茄子SmCOL5基因在花青素生物合成中的功能分析

胡藝偉,李大露,席浩淳,何永軍,陳火英,劉 楊

(上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院,上海 200240)

花青素是一種天然的類(lèi)黃酮水溶性色素,在自然界中廣泛分布,目前已知有近30個(gè)科的被子植物中含有花青素[1]。花青素具有卓越的抗氧化性,其抗氧化機(jī)制是清除自由基,以避免過(guò)多的自由基對(duì)機(jī)體造成損害[2]。此外,花青素還具有抵御癌癥、降低血糖等生理功能[3-4]。茄子是少有的紫色蔬菜,其果肉營(yíng)養(yǎng)豐富,含有可溶性糖、脂肪、蛋白質(zhì)、維生素及鐵、磷等多種營(yíng)養(yǎng)成分。茄子果皮中含有豐富的花青素,茄子中花青素的抗氧化性效果比常見(jiàn)蔬菜作物所含的花青素更佳[5],是人類(lèi)補(bǔ)充天然花青素的優(yōu)質(zhì)來(lái)源。提高茄子果皮中的花青素含量,可有效提高茄子的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和商品價(jià)值。

花青素生物合成途徑網(wǎng)絡(luò)由上游的調(diào)控基因和下游的結(jié)構(gòu)基因構(gòu)成,苯丙氨酸經(jīng)過(guò)多步反應(yīng)轉(zhuǎn)化成穩(wěn)定的花青素[6],該途徑重要的結(jié)構(gòu)基因包括查爾酮合成酶基因(C HS)和黃烷酮3-羥化酶基因(F3H)等。已有研究證明,SmCHS基因和SmF3H基因在茄子花青素生物合成中具有促進(jìn)作用[7]。目前對(duì)花青素生物合成途徑上游調(diào)控基因的研究中,由MYB轉(zhuǎn)錄因子、bHLH轉(zhuǎn)錄因子和WD40蛋白組合成的MBW復(fù)合體居多,也較為深入。MYB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子分為多種類(lèi)別,其中與花青素合成關(guān)系最為密切的是R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子。研究表明,GmMYB042基因過(guò)表達(dá)的煙草植株中,總黃酮量顯著升高,其類(lèi)黃酮代謝途徑中的多個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)量增加[8]。在茄子中,SmMYB1轉(zhuǎn)錄因子可與花青素合成關(guān)鍵酶基因CHS和DFR的啟動(dòng)子結(jié)合,促進(jìn)花青素合成;COP1是E3泛素連接酶組成的光形態(tài)建成基因,其被認(rèn)為是一種分子開(kāi)關(guān),調(diào)控植物的光調(diào)控發(fā)育[9];SmCOL4蛋白和SmCOL5蛋白都是BBX轉(zhuǎn)錄因子。BBX轉(zhuǎn)錄因子屬于鋅指結(jié)構(gòu)蛋白家族,在其氨基酸序列中,具有1—2個(gè)B-box基序[10],BBX轉(zhuǎn)錄因子參與植物的許多生理活動(dòng),如植物的光形態(tài)建成、成花過(guò)程、響應(yīng)生物與非生物脅迫以及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。研究表明,水稻中的BBX蛋白OsCOL15可以通過(guò)上調(diào)OsGHD7基因或者下調(diào)OsR ID1基因的表達(dá)影響水稻開(kāi)花[11];在蘋(píng)果中,MdCOL11蛋白為光形態(tài)建成的正向調(diào)控因子,其過(guò)表達(dá)植株下胚軸顯著短于野生型,并且花青素含量顯著增多,說(shuō)明部分BBX類(lèi)基因也參與調(diào)控植物花青素的生物合成途徑[12]。本研究通過(guò)亞細(xì)胞定位、酵母雙雜交、酵母單雜交等方法,探究茄子中的目的基因SmCOL5與光調(diào)控和花青素合成相關(guān)基因的互作情況,以期為提高茄子花青素含量,選育優(yōu)質(zhì)茄子品種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為實(shí)驗(yàn)室保存的茄子種質(zhì)資源‘藍(lán)山禾線(xiàn)’和FGM。‘藍(lán)山禾線(xiàn)’為光敏感型茄子,在正常光照條件下生長(zhǎng)時(shí),其果皮呈現(xiàn)紫色,在套袋遮光條件下生長(zhǎng)則呈現(xiàn)白色。FGM為非光敏型茄子,在正常光照和套袋遮光條件下果皮均呈現(xiàn)紫色。試驗(yàn)中使用到的大腸桿菌DH5α由北京全式金生物技術(shù)有限公司提供;釀酒酵母AH109和根癌農(nóng)桿菌GV3101由上海唯地生物技術(shù)公司提供。

