遮陰對野扇花生理指標及代謝產物積累的影響

敬洪霞,張俊波,薛 建,杜紅梅

(1上海交通大學設計學院,上海 200240;2上海交通大學農業(yè)與生物學院,上海 200240)

野扇花(Sarcococca ruscifolia)是黃楊科清香桂屬常綠灌木,主要分布于我國貴州等西南省份,目前多處于野生狀態(tài)。野扇花不僅能夠生長在路旁等光照充足的條件下,也能生長在林下等高度蔭蔽的條件下[1-3],而且具有濃郁的花香,是一種非常有發(fā)展前景的園林植物。

耐陰性是植物在低光環(huán)境下的生存和生長能力[4]。植物的光補償點(Light compensation point,LCP)越低,耐陰性越強[5]。蔭蔽條件下,耐陰植物葉片膨大,比葉面積增加,導致更多的輻射被截留,同時葉綠素a∕b(Chlorophyll a∕b,Chl a∕b)的比例下調,光合效率提高[6]。而在強光條件下,耐陰植物的葉綠體結構、葉綠素含量和光合速率等會發(fā)生相應的變化[7-9],從而影響植物的生長和發(fā)育。研究表明,與我國華東地區(qū)常見的耐陰植物八角金盤(Fatsia japonica)、一葉蘭(Aspidistra elatior)、狹葉十大功勞(Mahonia fortunei)和灑金桃葉珊瑚(Aucuba japchica)相比,野扇花的光補償點最低,具有極強的耐陰性[10]。

隨著分析和檢測技術的發(fā)展,代謝組學已經成為研究植物逆境脅迫的重要方法[11]。光照強度顯著影響蘋果(Malus domestica)果皮中糖類、有機酸、氨基酸和酚類物質的積累[12]。吳能表等[13]研究表明,隨光照強度減弱,長春花(Catharanthus roseus)葉片中淀粉和可溶性糖含量下降,而可溶性蛋白、游離氨基酸和硝態(tài)氮含量升高。目前,關于代謝產物積累和植物耐陰性關系的研究,鮮有報導[12,14]。本研究通過分析夏季不同遮陰強度對野扇花相關生理指標以及代謝產物積累的影響,以探究影響野扇花生長的可能生理機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為經過2年栽培管理的野扇花扦插苗,由上海迪士尼苗圃提供。2018年3月中旬,挑選生長發(fā)育良好,且苗高、株型、長勢基本一致的盆苗60株(盆徑22 cm,高20 cm,株高35—40 cm),移至上海交通大學農業(yè)工程訓練中心溫室內。45 d后,移入遮陰棚內。遮陰棚長寬高均為2 m,棚間距為1 m。棚內日溫26—38℃,夜溫24—30℃,相對濕度60%—80%。

1.2 試驗設計

試驗采用單因素隨機區(qū)組設計,設置CK(全光照,遮光率0%)、T1(遮光率約50%)和T2(遮光率約90%)3個處理,正午時,其光合有效輻射分別為1 000—1 200μmol·m-2·s-1、500—600μmol·m-2·s-1和100—150μmol·m-2·s-1。每個處理重復5次,每個重復至少1盆,30 d后取枝條中上部的成熟葉片,進行相關指標分析。

1.3 指標測定

1.3.1 葉片生理指標

取CK、T1、T2各組新鮮的葉片1 g左右,清洗干凈后用吸水紙吸去多余的水分,去除葉脈后稱重,測定不同處理的干物質含量(Dry matter content,DMC)。取CK、T1、T2各組新鮮的葉片4—5片,去除葉柄后剪成長10 mm,寬3—4 mm的小段,稱取0.1 g左右,采用二甲基亞砜法提取葉片中葉綠素,根據(jù)Arnon[15]的方法計算葉片中葉綠素總量、葉綠素a(Chlorophyll a,Chl a)、葉素素b(Chlorophyll b,Chl b)和類胡蘿卜素的含量(mg∕g·DW)。采用Blum等[16]和Bradford[17]的方法,分別測定不同處理葉片的電解質外滲(Electrophyte leakage,EL)和可溶性蛋白含量。

