無患子葉斑病病原菌鑒定及其生物學特性

鄭婉錚，孫 宇，林先云，陳全助，馮錦秀，蔡 琦，馮麗貞*

（1.福建農(nóng)林大學林學院，福州 350002；2.順昌縣林業(yè)局，福建順昌 353200；3.福建農(nóng)林大學金山學院，福州 350002）

無患子（Sapindus mukorossi）別名黃金樹、肥皂樹等，屬無患子科（Sapindaceae）無患子屬（Sapindus）[1]，落葉喬木，廣泛分布于我國南方。無患子用途較多，具有很高的實用價值。其樹形美觀，木質堅硬厚重，既可用于制作各種家具及雕刻，又可作為行道樹和庭園蔭樹[2-3]；其果皮、果實及莖中含有黃酮類化合物、脂肪酸等，不僅是天然活性香料，也有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)和鎮(zhèn)痛等藥效[4-6]；且果皮表面的活性成分倍半萜糖苷類和三萜皂苷類，是天然的活性劑，去污力強，天然無公害，已運用至醫(yī)療及日常生活中的多個領域[7-8]。在順應綠色發(fā)展的時代潮流下，無患子作為天然的洗護珍果，其生產(chǎn)發(fā)展具有廣闊前景[9]。

由于大面積純林種植，林分結構單一，林分抗逆性差，以致無患子病害頻繁暴發(fā)。受害植株葉部干枯，甚至提早脫落，影響植株光合作用，產(chǎn)量急劇下降，嚴重影響經(jīng)濟效益，成為限制無患子產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。目前對于無患子的病害研究大都集中在煤污病、黑星病、炭疽病、枯萎病和潰瘍病[10-13]。有鑒于此，本研究以福建省順昌縣受害無患子人工林基地采集的病樣組織為研究對象，通過組織分離法、致病性測定、形態(tài)學鑒定及分子生物學鑒定，確定無患子葉斑病病原菌種類，在此基礎上探究病原菌生物學特性，研究結果將為無患子葉斑病的科學防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株的分離培養(yǎng)與純化

用組織分離法[14]對菌株進行分離。采集具有典型葉斑病癥狀的無患子葉片，用無菌手術刀剪取病健交接處3 mm×3 mm的葉部組織，先用75%的酒精消毒30 S，5%的次氯酸鈉消毒2 min，再用無菌水漂洗4次，并置于滅菌紙上干燥后，接種至PDA培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待葉片長出菌絲時，挑取菌落邊緣的菌絲至PDA培養(yǎng)基進行多次純化。

1.2 致病性測定

接種分為有傷接種和無傷接種，接種前將無患子離體葉片用75%的酒精進行消毒，無菌水洗脫酒精后將葉片分為兩組。一組采用針刺法，采用無菌針頭針刺4～5個相鄰的孔，取0.6 cm的菌餅接種在傷口處。另一組直接將0.6 cm的菌餅接種至無損傷葉片，以空白PDA菌餅為對照，置于25℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，逐日觀察記錄，每處理5個重復。取接種發(fā)病后的部位進行組織分離并鏡檢觀察。

1.3 形態(tài)學鑒定

菌落形態(tài)特征觀察：將病原菌接種至PDA培養(yǎng)基上，黑暗條件下28℃恒溫培養(yǎng)，逐日觀察培養(yǎng)皿內(nèi)菌落的形態(tài)特征。

菌落顯微特征觀察：將病原菌接種至綜合PDA培養(yǎng)基[14]（馬鈴薯200 g取汁，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀 3 g，硫酸鎂1.5 g，水 1 000 mL）上，置于黑光燈下24 h不間斷照射，誘導子座產(chǎn)生后，觀察子座特征及產(chǎn)孢結構等形態(tài)特征。

