人工膜肺用于血液回輸前一氧化氮負(fù)載的研究

趙 靜，陳 濤，李三中，侯麗宏，雷 翀

當(dāng)紅細(xì)胞膜被破壞時(shí)，可釋放游離血紅蛋白（free hemoglobin，fHb），血漿中過量的fHb可引起血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、血小板活化、炎癥反應(yīng)、氧化損傷等不良反應(yīng)，從而導(dǎo)致微循環(huán)障礙、肺動(dòng)脈高壓、甚至肺、腎臟、腸道等器官的損傷［1－2］。其中，因fHb導(dǎo)致的內(nèi)皮源性一氧化氮（nitric oxide，NO）耗竭是引起血管內(nèi)皮功能障礙進(jìn)而導(dǎo)致器官功能受損的重要機(jī)制［2－3］。如何降低因fHb的增加而引起的器官損傷是備受關(guān)注的臨床問題。既往的研究及本團(tuán)隊(duì)前期的研究均提示，外源性的補(bǔ)充NO可減少fHb引起的內(nèi)源性NO消耗，從而減少fHb相關(guān)的損傷［4］。臨床最為常用的外源性NO的補(bǔ)充方法為吸入NO氣體，然而，目前對于NO吸入的臨床獲益尚存在爭議［5］，且NO吸入治療也存在一定弊端，因此，若在血液回輸前，能在體外對于含大量fHb的血液進(jìn)行NO負(fù)載后再進(jìn)行回輸，理論上可以在減少fHb相關(guān)器官損傷的同時(shí)避免直接吸入NO的損害和弊端。

本研究擬通過使用體外膜肺材料對長時(shí)間心肺轉(zhuǎn)流（cardiopulmonary bypass，CPB）后回收的殘余機(jī)血進(jìn)行NO負(fù)載處理，初步建立血液的NO體外負(fù)載方法模型，檢測體外膜肺材料對血液進(jìn)行NO負(fù)載中的價(jià)值，探索使用人工膜肺對血液進(jìn)行NO負(fù)載的有效參數(shù)，為后續(xù)的研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器收集5例主動(dòng)脈夾層動(dòng)脈瘤行全主動(dòng)脈弓置換術(shù)患者CPB結(jié)束后回收的、經(jīng)肝素抗凝的殘余機(jī)血450 ml/例（總CPB時(shí)間大于3 h，回收機(jī)血中含有大量fHb）、聚丙烯（polypropylene，PP）材質(zhì)氧合器5個(gè)（廣東科威）、醫(yī)用一氧化氮?dú)怏w、醫(yī)用氧氣、無菌儲(chǔ)血袋、一次性無菌輸血器、動(dòng)脈血?dú)忉?、真空采血管、fHb檢測試劑盒（QuantichromTM Hemoglobin Assay Kit，BioAssay System）、NO治療儀（SLE3600）、血?dú)夥治鰞x（GEM 4000）、低溫高速離心機(jī)（中國湘立）、酶標(biāo)儀（美國biotek）、Sievers NOA 280i NO分析儀（美國GE公司）。

1.2 NO負(fù)載裝置及負(fù)載流程

1.2.1 人工膜肺的準(zhǔn)備 使用0.9%的生理鹽水預(yù)充排氣人工膜肺并浸泡10 min，記錄預(yù)充量。以20 ml/min的流速，使用機(jī)血沖洗浸泡過的膜肺，直至人工膜肺入血口和出血口血紅蛋白濃度相等，記錄沖洗量。每次使用新的參數(shù)前均需使用相當(dāng)于沖洗量的新的機(jī)血沖洗人工膜肺，以排除前一次實(shí)驗(yàn)的影響。

1.2.2 相關(guān)參數(shù)的設(shè)置 本研究使用同等規(guī)格的大鼠膜肺，其膜面積恒定，NO氣體濃度恒定，通過設(shè)定不同的血液流速達(dá)到調(diào)整氣血比的目的。本研究依據(jù)輸液泵本身的泵速限制，設(shè)置四種血液流速：20 ml/min、15 ml/min、10 ml/min、5 ml/min。為研究膜面積對于負(fù)載效果的影響，本研究中使血液多次通過膜肺來擴(kuò)展膜面積，每個(gè)設(shè)定流速下，血液均通過3次人工膜肺以完成NO負(fù)載。

