分光光度法測定飼料添加劑葉酸含量的方法研究

霍艷杰，雷浩，高勤葉，曹曉潔，張曉英，賀習(xí)文

（陜西秦云農(nóng)產(chǎn)品檢驗檢測股份有限公司，渭南714000）

葉酸一種水溶性B族維生素，是動物機體必需的一種維生素，是脂肪代謝不可或缺的輔酶，對氨基酸代謝和蛋白質(zhì)、核酸的生物合成有重要影響[1]。在動物機體中，葉酸缺乏會引起巨幼紅細(xì)胞貧血、同型半胱氨酸代謝障礙，在一些已有報道中，向動物食糧中添加葉酸，能改善畜禽動物的生長性能和免疫機能，同時在治療炎癥方面有較好的效果[2]。

目前已有報道的用來檢測葉酸的方法有液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3,4]、高效液相色譜法[5-8]、微生物法[9-11]、氨基酸分析儀法[12,13],、熒光猝滅法[14,15]、紫外分光光度法[16]等。但這些方法均用于水果、乳粉、血漿、葉酸片等基質(zhì)，鮮有用于飼料添加劑葉酸的分光光度法。本研究采用簡單、快捷的分光光度法測定飼料添加劑葉酸的主成分含量，該方法穩(wěn)定性好，實用性強，值得推廣。

1 試驗部分

1.1 儀器及試劑

SP-756P型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）；CP224C型萬分之一天平（奧豪斯儀器（常州）有限公司）；KQ-100DB型數(shù)控超聲波提取儀（昆山市超聲儀器有限公司）；PHSJ-4F型pH計（上海儀電科學(xué)股份有限公司）。

葉酸標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司，純度99%）；無水碳酸鈉（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，分析純）；磷酸二氫鉀（天津市天新精細(xì)化工開發(fā)中心，分析純）；超純水（杭州娃哈哈集團有限公司，一級水）；氫氧化鈉（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純）；0.1mol/L氫氧化鈉溶液：稱取4g氫氧化鈉，用水溶解并定容至1000mL；磷酸鹽緩沖液：取磷酸二氫鉀6.8g,加500mL水使溶解，用0.1moL/L的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.8，用水定容至1000mL；2 mol/L碳酸鈉溶液：稱取106g無水碳酸鈉，用水溶解定容至500mL；0.1 mol/L碳酸鈉溶液：稱取10.6 g碳酸鈉，用水溶解定容至1000 mL；葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取0.1 g（精確至0.0001g）葉酸標(biāo)準(zhǔn)品于100mL棕色容量品中，加0.1mol/L碳酸鈉溶液，超聲溶解并定容至刻度，搖勻，葉酸含量為1000μg/mL；葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取10mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液于50mL棕色容量瓶中，用0.1mol/L碳酸鈉溶液稀釋定容，濃度為200μg/mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理過程

準(zhǔn)確稱取試樣0.1g（精確至0.0001g），置于100mL棕色容量瓶中，加0.1mol/L碳酸鈉溶液約80mL，超聲至完全溶解后，用0.1mol/L碳酸鈉溶液定容至刻度，搖勻。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取0.1g（精確至0.00001g）葉酸標(biāo)準(zhǔn)品于100mL棕色容量品中，加0.1mol/L碳酸鈉溶液，超聲溶解并定容至刻度，搖勻。葉酸含量為1000μg/mL，置于2℃～8℃環(huán)境保存；

葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確移取10mL葉酸標(biāo)準(zhǔn)儲備液于50mL棕色容量瓶中，用0.1mol/L碳酸鈉溶液稀釋定容，濃度為200μg/mL。

1.2.3 樣品測定

準(zhǔn)確吸取樣品處理液5.00 mL于50mL棕色容量瓶中，用緩沖液定容至刻度，搖勻。準(zhǔn)確吸取樣品稀釋液1.00mL于50mL棕色容量瓶中，用磷酸鹽緩沖液定容至刻度,用1cm石英比色皿在波長281nm處用分光光度計測定各溶液吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)

準(zhǔn)確移取1.2.2中葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液0.05mL、0.10mL、0.20mL、0.40mL、0.80mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL于50mL棕色容量瓶中（相當(dāng)于10μg、20μg、40μg、80μg、160μg、200μg、300μg、400μg），用磷酸鹽緩沖液定容至刻度，以磷酸鹽緩沖液為參比，用1cm石英比色皿在波長281nm處用分光光度計測定各溶液吸光度，以葉酸含量為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制工作曲線，見圖1。

圖1 葉酸系列標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

從圖1可以看出，葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作曲線在10~400μg范圍內(nèi)線性良好，線性方程為y=0.0013x+0.0013，相關(guān)系數(shù)R2=1.0000，滿足試驗條件。

2.2 精密度考察

按照1.2中的樣品前處理方法及樣品測定過程，準(zhǔn)確稱取已知含量的葉酸添加劑質(zhì)控樣品0.1g，并進(jìn)行6組平行試驗，并按照相同方法連續(xù)測定3d，所測得數(shù)據(jù)見表1。

從表1可以看出，6組平行樣品日內(nèi)變異系數(shù)為0.7%，日間變異系數(shù)為0.9%，證明本研究精密度良好。

表1 方法精密度測試 單位：%

2.3 回收率考察

按照1.2中的樣品前處理方法及樣品測定過程，已知葉酸含量的葉酸添加劑質(zhì)控樣品，標(biāo)識值為96.4%，本方法測定結(jié)果為96.3%，回收率為99.9%，證明本研究回收效果良好。

2.4 緩沖溶液穩(wěn)定效果考察

將處理好的樣品溶液分別靜置10min、20min、30min、40min、50min、60min后測定其結(jié)果，測定結(jié)果表明靜置時間≤40min時測定結(jié)果相對穩(wěn)定。靜置時間≥50min時，測定結(jié)果較之前測定結(jié)果有較大變化，證明葉酸在磷酸鹽緩沖溶液中40min內(nèi)相對穩(wěn)定。

2.5 實際樣品測定

國標(biāo)方法測定飼料添加劑葉酸含量用的是液相色譜法，需要液相色譜儀，試驗過程耗時較長，成本較高，適用于大型生產(chǎn)廠家檢測，本研究方法方便快捷，耗時相對較短，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，還可以減小成本，實用性強。

從市場上購買和抽取了6份葉酸添加劑樣品，采用國標(biāo)方法和1.2中的樣品前處理方法及樣品測定過程同時對樣品中葉酸含量進(jìn)行測定，測定的部分結(jié)果見表2。

表2 實際樣品的測定情況 單位：%

從表2可以看出，用兩種方法分別測定飼料添加劑葉酸含量，最大標(biāo)準(zhǔn)偏差≤0.3%，證明本研究結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 結(jié)論

本研究基于天津藥學(xué)中紫外分光光度法測定葉酸片含量的測定，建立了一種測定飼料添加劑葉酸含量測定方法。經(jīng)過試驗證明，本方法具有良好的穩(wěn)定性，且方法簡單、快速、準(zhǔn)確。