1.4 分子生學物學鑒定

參照真菌DNA提取試劑盒（E.Z.N.A.SP Fungal DNA mini kit）說明書提取病原菌DNA，ITS序列擴增引物采用ITS1/ITS2，PCR反應體系：98℃預變性3 min；98℃變性 10 s，58℃退火 15 s，72℃延伸30 s，34個循環(huán)；72℃再延伸10 min。測序工作委托福州白鯨生物科技有限公司完成。結合所得ITS序列的BLAST比對結果，選擇參比序列。ITS序列的系統(tǒng)親緣關系通過CLUSTAL-X軟件校正，MEGA7軟件完成系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。

1.5 生物學特性研究

1.5.1 不同培養(yǎng)基對菌落生長的影響

供試的7種培養(yǎng)基分別為PDA、PSA、Czapek、Bilays、WA、黃豆和淀粉瓊脂[15]，將病原菌接入不同培養(yǎng)基中央后25℃下暗培養(yǎng)7 d，菌落測量方法采用十字交叉法，各處理3次重復。

1.5.2 不同碳、氮源對菌絲生長的影響

碳源真菌生理培養(yǎng)基：碳源5 g，硝酸鈉1 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，瓊脂17 g，水1 000 mL。將碳源等量替換成葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、甘露醇和可溶性淀粉，將病原菌接入不同碳源培養(yǎng)基中央后25℃下暗培養(yǎng)7 d，菌落測量方法采用十字交叉法，各處理3次重復。

氮源真菌生理培養(yǎng)基：氮源1 g，硫酸鎂0.5 g，磷酸二氫鉀0.5 g，葡萄糖5 g，瓊脂17 g，水1 000 mL。將氮源等量替換成硝酸鉀、氯化銨、硝酸鈉、酵母膏、磷酸氫二鉀、蛋白胨、硝酸鈣、牛肉浸膏，培養(yǎng)方法與統(tǒng)計方法同上。

1.5.3 溫度對菌絲生長的影響

設置 5、10、15、20、25、28、30 和 35 ℃共 8 個不同溫度梯度，將病原菌接入PDA平板中央后分別置于上述不同溫度培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)7 d，菌落測量方法采用十字交叉法，各處理3次重復。

1.5.4 pH值對菌絲生長的影響

用1 mol/L的氫氧化鈉及鹽酸溶液調(diào)整PDA培養(yǎng)基 pH 值至 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0 和13.0等9個不同pH值梯度，將病原菌接入不同pH值的培養(yǎng)基平板中央后，25℃下暗培養(yǎng)7 d，菌落測量方法采用十字交叉法，各處理3次重復。

1.5.5 光照對菌絲生長的影響

3種光照條件分別為全光照、12 h光暗交替和全黑暗。將病原菌接入PDA平板中央后，不同光照條件下25℃培養(yǎng)7 d，菌落測量方法采用十字交叉法，各處理3次重復。

1.5.6 菌絲致死溫度測定

致死溫度分別設置為 37、40、45、50和 55 ℃，取病原菌菌餅置于加入無菌水的2 mL的離心管中，各溫度梯度水浴10 min后接種到PDA平板中25℃暗培養(yǎng)7 d，菌絲是否生長分別用符號“+”和“-”表示，各處理3次重復。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析在Microsoft Excel 2017和SPSS 19.0中完成，經(jīng)多重比較分析不同條件下菌落生長影響的相關性，顯著水平設置為P=0.05。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

對具有典型癥狀的無患子葉斑病觀察發(fā)現(xiàn)，該病害主要為害無患子葉片，患病初期該部位出現(xiàn)黃褐色斑點，后逐漸向外擴展，形成不規(guī)則的淡褐色或深褐色的病斑，病斑上常伴有黑色小點（圖1A），潮濕條件下會產(chǎn)生黑色墨汁狀液體（圖1B）。

