基于SSR分子標(biāo)記的櫟屬植物資源的親緣關(guān)系分析

關(guān) 媛,呂秀立,于澤群,李秀芬,李水根,劉群錄3,朱建軍

(1上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹(shù)研究所,上海 201403;2上海市園林科學(xué)規(guī)劃研究院,上海 200232;3上海交通大學(xué)設(shè)計(jì)學(xué)院,上海 200240)

櫟屬植物(QuercusL.)是殼斗科(Fagaceae)櫟屬(Quercus)重要樹(shù)種,為落葉或常綠喬木,也是少數(shù)幾個(gè)基因組已經(jīng)測(cè)序的模式樹(shù)種[1]。櫟屬有400個(gè)種,主要分布在北美洲、歐洲、亞洲和北非[2],我國(guó)有110余種,各地均有分布。狹義的櫟屬即定義的櫟亞屬,全世界約有300種,中國(guó)有51個(gè)種、14個(gè)變種和1個(gè)變型[3]。櫟樹(shù)在木材、工業(yè)原料、環(huán)境綠化和生態(tài)修復(fù)等方面具有重要價(jià)值[4-6]。樹(shù)皮可藥用,栓皮櫟的樹(shù)皮可做紅酒的軟木塞;木材質(zhì)量很好,是家具、地板、農(nóng)具、車(chē)輛等的優(yōu)良用材。此外,櫟樹(shù)也是水源涵養(yǎng)和水土保持林的良好樹(shù)種,并對(duì)有害氣體及逆境具有高度抗性,可作為園林綠化樹(shù)種。近年來(lái),隨著城市綠化品質(zhì)的提高,上海市相繼引入耐鹽堿、耐水濕的弗吉尼亞櫟(Quercus virginiana)、沼生櫟(Quercus palustris)、納塔櫟(Quercus nuttallii)等,沼生櫟和納塔櫟等在秋季葉色變紅,緩解了香樟和廣玉蘭等景觀(guān)樹(shù)種單一的問(wèn)題[7-8]。最重要的是城市綠化引種高大喬木,將充實(shí)綠地群落的上層骨干樹(shù)種,增加群落的生物多樣性,極大地豐富園林景觀(guān)[9]。

SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有共顯性、易于操作、重復(fù)性好的特點(diǎn),已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于許多林木的遺傳多樣性研究[10-14]。本研究利用篩選的SSR標(biāo)記對(duì)櫟屬4個(gè)種24個(gè)單株進(jìn)行遺傳多樣性分析,以期為該物種的資源利用及引種評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 植物材料

從中國(guó)江蘇和美國(guó)不同地區(qū)引進(jìn)4個(gè)種櫟屬植物,共100份種質(zhì)資源,播種在上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林木果樹(shù)研究所苗圃?xún)?nèi),生長(zhǎng)6個(gè)月后,根據(jù)表型選取24份櫟屬植物種質(zhì)資源進(jìn)行分析。分別是來(lái)自中國(guó)江蘇的麻櫟(Quercus acutissima),編號(hào)為Qa-1—Qa-8;美國(guó)佛羅里達(dá)州的墨西哥白橡(Quercus polymorpha),編號(hào)為Qp-1—Qp-8;弗吉尼亞櫟(Quercus Virginiana),編號(hào)為Qv-1—Qv-4;來(lái)自美國(guó)俄勒岡州的沼生櫟(Quercus palustris),編號(hào)為Qpa-1—Qpa-4。每份材料取新鮮嫩葉,存于-70℃超低溫冰箱中待用。

1.2 基因組DNA的提取

采用CTAB法[15]提取櫟屬植物基因組DNA,改良后的方法如下:取100 mg櫟樹(shù)葉片,放入2 mL離心管中,加入鋼珠,在液氮中速凍后在研磨儀上研磨。研磨完全后加入改良的CTAB溶液[2%CTAB,100 mmol Tris-HCl(pH 8.0),20 mmol EDTA,1.4 mol NaCl,2%PVP,1%β-巰基乙醇],充分混勻,65℃水浴20 min。加入等體積的氯仿∕異戊醇(24∕1,V∕V),充分混勻后12 000 r∕min、4℃離心10 min,將上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中。加入等體積預(yù)冷的異丙醇,混勻,12 000 r∕min、4℃離心10 min,倒掉上層溶液,在有DNA沉淀的離心管中加入500μL 70%乙醇,搖晃兩下,然后12 000 r∕min 4℃離心5 min,倒掉廢液,將離心管干燥10 min以上,加入包含RNase的滅菌水(990μL滅菌水加上10μL RNase)50μL,溶解后,用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA完整性,并用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA的濃度和純度。-20℃冰箱保存待用。