1.2 SmCOL5基因的克隆及表達(dá)模式分析

首先對(duì)茄子的部分基因進(jìn)行光響應(yīng)表達(dá)模式分析,通過(guò)比較后選取SmCOL5基因作為研究對(duì)象。在茄子基因庫(kù)網(wǎng)站(http:∕∕eggplant.kazusa.or.jp∕)中獲取SmCOL5基因(Sme2.5_25 982.1_g00 001.1)的序列,使用軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)引物SmCOL5-F、SmCOL5-R(表1),并委托生工生物工程(上海)公司合成引物。使用日本TaKaRa公司的植物RNA提取試劑盒提取生長(zhǎng)5個(gè)月的‘藍(lán)山禾線(xiàn)’茄子植株根、葉、莖、花和果皮樣品的RNA,采用瓊脂糖電泳和美國(guó)Thermo Fisher公司的NanoDrop超微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA質(zhì)量與濃度。使用日本TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RTMaster Mix合成cDNA,以cDNA為模板擴(kuò)增SmCOL5基因,再以茄子各組織的cDNA為模板,采用qRT-PCR手段通過(guò)引物qRTCOL5-F、qRTCOL5-R(表1)擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)片段并進(jìn)行熒光檢測(cè),以得到SmCOL5基因的表達(dá)量?；蚩寺CR反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,60℃退火30 s,72℃延伸20 s,35個(gè)循環(huán);6℃保存。qRT-PCR的反應(yīng)程序?yàn)?95℃預(yù)變性30 s;95℃變性5 s,55℃退火30 s,72℃延伸30 s,45個(gè)循環(huán);溶解曲線(xiàn)分析95℃,10 s;65℃,60 s;97℃,1 s。

表1 試驗(yàn)所用引物Table 1 Primers used in the test

1.3 基因及其編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

所用到的氨基酸序列下載自NCBI網(wǎng)站。利用ExPASy網(wǎng)站(http:∕∕web.expasy.org∕compute_pi∕)預(yù)測(cè)SmCOL5蛋白的分子量和理論等電點(diǎn)。利用EMBL-EBI(https:∕∕pfam.xfam.org∕search∕sequence)對(duì)其結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4 SmCOL5蛋白的亞細(xì)胞定位

設(shè)計(jì)帶有相關(guān)同源臂的目的基因的引物,使用日本TaKaRa公司的Prime STARMix試劑盒以cDNA為模板擴(kuò)增目的片段,使用日本TaKaRa公司的In-Fusion HD Cloning Kit試劑盒對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的PHB-YFP載體進(jìn)行酶切,YFP在特定條件下可以激發(fā)出黃色熒光,可用于檢測(cè)與其相連的片段在何處表達(dá)。將目的片段用同源重組的方法連接到剪切過(guò)的PHB-YFP載體上,將適量上述質(zhì)粒與GV3101農(nóng)桿菌液混勻,依次進(jìn)行冰浴、浸液氮、37℃金屬浴、冰浴,將所得菌液置于搖床培養(yǎng),再采用涂布平板法培養(yǎng)獲得單克隆,挑取單克隆置于含有Rifampicin的培養(yǎng)基中篩選,即可得到帶有目的基因片段的農(nóng)桿菌,將菌株在28℃條件下于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至適當(dāng)濃度,然后將菌株懸浮于MS緩沖液中(含有10 mmol∕L MgCl2和10 mmol∕L MES的100 mL MS懸浮液,pH 5.8),黑暗條件下靜置2 h后選取生長(zhǎng)1個(gè)月的幼嫩煙草葉片,用摘下針頭的1 mL注射器將重組組懸浮液和僅含PHB-YFP載體的懸浮液從葉片背部緩緩注入葉片。2—3 d后使用TCSSP5-II激光共聚焦顯微鏡(Leica,德國(guó))檢測(cè)細(xì)胞中的YFP信號(hào)。

1.5 酵母雙雜交試驗(yàn)

設(shè)計(jì)帶有相關(guān)同源臂的目的基因SmCOL5和SmCOP1的引物,使用日本TaKaRa公司的Prime STARMix試劑盒以茄子cDNA為模板擴(kuò)增目的基因片段,將SmCOL5片段用同源重組的方法連接到pGADT7載體上,形成SmCOL5-AD重組體,將SmC OP1基因片段連接到pGBKT7載體上形成SmCOP1-BD重組體。將構(gòu)建好的帶有SmCOL5基因的質(zhì)粒與帶有SmCOP1基因的質(zhì)粒混合,同時(shí)設(shè)置對(duì)照(SmCOL5-AD×BD和SmCOP1-BD×AD),共轉(zhuǎn)化MATα型AH109酵母感受態(tài)細(xì)胞。將轉(zhuǎn)化后的酵母菌置于SD-Leu-Trp固體培養(yǎng)基(二缺板)中培養(yǎng),2 d后挑取單克隆懸浮后滴于SD-Leu-Trp-His固體培養(yǎng)基(三缺板)、SD-Leu-Trp-His-Ade固體培養(yǎng)基(四缺板)上培養(yǎng),觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.6 酵母單雜交試驗(yàn)