2.2 病原菌分離及致病性測定

通過組織分離法共分離出9種菌株，命名為SW-1、SW-2、SW-3、SW-4、SW-5、SW-6、SW-7、SW-8、SW-9，用離體接種對分離到的9種菌株進行致病性測定。結果發(fā)現(xiàn)，接種SW-9菌餅的無患子葉片在有傷接種與無傷接種的情況下均能產(chǎn)生黃褐色不規(guī)則病斑（圖1C、1D），其余8種菌株進行無傷接種及有傷接種后都無典型病斑。利用組織分離法對發(fā)病葉片進行再分離、純化，獲得菌株與原始菌株一致，完成柯赫氏法則，表明SW-9為致病菌株。

2.3 形態(tài)學鑒定

菌落在PDA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)7 d后，菌落平均直徑5.72 cm，菌落近圓形；氣生菌絲呈白色，絨毛狀平鋪（圖2A、圖2B）。培養(yǎng)15 d后，菌落鋪滿培養(yǎng)皿，菌落中心產(chǎn)生炭黑色色素，菌落背面呈淡黃色，并帶有黑色暈圈。培養(yǎng)30 d后，菌落呈炭黑色，部分表面革質化，菌落背面無變化（圖2C、圖2D）。在綜合PDA固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)30 d可形成子座，子座不分枝或者分枝，圓柱形，高約0.5～2 cm；表面黑色、光滑；內(nèi)部白色（圖2E）；分生孢子器橢圓形，孔口稍微凸起，長83.49～114.28μm，寬45.93～57.62μm（圖2F）；孢子橢圓狀；單孢；光滑；不等邊至稍等邊；長 7～8 μm，寬 3～4 μm（圖 2G）。

2.4 分子生物學鑒定

通過NCBI的BLAS在線工具對SW-9的ITS序列進行比對，SW-9的ITS序列與Xylaria arbuscula（JQ761007）的一致性為99.64%。為驗證其準確性，進一步進行系統(tǒng)進化聚類分析，結果表明，SW-9與Xylaria arbuscula聚在同一分支，與其他種親緣關系較遠。結合形態(tài)學特征和進化分析，將菌株SW-9鑒定為Xylaria arbuscula。將其ITS序列提交至 GeneBank，獲得序列登錄號為 MK747250。

圖3 基于ITS序列和鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹Figure 3 Phylogenetic tree constructed by neighbor-joining analysis of ITS gene sequences of Xylaria arbuscula isolates

2.5 生物學特性研究結果

2.5.1 不同培養(yǎng)基對菌落生長的影響

該病原菌菌絲在不同培養(yǎng)基上生長速度和菌落特征差異較大（見圖4）。菌落在PDA生長最好，菌絲濃密，呈絨毛狀；其次為Czapek及PSA培養(yǎng)基，菌落特征與在PDA上的生長狀態(tài)相似，但菌落生長速度較慢；在淀粉瓊脂培養(yǎng)基上，菌絲較稀疏；在Bilays培養(yǎng)基上菌絲濃密，但生長速度緩慢；在WA及黃豆培養(yǎng)基上，菌落生長稀疏且緩慢。

圖4 不同培養(yǎng)基對菌落生長的影響Figure 4 The effect of different culture media on mycelial growth of Xylaria arbuscula

2.5.2 不同碳、氮源對菌落生長的影響

不同碳、氮源對病原菌菌絲生長的影響差異顯著，結果見圖5、圖6。在碳素營養(yǎng)中，菌絲對麥芽糖利用效果最好，其次為葡萄糖、果糖、可溶性淀粉，對甘露醇、蔗糖、乳糖的利用率低。在氮素營養(yǎng)中，以蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏的利用效果好，其次為硝酸鈣、硝酸鉀，對氯化銨及硝酸鉀利用率較低。

圖5 不同碳源基對菌落生長的影響Figure 5 The effect of carbon resources on mycelial growth of Xylaria arbuscula

圖6 不同氮源基對菌落生長的影響Figure 6 The effect of nitrogen resources on mycelial growth of Xylaria arbuscula

2.5.3 不同溫度對菌落生長的影響

由圖7可見，不同溫度條件對病菌菌絲生長影響顯著。病原菌在5～35℃內(nèi)均能生長，最適溫度為28℃，培養(yǎng)7 d后的菌落直徑為6.16 cm，最適溫度區(qū)間為25～30℃，在5～15℃范圍內(nèi)生長緩慢，不利于病原菌生長。