1.2.3 裝置及負(fù)載流程（圖1） ①將所收殘余機(jī)血分為四等分，每個(gè)流速使用一份；②按照圖1連接系統(tǒng)，并設(shè)置血液流速，使用血液沖洗人工膜肺后，分別按設(shè)定速度和濃度同時(shí)開啟輸液泵和NO氣體，血液完全通過人工膜肺后則完成第一次NO負(fù)載，然后調(diào)換儲(chǔ)血袋位置使其中的血液再次以該設(shè)定速度通過人工膜肺完成第二次及第三次NO負(fù)載，該設(shè)定血液流速下的實(shí)驗(yàn)完成；③調(diào)整血液流速完成其他三個(gè)設(shè)定流速下的NO負(fù)載實(shí)驗(yàn)，每次更改流速設(shè)定后，均需使用新的機(jī)血以最大流速20 ml/min沖洗人工膜肺，待四個(gè)流速下的實(shí)驗(yàn)均完成，該次實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

圖1 NO裝置及負(fù)載流程示意圖

1.3 血樣的采集及fHb、NO消耗檢測在每個(gè)流速時(shí)的基礎(chǔ)狀態(tài)（每次調(diào)整血液流速后）及每完成一遍NO負(fù)載實(shí)驗(yàn)后分別采血4.5 ml用于血?dú)鈾z測及后續(xù)的fHb及NO消耗的檢測。fHb濃度檢測試劑盒按照說明書操作，使用酶標(biāo)儀讀取400 nm波長的吸收度；NO消耗使用Sievers NOA 280i一氧化氮分析儀進(jìn)行檢測，在玻璃反應(yīng)槽中加入可持續(xù)產(chǎn)生穩(wěn)定流量的NO氣體的NONOate，Sievers可將穩(wěn)定的NO信號(hào)轉(zhuǎn)換為穩(wěn)定的電信號(hào)，通過分析加入fHb標(biāo)準(zhǔn)品及含fHb血樣品后電信號(hào)的變化即可計(jì)算出每一份樣品的NO消耗。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較采用方差分析，對NO負(fù)載后NO消耗及高鐵血紅蛋白（methemoglobin，MetHb）比例的變化趨勢使用重復(fù)測量方差分析，組間兩兩比較使用最小顯著性差異法（least significant difference，LSD），fHb及K＋的變化使用方差分析，P＜0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 血漿消耗NO能力及MetHb的變化不同血液流速組之間，經(jīng)負(fù)載后不同時(shí)點(diǎn)的血漿消耗NO的能力有顯著差異（P＜0.05）（表1）。對各組NO消耗數(shù)據(jù)進(jìn)行重復(fù)測量的方差分析，不同組之間進(jìn)行三次負(fù)載后NO消耗的均值之間有顯著性差異（F＝2.333，P＝0.035）（圖2A）。從變化趨勢分析來看，三次負(fù)載之間均存在顯著的線性變化趨勢（F＝582.747，P＜0.01）和二次方變化趨勢（F＝7.236，P＝0.02）。不同組間的線性變化趨勢之間無顯著性差異（F＝0.805，0.515），但二次方變化趨勢顯著不同（F＝6.580，P＝0.007）。組間兩兩對比結(jié)果顯示，NO消耗隨時(shí)間的變化趨勢在20 ml/min組與15 ml/min組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.692），在5 ml/min組和10 ml/min組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＝0.056），而在20 ml/min組與5 ml/min（P＜0.001）和10 ml/min（P＝0.009）組之間有顯著性差異。對于三次負(fù)載后，不同組之間NO消耗變化的差值之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖2B）。

圖2 NO負(fù)載后血中NO消耗的變化

表1 不同血液流速下血漿NO消耗的比較（μmol/L，±s）

表1 不同血液流速下血漿NO消耗的比較（μmol/L，±s）

時(shí)點(diǎn) 20 ml/min 15 ml/min 10 ml/min 5 ml/min F值 P值基礎(chǔ)值 47.25±3.62 46.14±4.93 45.20±0.79 45.48±1.13 0.344 0.794第一次負(fù)載 37.35±3.94 37.00±0.70 33.31±1.73 32.53±2.62 3.816 0.039第二次負(fù)載 27.29±0.45 31.49±1.75 27.04±0.88 22.51±4.05 10.526 0.001第三次負(fù)載 22.43±1.21 17.83±0.93 17.82±0.93 15.42±0.85 12.468 0.001