1.3 SSR標(biāo)記分析

PCR反應(yīng)體系為:基因組DNA 30 ng,0.5μmol引物,200μmol dNTPs,2 mmol MgCl2,1×Taq buffer、1 U Taq DNA聚合酶,總反應(yīng)體系為20μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,51.5—55℃退火45 s,72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min;4℃保存擴(kuò)增產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物先用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),篩選出有特異性條帶的PCR產(chǎn)物,再用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,恒定電壓200 V,電泳2 h。電泳結(jié)束后銀染,用相機(jī)成像保存。SSR引物序列參照Hardwood Genomics Project(https:∕∕www.hardwoodgenomics.org∕organism∕Quercus∕alba)網(wǎng)站序列,由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物信息見(jiàn)表1。

表1 SSR分析所用的引物序列Table 1 The sequences of primers used in SSR analysis

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

根據(jù)分子量大小對(duì)各引物擴(kuò)增出的等位基因進(jìn)行排序,在電泳圖譜上清晰且可重復(fù)出現(xiàn)的條帶記為“1”,同一位置沒(méi)有條帶的記為“0”,建立0∕1矩陣。用NTSYS-pc 2.1軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù),獲得相似系數(shù)矩陣。以非加權(quán)類(lèi)平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類(lèi)分析,構(gòu)建樹(shù)狀聚類(lèi)圖。采用PopGENE 32軟件計(jì)算等位基因數(shù)、有效等位基因數(shù)、Shannon多樣性指數(shù)、Nei基因多樣性指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記的多態(tài)性分析

用24份不同種的櫟屬植物資源基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果顯示從44對(duì)SSR引物中篩選出13對(duì)擴(kuò)增片段清晰的引物,如圖1所示,利用引物20458對(duì)24份櫟屬植物材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)可獲得清晰的條帶,并且不同材料擴(kuò)增的片段大小不同。為了更好地檢測(cè)不同材料的等位基因,利用非變性聚丙烯酰胺凝膠檢測(cè)片段的差異,其中9對(duì)多態(tài)性引物擴(kuò)增結(jié)果可用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。這9對(duì)引物在24份材料中共檢測(cè)到62個(gè)等位基因變異,每對(duì)引物檢測(cè)到的等位基因變異范圍為4—12個(gè),平均每對(duì)引物檢測(cè)到6.9個(gè)等位基因。其中引物46284檢測(cè)到的等位基因最多,為12個(gè)。如圖2所示,引物38169對(duì)24份櫟屬植物樣品擴(kuò)增出的條帶介于100—150 bp。各位點(diǎn)的平均有效等位基因?yàn)?.96,Nei多樣性指數(shù)分布范圍在0.628 5—0.891 5,平均每個(gè)位點(diǎn)為0.758 6,Shannon信息指數(shù)分布范圍為1.184 3—2.336 7,平均每個(gè)位點(diǎn)為1.635 7(表2)。

表2 24份櫟屬植物材料的遺傳多樣性Table 2 The genetic diversity of the 24 Quercus resources

圖1 SSR引物20458擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The amplification results of primer 20458

圖2 SSR引物38169的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The amplification results of primer 38169

2.2 SSR標(biāo)記的聚類(lèi)分析

由圖3所示,24份種質(zhì)資源間遺傳相似系數(shù)的平均值為0.700 8,變化范圍為0.492 8—0.971 0,其中Qpa-4和Qp-1遺傳相似系數(shù)最低。聚類(lèi)結(jié)果顯示,在遺傳相似系數(shù)0.65處,引種的櫟屬資源可以分為兩大類(lèi),第Ⅰ類(lèi)為中國(guó)江蘇收集的麻櫟,第Ⅱ類(lèi)為美國(guó)收集的3個(gè)種的引種資源,其中沼生櫟和弗吉尼亞櫟聚為一類(lèi),墨西哥白橡單獨(dú)聚為一類(lèi)(圖4)。在遺傳相似系數(shù)0.82處,24個(gè)櫟屬資源可以清晰的分成四類(lèi)。其中弗吉尼亞櫟的Qv-2和Qv-3、墨西哥白橡的Qp-5和Qp-8遺傳相似系數(shù)最高,為0.971 0。SSR標(biāo)記的聚類(lèi)結(jié)果和不同種的植物分類(lèi)學(xué)結(jié)果基本一致,可以很好的將不同種的櫟屬資源劃分開(kāi)。

圖3 24份櫟屬植物資源遺傳相似系數(shù)Fig.3 The genetic similarity co-efficient of the 24 Quercus resources

圖4 24份櫟屬植物資源SSR聚類(lèi)分析Fig.4 The clustering map of the 24 Quercus resources by SSR markers