1.3.2 代謝產物提取、衍生化和氣相色譜-質譜分析

取-80℃保存的野扇花葉片,液氮充分研磨后,參考Rizhsky等[18]和Du等[19]的方法進行代謝產物的提取、甲氧基化和硅烷化,并使用美國安捷倫公司7890A-5975C型氣相色譜-質譜(Gas chromatographymass spectrometry,GC-MS)聯(lián)用儀進行分析。以核糖醇為內標,以代謝產物與核糖醇面積的比值作為代謝產物的相對含量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

應用SPSS Statistic 22軟件,采用最小顯著差數(shù)法進行統(tǒng)計分析(P<0.05)。采用SigmaPlot 10.0和SIMCA 13.0軟件繪制圖表。根據(jù)代謝產物的相對表達量采用SIMCA-P 11.0軟件,對代謝產物進行偏最小二乘法判別分析(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA),計算不同代謝產物的變異權重系數(shù)(Variable importance of projection,VIP),并繪制熱圖。

2 結果與分析

2.1 遮陰對野扇花相關生理指標的影響

由表1可知,隨著遮光度的增加,野扇花葉片中葉綠素總量、類胡蘿卜素含量、Chl a、Chl b含量以及Chl a∕b的比值都呈現(xiàn)顯著上升的趨勢,且不同遮陰處理組的含量存在顯著差異,與植株外部的形態(tài)一致(圖1)。遮陰顯著降低了葉片的干物質含量和細胞的電解質外滲(P<0.05),不同遮陰處理組間差異不顯著。另外,遮陰使葉片中可溶性蛋白的含量增加,與對照相比,T2條件下,葉片中可溶性蛋白的含量顯著增加。

表1 遮陰對野扇花葉片相關生理指標的影響Table 1 Effects of shade treatments on related physiological indexes of leaves in Sarcococca ruscifolia

圖1 不同遮陰處理對野扇花生長的影響Fig.1 The effects of different shading treatment on the growth of Sarcococca ruscifolia

2.2 遮陰對野扇花葉片相關代謝產物積累的影響

2.2.1 遮陰對野扇花葉片中代謝產物種類和含量的影響

采用GC-MS方法在野扇花葉片中檢測到600多個化合物峰(圖2)。利用美國國家標準與技術研究院(National Institute of Standards and Technology,NIST)2011數(shù)據(jù)庫檢索后,鑒定得到100種代謝產物,包括24種有機酸、22種氨基酸、28種糖、12種糖醇、9種胺類化合物和5種其他化合物。其中糖類的含量和數(shù)量最多(表2)。

表2 不同光照處理對野扇花葉片中代謝產物積累的影響Table 2 Effects of light intensity treatments on the accumulation of metabolites in leaves of Sarcococca ruscifolia

圖2 野扇花葉片代表性的氣相色譜-質譜總離子流色譜圖Fig.2 Representative total ion current chromatogram map of gas chromatography-mass spectrometry from leaves of Sarcococca ruscifolia

(續(xù)表2)

PLS-DA結果表明,GC-MS處理結果具有較好的重復性,不同遮陰處理顯著影響代謝產物的積累。其中第一主成分的貢獻率是36.6%,可以將全光照處理和兩個遮陰處理區(qū)別開,第二主成分的貢獻率是21.0%,可以將中度遮陰和重度遮陰的代謝產物區(qū)分開來(圖3)。

圖3 野扇花葉片代謝產物偏最小二乘法判別分析Fig.3 Partial least squares discriminant analysis chart of metabolites in leaves of Sarcococca ruscifolia

與對照相比,夏季高溫條件下遮陰90%,野扇花葉片中氨基酸和糖類的總量顯著增加,分別比對照增加21.90%和46.79%(圖4)。

圖4 不同光照條件下野扇花葉片中有機酸、氨基酸、糖和糖醇的總相對含量Fig.4 Total relative contents of organic acid,amino acid,sugar and sugar alcohol of Sarcococca ruscifolia under different light conditions