對組間各時(shí)點(diǎn)的MetHb比值進(jìn)行方差分析，結(jié)果顯示組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3A）。而經(jīng)重復(fù)測量方差分析后所得結(jié)果與NO消耗結(jié)果類似，不同組之間進(jìn)行三次負(fù)載時(shí)MetHb比例的均值之間有顯著性差異（F＝386.09，P＜0.001）。從變化趨勢分析來看，三次負(fù)載之間均存在顯著的線性變化趨勢（F＝987.429，P＜0.001）和二次方變化趨勢（F＝19.898，P＝0.001）。不同組間的線性變化趨勢和二次方變化趨勢均顯著不同（P＜0.001）。同樣經(jīng)過三次NO負(fù)載后，與基礎(chǔ)值相比，以20 ml/min的血流速度進(jìn)行NO負(fù)載后血中MetHb比例升高程度最大（升高了1.637%）。之后依次為15 ml/min（1.188%），5 ml/min（1.181%）和10 ml/min（0.944%）。

2.2 不同血液流速下fHb及K＋的變化血中fHb和K＋均有輕度增加，但不同組間各時(shí)間點(diǎn)的fHb和K＋并無顯著性差異，且經(jīng)三次負(fù)載后分別與基礎(chǔ)值之間相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（圖3B、圖3C）。

圖3 負(fù)載過程中血漿MetHb、fHb和K＋的變化趨勢

3 討 論

既往的研究顯示，血中fHb的升高與患者并發(fā)癥的發(fā)生具有顯著相關(guān)性，而由fHb引起的血管內(nèi)皮源性NO的耗竭是fHb相關(guān)不良反應(yīng)的主要發(fā)生機(jī)制［2－3］。臨床診療過程中有多種發(fā)生紅細(xì)胞破壞導(dǎo)致fHb釋放的場景：庫存紅細(xì)胞輸注、自體血回輸、CPB、體外膜氧合治療、血液透析等［6－7］。如何降低因fHb的增加而引起的器官損傷是備受關(guān)注的臨床問題。有學(xué)者嘗試通過外源性的補(bǔ)充NO來減少fHb引起的內(nèi)源性NO消耗，方法包括靜脈應(yīng)用可持續(xù)產(chǎn)生NO的藥物（如L－精氨酸、硝普鈉、鳥苷酸環(huán)化酶）或具有靶向釋放NO的NO供體，但目前多處于臨床前研究階段［8－9］，相比較而言吸入NO氣體是相對常用的臨床治療方法。

本團(tuán)隊(duì)前期的研究顯示，CPB心臟手術(shù)時(shí)由于紅細(xì)胞被破壞，血中fHb大幅度升高，升高的比例對于術(shù)后發(fā)生急性腎損傷有重要的預(yù)測作用，而在CPB開始時(shí)吸入持續(xù)24 h的NO可降低fHb升高導(dǎo)致AKI的發(fā)生率［4］。然而，目前對于吸入NO的臨床獲益尚存在爭議，其原因可能在于NO的生理作用廣泛（血管緊張度調(diào)節(jié)、凝血過程、炎癥反應(yīng)和氧化作用）。因此，吸入時(shí)機(jī)、吸入時(shí)長及吸入對象的不同均可能導(dǎo)致不同的臨床預(yù)后［5］。事實(shí)上，進(jìn)行NO吸入治療也有其弊端：首先，未接受氣管插管患者的NO吸入效率較低；其次，吸入NO需要特殊的設(shè)備，并非所有的醫(yī)療單位均可滿足；第三，由于NO和氧氣可快速反應(yīng)生成有毒性的二氧化氮（nitrogen dioxide，NO2），患者吸入高濃度NO2時(shí)可能造成呼吸道損傷；第四，長時(shí)間大量吸入NO可導(dǎo)致體內(nèi)MetHb比例升高，影響氧氣輸送。因此，如果能在含fHb的血液進(jìn)入機(jī)體之前降低其消耗NO的能力，理論上較全身使用NO供體或吸入NO治療更具優(yōu)勢。本研究即是基于以上理論基礎(chǔ)的初步嘗試，結(jié)果顯示，該負(fù)載模型可有效降低血液消耗NO的能力。