3 結(jié)論與討論

SSR分子標(biāo)記具有共顯性、擴(kuò)增穩(wěn)定、重復(fù)性好的特點(diǎn),是常用的遺傳多樣性分析方法之一,但利用SSR標(biāo)記對(duì)櫟屬植物進(jìn)行遺傳多樣性分析的研究較少。徐小林等[16]利用16對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)我國(guó)栓皮櫟天然群體進(jìn)行遺傳多樣性分析,發(fā)現(xiàn)平均等位基因數(shù)為8.43個(gè),有效等位基因數(shù)平均為5.95個(gè),平均Nei多樣性指數(shù)為0.804 1,Shannon信息指數(shù)為1.830 8。秦英英等[17]利用11對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)遼東櫟天然群體進(jìn)行遺傳多樣性分析,發(fā)現(xiàn)平均等位基因數(shù)為10.27個(gè),有效等位基因數(shù)平均為5.19個(gè),平均Nei多樣性指數(shù)為0.752 1,Shannon信息指數(shù)為1.754 3。本研究中,9對(duì)SSR引物在24份材料中檢測(cè)到平均等位基因數(shù)為6.9個(gè),平均有效等位基因?yàn)?.96,平均Nei多樣性指數(shù)為0.758 6,Shannon信息指數(shù)為1.635 7,說(shuō)明不同種的櫟屬植物遺傳多樣性水平較高,差異較大。本研究中,平均等位基因數(shù)、平均Shannon信息指數(shù)、平均Nei多樣性指數(shù)都略低于以往的研究結(jié)果,推測(cè)是因?yàn)檠芯坎牧喜煌隆?/p>

對(duì)櫟屬植物天然群體來(lái)說(shuō),較高的遺傳多樣性水平是保持群體穩(wěn)定的基礎(chǔ)。魏高明[18]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)蘇浙皖地區(qū)的4個(gè)櫟屬樹(shù)種,共300個(gè)個(gè)體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)與遺傳變異研究,結(jié)果顯示4個(gè)樹(shù)種不僅存在較高的遺傳多樣性,而且普遍具有基因漸滲現(xiàn)象。郭斌[19]利用9對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)遼東櫟、蒙古櫟、北美紅櫟和猩紅櫟進(jìn)行聚類(lèi)分析,發(fā)現(xiàn)北美紅櫟和猩紅櫟聚為一類(lèi),為一個(gè)混合組,這是因?yàn)闄祵僦参餅轱L(fēng)媒異交,花粉具有很強(qiáng)的長(zhǎng)距離傳播能力,種子傳播能力也很強(qiáng),因此櫟屬植物在自然狀態(tài)下,種之間界限模糊,種間雜交或漸滲情況頻繁。麻櫟是中國(guó)主要的櫟屬樹(shù)種,廣泛分布于全國(guó)各地,本研究中,麻櫟單獨(dú)聚為一類(lèi),而引種自美國(guó)的3個(gè)樹(shù)種聚為一大類(lèi),這和引種母株的地理分布有關(guān)。其中,弗羅里達(dá)州的墨西哥白橡單獨(dú)聚為一亞類(lèi),弗吉尼亞櫟和沼生櫟聚為一亞類(lèi),這兩種櫟在秋季葉片變紅,而墨西哥白橡沒(méi)有這樣的性狀,與形態(tài)學(xué)結(jié)果相似。弗吉尼亞櫟在美國(guó)東南部分布較廣,為美國(guó)櫟屬植物的重要代表,它和沼生櫟生長(zhǎng)習(xí)性及表型差異很大,推測(cè)兩個(gè)樹(shù)種之間有基因漸滲現(xiàn)象[20]。本研究中,有2份墨西哥白橡和2份弗吉尼亞櫟聚類(lèi)分析沒(méi)有分開(kāi),推測(cè)是因?yàn)椴捎玫姆肿訕?biāo)記數(shù)量不足所致。

我國(guó)對(duì)櫟屬植物的引種歷史悠久,引入中國(guó)的櫟類(lèi)樹(shù)種大約20余種,在長(zhǎng)三角地區(qū)優(yōu)選了5種北美櫟樹(shù),這些主要集中用于引種試驗(yàn)研究[21]。而對(duì)這些引種樹(shù)種進(jìn)行鑒定、遺傳多樣性評(píng)價(jià)的研究還很少。本研究結(jié)果表明,在上海引種的4種櫟屬植物的遺傳多樣性較高,利用SSR分子標(biāo)記用于分析櫟屬植物種間的親緣關(guān)系,方法簡(jiǎn)單,結(jié)果可靠,研究結(jié)果可為櫟屬植物引種管理、鑒定、保護(hù)及評(píng)價(jià)提供重要依據(jù)。引種群體是由種子繁殖而來(lái),所以種內(nèi)差異較小,用SSR標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行種內(nèi)資源關(guān)系鑒定,還需要更多的有效引物。