣品質(zhì)量0.2 g加1 mL的比例加水，在(37±1)℃放置24 h，分離液體，冷至室溫，作為檢驗(yàn)液。

儀器：電子天平(AL104，梅特勒-托利多，中國)，pH計(jì)(310p-01A，奧力龍，中國)，電熱恒溫干燥箱(DHG-9147A，上海精宏，中國)，紫外可見分光光度計(jì)(Cary，Agilent Technologies，德國)。

該項(xiàng)目中所使用的是電阻應(yīng)變式稱重傳感器，該傳感器由金屬應(yīng)變彈性本體、套筒和與其相連的電阻應(yīng)變片構(gòu)成，結(jié)構(gòu)如圖1所示。

試劑：硫代硫酸鈉(永華化學(xué)科技)，pH緩沖溶液(Thermo)。高錳酸鉀，硫酸，碘化鉀，淀粉，乙酸胺，鹽酸，硫代乙酰胺，硝酸鉛，氫氧化鈉，丙三醇(甘油)，硝酸。以上試劑均來自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 生物相容性評估試驗(yàn)

1.1.3.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn) 將樣品和浸提液[10%胎牛血清的低限基本(minimum essential medium，MEM)]培養(yǎng)液按照樣品表面積與浸提液比為3 cm2/mL置于37℃恒溫浸提24 h備用。小鼠成纖維細(xì)胞L929(來自美國菌種保存中心)。儀器：高壓滅菌器(YXQ-LS-50，上海博迅，中國)，倒置顯微鏡(CKX31，OLYMPUS，日本)，酶聯(lián)免疫檢測儀(PowerWave XS2，BIO-TEK，美國)。試劑：噻唑蘭[3-(4，5-Dimethylthiazol-2-yl)-2，5-Diphenyltetrazolium Bromide，MTT](SIGMA)、胎牛血清(CORNING)、胰酶(GiBco)。

1.1.3.2 皮膚致敏試驗(yàn) 動(dòng)物采用哈特蘭豚鼠30只[蘇州鎮(zhèn)湖實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，SCXK(蘇)2015-0007]，體重300～500 g，雄性。儀器：臥式大容量恒溫振蕩器(SPH-111B，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備，中國)，壓力蒸汽滅菌器(LMQC-50E，山東新華，中國)。試劑：0.9%氯化鈉注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司)；芝麻油(吉安市綠源天然香料油提煉廠)；2，4-二硝基氯苯(2，4-dinitrochlorobenzene，DNCB)(Xiya Reagent)；弗氏完全佐劑(SIGMA)。陽性對照組：溶劑為0.9%氯化鈉(Sodium chloride，SC)注射液或芝麻油(Sesame oil，SO)，誘導(dǎo)濃度為0.5% DNCB，激發(fā)濃度為0.1% DNCB；陰性對照組：0.9%氯化鈉注射液；芝麻油。供試液：用0.9%氯化鈉注射液或芝麻油作為浸提液，浸提比例為3 cm2/mL，37℃浸提72 h。浸提完成后4℃保存，24 h內(nèi)用于測試。

1.1.3.3 皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn) 主要儀器同1.1.3.2新西蘭白色純種大白兔3只[蘇州鎮(zhèn)湖實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，SCXK(蘇)2015-0007]，雌性，體重不低于2kg。試劑：0.9%氯化鈉注射液(辰欣藥業(yè)股份有限公司)；芝麻油(吉安市綠源天然香料油提煉廠)；十二烷基硫酸鈉(Solarbio)。陰性對照液：極性對照為0.9%氯化鈉注射液，非極性對照為芝麻油。陽性對照液：極性對照為20%十二烷基硫酸鈉溶于0.9%氯化鈉注射液；非極性對照為20%十二烷基硫酸鈉溶于芝麻油。供試液：使用0.9%氯化鈉注射液或芝麻油作為浸提液，浸提比例為3 cm2/mL，37℃浸提72 h。浸提完成后4℃保存，24 h內(nèi)用于測試。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 機(jī)械性能測試 拉伸試驗(yàn)參考GB/T 1040.1-2006塑料拉伸性能的測試。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境條件為(23±2)℃。利用夾具將試件兩端夾緊后，使試驗(yàn)機(jī)以50 mm/min的速度加載，直至試件斷裂。維卡軟化溫度測試參考GB/T 1633-2000熱塑性塑料維卡軟化溫度的測定。受試材料的維卡軟化溫度為試樣維卡軟化溫度的算數(shù)平均值。負(fù)荷變形溫度測試參考GB/T 1634.1-2004塑料負(fù)荷變形溫度的測定。以(120±10)℃/h的均勻速率升高熱浴的溫度，記下樣條初始撓度凈增加量達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)撓度時(shí)的溫度，即為在GB/T 1634有關(guān)部分規(guī)定的彎曲應(yīng)力下的負(fù)荷變形溫度。受試材料的負(fù)荷變形溫度為試樣負(fù)荷變形溫度的算數(shù)平均值。滾動(dòng)磨損試驗(yàn)參考GB/T 5478-2008塑料滾動(dòng)磨損試驗(yàn)方法。