本研究中建立的NO負(fù)載模型是通過使用PP材質(zhì)的人工膜肺完成負(fù)載的。既往有研究顯示，NO可以通過擴(kuò)散透過PP材質(zhì)的人工膜肺，并且對于血小板功能具有保護(hù)性作用。而且既往的研究也顯示，接受CPB的患者在CPB開始時(shí)通過PP材質(zhì)的人工膜肺吸入NO可降低其血漿消耗NO的能力，提示PP材質(zhì)的膜肺對NO有一定的通透性［4］。這是本研究中選用PP材質(zhì)的小動(dòng)物用模式氧合器的根據(jù)，該氧合器具有預(yù)充量?。s10 ml）、參數(shù)已知、制作工藝成熟等優(yōu)點(diǎn)，在本研究中的應(yīng)用可減少實(shí)驗(yàn)用血液的損耗、并可為開發(fā)適用于NO負(fù)載處理的氣體交換裝置的參數(shù)設(shè)置提供可靠參考。人工膜肺內(nèi)含并列的PP材質(zhì)的中空纖維集束，氣體小分子可自由通過該中空纖維膜。中空纖維集束與膜肺外壁形成相互隔離的氣路和血路，當(dāng)可溶性或可被血液吸收的氣體通過浸泡于血液中的中空纖維膜時(shí)，通過彌散作用穿過纖維膜到達(dá)血液，血中高濃度的氣體小分子也可通過中空纖維膜釋放逸出，達(dá)到氣體交換的目的。使用人工膜肺進(jìn)行NO負(fù)載相較于直接將NO氣體通入血液完成負(fù)載有以下優(yōu)勢：①避免造成血液的污染；②避免氣體直接通入血液產(chǎn)生泡沫；③避免因需要使用消泡劑增加輸血的不安全因素；④避免直接通氣時(shí)因氣泡產(chǎn)生的溶血。

理想的負(fù)載模型理論上應(yīng)該具有可快速負(fù)載、不增加血液破壞、可進(jìn)行無菌處理、不需在血液中添加除NO之外的其他物質(zhì)即可對血液進(jìn)行按需負(fù)載等特點(diǎn)。本研究中使用的人工膜肺的負(fù)載效率與該材質(zhì)對于NO氣體的交換效率有關(guān)。而交換效率與其材質(zhì)、氣血比及交換膜面積有關(guān)。本研究中所用膜肺本身已經(jīng)過無菌處理，其對血液進(jìn)行NO負(fù)載時(shí)僅靠氣體的彌散通過膜肺進(jìn)入血液，而不需在血液中添加其他物質(zhì)，已經(jīng)滿足以上特點(diǎn)中的兩點(diǎn)。本研究擬通過實(shí)驗(yàn)來對該負(fù)載模型的負(fù)載效率和安全性進(jìn)行檢測。在本研究中，膜肺的材質(zhì)和膜面積固定，選擇使用固定的NO氣體濃度，僅通過改變血流速度來改變氣血比，通過增加血液流過膜肺的次數(shù)來擴(kuò)展膜面積，這種方法不僅可節(jié)約用血，提高膜肺及血液的利用率，更為之后更為詳細(xì)的參數(shù)計(jì)算帶來便利。本研究的結(jié)果顯示，無論血液以哪種速度通過膜肺，通過次數(shù)對NO消耗的下降均有顯著影響，負(fù)載后NO消耗的變化呈線性或二次方變化趨勢，NO消耗隨通過次數(shù)的增加迅速下降，通過次數(shù)代表了膜面積，該結(jié)果說明通過擴(kuò)展膜面積可顯著提升該模型的負(fù)載效力，或者對于有大量紅細(xì)胞被破壞的血液，如長時(shí)間CPB、體外膜氧合（ECMO）或透析時(shí)可以通過增加血液在該模型中的轉(zhuǎn)流次數(shù)來對血液中fHb進(jìn)行NO負(fù)載，進(jìn)而減少fHb引起的器官損傷。