與CK相比,在T1和T2條件下,分別有8種、2種(阿魏酸和延胡索酸)和14種,以及11種、3種(阿魏酸、延胡索酸和核糖酸)和10種有機酸含量無顯著變化、顯著增加和顯著下降。同樣,在T1和T2條件下,分別有16種、1種(丙氨酸)和5種,以及12種、5種和5種氨基酸含量未發(fā)生顯著變化、顯著增加和顯著下降(表2)。

糖是野扇花葉片中含量最豐富的代謝產物,在T1條件下,有10種、6種和13種糖的含量未發(fā)生顯著變化、顯著增加和顯著下降;在T2條件下,8種糖的含量未發(fā)生顯著變化,7種糖(包括阿拉伯呋喃糖、呋喃核糖、果糖、半乳糖、景天庚酮糖、熊果苷和呋喃果糖)的含量顯著增加,尤其是果糖和半乳糖含量的增加可能對T2條件下糖總量的增加發(fā)揮重要作用;另外,有13種糖含量顯著下降(表2)。

在T1和T2條件下,均有4種糖醇的含量沒有顯著變化,1種糖醇的含量顯著增加,7種糖醇的含量顯著下降。在T1和T2條件下,分別有8種、0種和1種胺(乙醇胺),以及4種、2種和3種胺的含量未發(fā)生顯著變化、顯著增加和顯著下降。在T1和T2條件下,磷酸(T1)和硼酸(T2)顯著增加,其他4種代謝產物的含量均未發(fā)生顯著變化(表2)。

2.2.2 遮陰條件下野扇花標志性代謝產物篩選

對代謝產物進行平均歸一化處理后,根據(jù)Pearson相關系數(shù)對代謝物進行聚類,獲得VIP前50位的代謝產物熱圖(圖5)。總體變化趨勢和PLS-DA分析結果(圖3)一致,遮陰后代謝產物積累發(fā)生顯著變化。景天庚酮糖等17個代謝產物的積累,可能和野扇花耐陰性極強有關。在這17個代謝產物中,變異權重系數(shù)大于1,與對照相比,差異顯著(P<0.05),且代謝產物含量變化超過1.5倍的,總共有9個,分別是延胡索酸、阿魏酸、丙氨酸、蘇氨酸、景天庚酮糖、半乳糖、呋喃核糖、果糖和尿嘧啶,這9種代謝產物可以作為野扇花耐陰候選標記物。在T1條件下,僅有景天庚酮糖和半乳糖的含量變化大于1.5。而在T2條件下,所有9種代謝產物的含量變化均大于1.5。說明,重度遮陰對代謝產物積累的影響更大。與對照相比,在兩種遮陰條件下含量變化最大的是景天庚酮糖(表3)。

表3 影響野扇花耐陰性的標志性代謝產物Table 3 Signature metabolites that influence shade tolerance of Sarcococca ruscifolia

圖5 不同光照條件下野扇花葉片代謝產物聚類后的熱圖Fig.5 Heat map with clustering of different metabolites in leaves of Sarcococca ruscifolia under different light conditions

3 討論

植物所處的光環(huán)境影響植物的光合作用。在不遮光條件下,野扇花葉片出現(xiàn)明顯的黃化現(xiàn)象,可能是強光條件下葉綠體的結構遭到破壞所致[9]。在蔭蔽增強的情況下,耐陰植物葉片中葉綠素總量顯著增加,有利于植株在弱光條件下更好的吸收、傳遞和轉化光能。Chl a∕b的比值表示在弱光條件下植物對光能的利用效率。遮陰條件下,野扇花Chl a和Chl b含量以及Chl a∕b的比例增加,表明野扇花植株在遮陰條件下,吸收紅光和藍紫光的能力增強,有利于光能的傳遞。遮陰條件下,野扇花葉片干物質含量的下降可能與弱光下葉片的光合作用下降有關。與遮陰相比,全光照下野扇花葉片的EL值顯著上升,這可能是遮陰降低了葉片的日灼所致?？扇苄缘鞍资欠磻参锷砉δ艿闹匾笜?在重度遮陰下野扇花葉片中可溶性蛋白含量增加可能和野扇花耐陰性極強有關。