1.2.2 化學(xué)性能測試 參考GB/T14233.1-2008醫(yī)用輸液、輸血、注射器具檢驗(yàn)方法，第一部分第5章節(jié)檢驗(yàn)液溶出物分析方法中的5.2、5.4、5.5、5.6、5.7，分別測定檢驗(yàn)液的還原物質(zhì)、酸堿度、蒸發(fā)殘?jiān)?、重金屬總量和紫外吸光度?/p>

1.2.3 生物相容性評估試驗(yàn) 根據(jù)GB/T16886.1-2011醫(yī)療器械分類，3D打印骨科導(dǎo)板屬于外部接入器械，接觸時(shí)間為A類短期接觸，即在24 h以內(nèi)1次、多次或重復(fù)使用或接觸的器械。因此該生物相容性評估試驗(yàn)包括細(xì)胞毒性、皮膚致敏及皮內(nèi)反應(yīng)。

參照細(xì)胞毒性測試-體外法GB/T 16886.5-2017標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。將浸提液按照100%、75%、50%、25%的濃度用培養(yǎng)液稀釋，陽性對照樣品為1%二乙基二硫代氨基甲酸鋅的10%胎牛血清MEM溶液，浸提液濃度為0作為陰性對照組，空白對照樣品為浸提液。每組做5個(gè)平行樣。

將處于對數(shù)生長期的L929細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL。接種上述細(xì)胞懸液到96孔板中，每孔100 μL，37℃，5% CO2，>90%濕度培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞長成單層后，吸出原來的培養(yǎng)液，分別加入100μL試驗(yàn)樣品浸提液(100%，75%，50%，25%)、空白對照液、陽性對照液和陰性對照液。每組做5個(gè)平行樣。

培養(yǎng)24 h后，取出96孔板先做細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。然后每孔加50 μL MTT(1 mg/mL)，培養(yǎng)2 h，吸棄上清，加100 μL異丙醇溶解結(jié)晶。在酶標(biāo)儀上以570 nm為主吸收波長，650 nm為參考波長測定吸光度值。

1.2.3.2 皮膚致敏試驗(yàn) 參照刺激與皮膚致敏試驗(yàn)GB/T16886.10-2017標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。(1)皮內(nèi)誘導(dǎo)階段。在每只動(dòng)物去毛的肩胛骨內(nèi)側(cè)部位從頭部向尾部成對進(jìn)行A、A、B、B、C、C共3對6個(gè)點(diǎn)，皮內(nèi)注射0.1 mL。A：弗氏完全佐劑與選定的溶劑以50∶50(V/V)比例混合的穩(wěn)定性乳化劑。B：注射試驗(yàn)樣品(未經(jīng)稀釋的浸提液)；對照組動(dòng)物僅注射相應(yīng)溶劑。C：試驗(yàn)樣品(部位B中采用的濃度)，以50∶50的體積比例與弗氏完全佐劑與溶劑(50%)配制成的乳化劑混合后進(jìn)行皮內(nèi)注射；對照組動(dòng)物注射對照液與佐劑配置成的乳化劑。(2)局部誘導(dǎo)階段。按B的最大濃度未產(chǎn)生刺激反應(yīng)，在局部敷貼應(yīng)用前(24±2)h，試驗(yàn)區(qū)用10%十二烷基硫酸鈉進(jìn)行預(yù)處理。皮內(nèi)注射后7 d用0.5 mL供試品浸提液浸透覆蓋誘導(dǎo)注射點(diǎn)。采用封閉式包扎帶固定樣品，隨后于(48±2)h后去除。對照組動(dòng)物使用對照液同法操作。(3)激發(fā)階段。于局部誘導(dǎo)后14 d對全部動(dòng)物進(jìn)行激發(fā)。用0.5 mL供試品浸提液和對照液浸透后的吸收性紗布塊分別局部貼敷于誘導(dǎo)階段未試驗(yàn)部位，采用封閉式包扎帶固定，隨后于(24±2)h后去除。(4)結(jié)果評價(jià)。除去樣品后(24±2)h和(48±2)h，在全光譜光線下觀察動(dòng)物激發(fā)部位皮膚情況。按照Magnusson和Kligman分級標(biāo)準(zhǔn)對每一激發(fā)部位和每一觀察時(shí)間皮膚紅斑和水腫反應(yīng)進(jìn)行描述并分級。