不同的血液流速對于NO負(fù)載的效力也有一定影響，現(xiàn)有模型中的四種流速相比，進(jìn)行三次NO負(fù)載后，血中NO消耗在5 ml/min的血流速度下下降最多，而20 ml/min的血流速度下下降最少，但組間并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果提示，現(xiàn)有負(fù)載模型中，雖然5 ml/min的速度負(fù)載效力更高，但進(jìn)行三次負(fù)載的效果與20 ml/min的速度下進(jìn)行三次負(fù)載的效果并無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，因此，在負(fù)載效果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的情況下，使用20 ml/min的血流速度可大大提升NO的負(fù)載速度，以更好的應(yīng)對各種緊急用血的臨床情景。從安全性考慮，無論以哪種血流速度進(jìn)行負(fù)載，該負(fù)載模型處理后的血液中fHb和K＋濃度均有升高，但三次負(fù)載后與負(fù)載前以上結(jié)果并無顯著性差異，該結(jié)果提示，此負(fù)載模型可能增加溶血，但僅進(jìn)行三次負(fù)載時(shí)引起的溶血程度很輕，與基礎(chǔ)值之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，不同血液流速之間也無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從血中MetHb升高的程度來看，不同組間MetHb的上升趨勢有所差別。MetHb比例的升高會(huì)使氧離曲線左移，從而影響氧的釋放，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，MetHb在高于10%～20%時(shí)可能引起紫紺，35%～40%會(huì)導(dǎo)致頭痛、疲勞、頭暈和呼吸困難，高達(dá)60%～70%可能導(dǎo)致癲癇發(fā)作、心律失常、循環(huán)衰竭甚至死亡［10］。在本模型中，血液經(jīng)NO負(fù)載后其中MetHb的比例均增加，不同組間相比，以20 ml/min的血流速度進(jìn)行三次負(fù)載后MetHb比例升高的程度最高，但是，其最高值依然低于3%，遠(yuǎn)低于前述的臨床危急值。以上結(jié)果提示，使用該模型對血液進(jìn)行負(fù)載時(shí)所引起的MetHb的升高不會(huì)引起不良的臨床效應(yīng)，即使在大量輸血的情況下亦可滿足安全性條件。綜合以上結(jié)果，在本負(fù)載模型中，推薦使用20 ml/min的血流速度對血液進(jìn)行NO負(fù)載，負(fù)載速度更快，效率更高，并可滿足臨床的安全性要求。然而，本研究中所設(shè)血流速度受限于所使用微量泵的極限速度，是否更高的血流速度可以更高效的完成負(fù)載會(huì)在后期改良實(shí)驗(yàn)設(shè)備后進(jìn)一步探索。

目前有關(guān)NO體外預(yù)負(fù)載的研究相對較少，但是有關(guān)內(nèi)皮模擬表面的研究近年已然興起，其主要目的是開發(fā)具有可持續(xù)釋放NO功能的涂層材料或方法，如接觸血液的材料［11］、人工血管或血管內(nèi)支架，此類研究的目的也是通過外源性的補(bǔ)充NO以彌補(bǔ)因各種原因受損的血管內(nèi)皮功能，而本研究目標(biāo)是建立NO體外負(fù)載模型，在可能損傷血管內(nèi)皮功能的血液進(jìn)入機(jī)體之前通過預(yù)處理以降低其對內(nèi)皮功能的損害，本模型中所用材料與設(shè)備均是已投入臨床應(yīng)用的成熟產(chǎn)品，較新材料的開發(fā)更易實(shí)現(xiàn)。

綜上所述，本研究中所建立的使用PP材質(zhì)的人工膜肺材料進(jìn)行血液回輸前的NO負(fù)載模型可有效用于含大量fHb的紅細(xì)胞制品的體外NO負(fù)載，負(fù)載后可顯著降低血液消耗NO的能力，但是負(fù)載過程可能會(huì)導(dǎo)致輕微的紅細(xì)胞破壞。人工膜肺材料對fHb進(jìn)行NO負(fù)載的效率與氣血比和膜面積有關(guān)，現(xiàn)有模型中20 ml/min的血流速度優(yōu)于較低血流速度下的NO負(fù)載。