圖7 不同溫度對菌落生長的影響Figure 7 The effect of temperature on mycelial growth of Xylaria arbuscula

2.5.4 不同pH對菌落生長的影響

結果如圖8所示，在pH 5～13范圍內(nèi)該病原菌均可生長，偏酸性條件下生長狀況較好，最適生長的pH范圍是6～7，7 d后菌落直徑分別為5.72 cm和5.99 cm。

圖8 不同pH值對菌落生長的影響Figure 8 The efffect of pH on mycelial growth of Xylaria arbuscula

2.5.5 不同光照對菌落生長的影響

根據(jù)圖9中3種不同光照條件處理的菌落生長狀況來看，24 h全黑暗條件下菌落生長相對較快，菌落直徑為5.69 cm。24 h全光照與12 h/12 h光暗交替條件下菌落直徑分別為5.58 cm、5.63 cm。

圖9 不同光照條件對菌落生長的影響Figure 9 The effect of light on mycelial growth of Xylaria arbuscula

2.5.6 菌絲致死溫度測定

對該病原菌菌絲致死溫度測定的結果見表1，40℃以上菌絲均不能生長，因此該病原菌的致死條件為40℃、10 min。

表1 菌絲致死溫度測定Table 1 The mycelial growth temperature of Xylaria arbuscula

3 討論與結論

炭角菌屬Xylaria是1789年Hill ex Schrank建立的[16]，隸屬于真菌界子囊菌門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomycetes）炭角菌目（Xylariales）炭角菌科（Xylariaceae）[17]，炭角屬是炭角菌科中最大的屬，為該科的模式屬，全球有300余種[18]，目前，在中國有124種1變種1變型[19]。炭角菌的生境較廣，可生于木頭、糞便、雜物、植物種子、果實或葉片上，部分種類生于昆蟲巢上[20-21]。炭角菌屬有些種類是重要的植物病原菌，可造成重大經(jīng)濟損失，例如，由Xylaria buscula[22]引起的澳洲堅果潰瘍病、Xylaria mali[22]引起的蘋果根腐病，以及Xylaria pedunculata[23-24]在雞腿菇等食用菌栽培中引起的病害，該菌生于栽培食用菌的覆土層上，對食用菌的栽培危害很大，輕者減產(chǎn)，重者造成絕收。關于Xylaria arbuscula引起的無患子葉斑病為首次報道。

通過對無患子葉斑病病原菌（Xylaria arbuscula）生物學特性研究發(fā)現(xiàn)，該菌生長的溫度范圍較廣，酸堿度的適應能力較強，光照條件對該菌的生長影響較小。在添加不同氮源的培養(yǎng)基中，菌絲生長旺盛，表明該菌能夠較好地利用有機氮源。最有利于該菌菌絲體生長的碳、氮源分別是麥芽糖、葡萄糖和蛋白胨、酵母膏、牛肉浸膏，最適生長培養(yǎng)基為PDA、Czapek及PSA培養(yǎng)基，且在綜合PDA上經(jīng)黑光燈照射下能較快產(chǎn)生子座，顯示該菌對綜合營養(yǎng)的需求較高。

無患子葉斑病導致受害植株病葉容易脫落，病葉易隨著風或雨傳播，導致附近植株或整個種植區(qū)感染，不斷擴大葉斑病發(fā)生面積。而該病原菌（Xylaria arbuscula）適應生長的溫度范圍廣，對各pH值的適應能力強，因此，應對修剪病葉及落葉及時處理，冬季清園，避免病原菌順利越冬，來年繼續(xù)造成侵染。后續(xù)可在室內(nèi)篩選有效的化學藥劑，結合科學的營林措施，通過綜合防治策略，有效防止無患子葉斑病，進而有效保證無患子的質量和產(chǎn)量。