1.2.3.3 皮內(nèi)反應(yīng)試驗(yàn) 參照刺激與皮膚致敏試驗(yàn)GB/T16886.10-2017標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。將兔背部脊柱兩側(cè)的背毛除去，作為試驗(yàn)觀察的部位。在兔背一側(cè)注射0.2 mL樣品SC浸提液和0.2 mL樣品SO浸提液；另一側(cè)同樣注射0.2 mL SC陰性對照液和0.2 mL SO陰性對照液。觀察即時(shí)、(24±2)h、(48±2)h和(72±2)h注射局部及周圍皮膚組織反應(yīng)，記錄包括紅斑、水腫和壞死等情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，對斷裂延伸率、拉伸模量、拉抗強(qiáng)度、維卡軟化溫度、負(fù)荷變形溫度和磨損重量損失采用單樣本t檢驗(yàn)；P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 機(jī)械測試結(jié)果

2.1.1 分析結(jié)果 斷裂延伸率、拉伸模量、抗拉強(qiáng)度、維卡軟化溫度、負(fù)荷變形溫度和磨損重量損失的數(shù)據(jù)樣本均值與總體均值之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表1)[8]。證明表中數(shù)據(jù)間差異不是由抽樣引起的，即實(shí)驗(yàn)處理有效[9]。

表1 機(jī)械性能數(shù)據(jù)

2.2 化學(xué)測試結(jié)果 測定檢驗(yàn)液中的還原物質(zhì)消耗0.002 mol/L KMnO40.4 mL；檢驗(yàn)液與空白溶液pH差值為1.4；重金屬總含量(以pb2+計(jì))<1.0 μg/mL；蒸發(fā)殘?jiān)鼮?.6 mg；紫外吸光度為0.008。測試結(jié)果符合GB19335-2003中第3章節(jié)對以上5項(xiàng)的要求。

2.3 生物相容性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果 接種細(xì)胞前和加浸提液前生長狀態(tài)良好；加浸提液24 h后，陽性對照組細(xì)胞裂解死亡；空白對照組、陰性對照組、樣品浸提液組(100%，75%，50%，25%)生長狀態(tài)良好。24 h細(xì)胞活力結(jié)果見表2。細(xì)胞形態(tài)觀察和細(xì)胞活力的試驗(yàn)結(jié)果顯示樣品浸提液對小鼠成纖維細(xì)胞無潛在毒性影響。

表2 24 h細(xì)胞活力結(jié)果

2.3.2 皮膚致敏試驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組激發(fā)后陽性發(fā)生率為0；陽性對照組陽性發(fā)生率為100%，陰性對照組發(fā)生率為0。實(shí)驗(yàn)組和陰性對照組豚鼠斑貼部位皮膚未出現(xiàn)紅斑和水腫；陽性對照組斑貼部位皮膚出現(xiàn)明顯紅斑和水腫。豚鼠皮膚致敏試驗(yàn)中未見樣品浸提液對豚鼠引起皮膚致敏反應(yīng)。