本研究選擇出9個和野扇花耐陰性相關的代謝產物,這些化合物可能參與能量代謝、細胞骨架的形成以及滲透調節(jié)等?，F(xiàn)有的研究表明,景天庚酮糖的積累可能和胞間CO2濃度增加有關,在落地生根(Kalancho?pinnata)[20]和三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)[21]中均發(fā)現(xiàn)了由于CO2濃度增加導致的景天庚酮糖積累。Huang等[22]在對華北蹄蓋蕨(Athyrium pachyphlebium)的研究中發(fā)現(xiàn),隨著光量子通量密度下降,胞內CO2濃度(Intercellular CO2concentration,Ci)增加。在野扇花中,也發(fā)現(xiàn)了Ci的類似變化(結果未顯示)。景天庚酮糖是7-磷酸景天庚酮糖的代謝產物,在碳固定的途徑中發(fā)揮著重要作用[21],而關于景天庚酮糖含量變化和植物耐陰性的關系,還有待進一步分析。延胡索酸是三羧酸循環(huán)(Tricarboxylic acid cycle,TCA)的中間產物,細胞內環(huán)境的變化影響延胡索酸的積累。Biais等[23]發(fā)現(xiàn),低氧的環(huán)境有利于甜瓜(Cucumis melo)果實中延胡索酸的積累。Bekele等[24]也發(fā)現(xiàn),低氧和高CO2環(huán)境有利于延胡索酸的積累。

在干旱條件下,在擬南芥(Arabidopsis thaliana)[18]、馬鈴薯(Solanum tuberosum)[25]、雜交狗牙根(C ynodon dactylon×C.transvaalensis)[26]和抗冷的水稻(Oryza sativa)[27]中發(fā)現(xiàn)了半乳糖的積累。在長期高溫條件下,在雜交狗牙根葉片中也發(fā)現(xiàn)了半乳糖的積累[19]。半乳糖的積累可能和其他滲透調節(jié)物質的合成有關[27],而關于半乳糖的積累和植物耐陰性的關系,未見報道。蘇氨酸是一種芳香族氨基酸,可能也參與滲透調節(jié)[28-29]。在重度遮陰條件下,野扇花葉片中果糖的含量顯著增加。Li等[12]研究發(fā)現(xiàn),在蘋果發(fā)育前期,在蔭蔽條件下果糖的含量顯著高于光照條件下。果糖主要來自于蔗糖的分解。隨著光照強度的下降,葡萄糖含量無顯著變化,可能是因為蔗糖分解產生果糖和葡萄糖,而葡萄糖又分解釋放能量所致。

阿魏酸是一種酚酸,是木質素合成的中間產物[30]。Li等[12]研究表明,光照條件沒有顯著影響蘋果‘Jonamac’果皮中阿魏酸的含量。Ingersoll等[31]研究表明,與暗條件相比,在光下,山胡椒(Lindera benzoin)葉片中阿魏酸含量顯著增加。Solecka等[32]研究表明,低溫有利于冬油菜(Brassica napusvar.oleifera)葉片中阿魏酸的積累和苯丙氨酸解氨酶活性的增加,可減少細胞的過氧化傷害。而阿魏酸在野扇花耐陰方面的具體功能還有待進一步分析。相關研究表明,低氧脅迫條件下,如水淹,TCA循環(huán)的支路開啟,啟動了丙氨酸和γ-氨酸丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)活化,導致植物體中丙氨酸和GABA的富集。而在重度蔭蔽條件下,丙氨酸和GABA富集的原因還有待進一步分析。

野扇花是一種耐陰性很強的植物,本研究表明,野扇花的耐陰性可能和蔭蔽條件下光合色素的積累、葉片細胞膜完整性的增加以及重度蔭蔽下可溶性蛋白的積累有關。通過對關鍵代謝產物分析發(fā)現(xiàn),部分代謝產物的積累,尤其是景天庚酮糖和半乳糖,可能和野扇花的耐陰性有關。而關于是否是由于蔭蔽導致野扇花葉片中CO2濃度增加,進而誘導相關代謝產物的積累,從而增加了野扇花的耐陰性,還有待進一步分析。