2.3.3 皮內(nèi)刺激試驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物未出現(xiàn)異常癥狀或死亡。試驗(yàn)樣品組極性和非極性浸提液皮內(nèi)反應(yīng)均未超過對照組。樣品的極性和非極性浸提液在兔皮膚內(nèi)未發(fā)現(xiàn)皮內(nèi)刺激反應(yīng)。

3 討 論

隨著我國人口老齡化，骨關(guān)節(jié)炎多發(fā)，骨科臨床醫(yī)師對保膝治療展現(xiàn)了極大的積極性[10]。近年來基于脛骨高位內(nèi)側(cè)截骨術(shù)的保膝手術(shù)被證明是治療早期骨關(guān)節(jié)炎的有效手段。然而此類手術(shù)需要一定的學(xué)習(xí)曲線，術(shù)中需要借助醫(yī)者的經(jīng)驗(yàn)積累，多次透視調(diào)整以獲得理想的截骨位置，導(dǎo)致手術(shù)時(shí)間延長，增加出血量、X線輻射，以及術(shù)后并發(fā)癥等都會(huì)影響手術(shù)效果。數(shù)字化3D打印技術(shù)應(yīng)用于脛骨高位截骨術(shù)領(lǐng)域，可以幫助克服以上缺點(diǎn)，從而使得脛骨高位截骨手術(shù)得到更好的應(yīng)用[11]。

目前已有多種材料用于3D打印導(dǎo)板，例如：丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物(acrylonitrile butadiene styrene copolymers，ABS)、光敏樹脂、聚酰胺、金屬等[1，12]。ABS樹脂成型的材料韌性好，但精度較低，適用于制備大體積的導(dǎo)板，如脊柱經(jīng)皮導(dǎo)板[13]；光敏樹脂材料成型精度高，強(qiáng)度適中，在口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[14]；聚酰胺具有成型溫度低、所需激光功率小的優(yōu)點(diǎn)，而且受力后不易變形，可消毒，適合用于制備小體積并對強(qiáng)度有要求的導(dǎo)板[15]；金屬材料包括鈦合金、醫(yī)用不銹鋼、鋁合金等，具有高精度和高強(qiáng)度，可加工成用于引導(dǎo)鉆頭、擺鋸和骨刀的導(dǎo)板[16]。打印材料和增材制造技術(shù)的選擇很大程度上取決于預(yù)期用途，不同3D打印技術(shù)制備的手術(shù)導(dǎo)板各有優(yōu)勢，需根據(jù)具體手術(shù)方式進(jìn)行選擇[17]。

通過本研究中所涉及的實(shí)驗(yàn)，可以證明聚酰胺選擇性激光燒結(jié)3D打印截骨導(dǎo)板表面硬度大且成型后形變溫度高，正常條件下使用時(shí)能保持良好且穩(wěn)定的機(jī)械性能[18]。其化學(xué)性能符合國標(biāo)一次性使用血路產(chǎn)品通用技術(shù)條件對相關(guān)測試項(xiàng)目的要求。材料無明顯細(xì)胞毒性、皮膚致敏和皮內(nèi)刺激反應(yīng)，符合國標(biāo)對于組織或骨短期接觸的外部接入器械的生物安全性的要求。但聚酰胺3D打印截骨導(dǎo)板在臨床應(yīng)用中仍然存在一些問題，如術(shù)中使用擺鋸沿著導(dǎo)板進(jìn)行操作時(shí)的高頻振動(dòng)容易使導(dǎo)板產(chǎn)生粉碎顆粒，在沿截骨槽進(jìn)行切割時(shí)也有可能使其斷裂[19]。此外由于聚酰胺材料粉末細(xì)小且不能被機(jī)體吸收，殘留在患者體內(nèi)是否存在安全隱患還有待臨床長期隨訪研究[20]。

綜上所述，3D打印聚酰胺材料能夠發(fā)揮3D打印導(dǎo)板數(shù)字化制作高效率的優(yōu)勢，其機(jī)械性能良好，化學(xué)性能和生物相容性都符合相關(guān)要求，具有良好的臨床應(yīng)用前景。

感謝蘇州大學(xué)環(huán)境研究所在3D打印截骨導(dǎo)板性能測試試驗(yàn)中給予的幫助和指導(dǎo)。