設(shè)計(jì)帶有相關(guān)同源臂的目的基因SmCOL5和結(jié)構(gòu)基因SmF3H、SmCHS啟動(dòng)子的引物,使用日本TaKaRa公司的Prime STARMix試劑盒以茄子cDNA為模板擴(kuò)增目的基因片段,將目的片段用同源重組的方法連接到pB42AD載體上,以茄子DNA為模板擴(kuò)增結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子序列,啟動(dòng)子片段連接到實(shí)驗(yàn)室保存的pLacZi載體上。這是一種含有PCYC1啟動(dòng)子和LacZ基因的載體,當(dāng)上游的PCYC1被激活后,促使LacZ基因表達(dá),在X-Gal環(huán)境下,使酵母細(xì)胞呈現(xiàn)藍(lán)色。將構(gòu)建好的帶有SmCOL5基因的質(zhì)粒與帶有結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子片段的質(zhì)粒分別混合,同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(Pb42AD-SmCOL5×pLacZi、Pb42AD×pLacZi-SmF3H、Pb42AD×pLacZi-SmCHS以及Pb42AD×pLacZi),然后共轉(zhuǎn)化MATα型EGY48酵母感受態(tài)細(xì)胞,并于SD-TU培養(yǎng)基中培養(yǎng)。2—3 d后挑取單克隆懸浮后滴于含有X-Gal的定性培養(yǎng)基上培養(yǎng),觀察菌落顏色。

2 結(jié)果與分析

2.1 SmCOL5蛋白的生物信息學(xué)分析、組織特異性表達(dá)及亞細(xì)胞定位

光響應(yīng)表達(dá)模式分析表明(圖1),光敏型茄子‘藍(lán)山禾線(xiàn)’中SmCOL5蛋白的表達(dá)量在茄子開(kāi)袋后隨光照的變化而變化,其表達(dá)量在4 h時(shí)達(dá)到最高,而SmCOL5蛋白在非光敏型茄子FGM中的表達(dá)量相對(duì)較低,且變化不明顯,說(shuō)明SmCOL5蛋白在茄子中的表達(dá)由光照誘導(dǎo)。

圖1 SmCOL5蛋白在光敏型茄子(‘藍(lán)山禾線(xiàn)’)和非光敏型茄子(FGM)中的表達(dá)量變化Fig.1 Expression changes of SmCOL5 protein in photosensitive eggplant(‘Lanshanhexian’)and non photosensitive eggplant(FGM)

生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn),SmCOL5基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為1 161 bp,編碼386個(gè)氨基酸;經(jīng)ExPASy網(wǎng)站預(yù)測(cè)可知,其蛋白分子量為42.48 ku,理論等電點(diǎn)為5.95;Prabi在線(xiàn)預(yù)測(cè)表明,SmCOL5蛋白由56.72%無(wú)規(guī)則卷曲、32.13%α-螺旋、8.85%延伸連和2.30%β-折疊組成。

以成熟茄子的根、莖、葉、花和果皮的cDNA作為模板,通過(guò)qRT-PCR進(jìn)行組織表達(dá)特異性分析,發(fā)現(xiàn)SmCOL5蛋白在根、莖、葉、花和果皮中均有表達(dá),在葉中的表達(dá)量最高,在根中的表達(dá)量最低(圖2)。

圖2 SmCOL5蛋白在茄子不同器官中的表達(dá)量Fig.2 Expression of SmCOL5 protein in different organs of eggplant

為了明確目的基因在細(xì)胞中的表達(dá)情況,將含有PHB-SmCOL5-YFP載體的懸浮液注射于幼嫩煙草葉片的表皮細(xì)胞,以含有PHB-YFP載體的懸浮液作為對(duì)照,用激光共聚焦顯微鏡觀察,發(fā)現(xiàn)注射了重組組懸浮液的葉片細(xì)胞核發(fā)出黃色熒光,而對(duì)照組葉片的細(xì)胞質(zhì)膜和核內(nèi)均檢測(cè)到黃色熒光,表明SmCOL5蛋白定位于細(xì)胞核中(圖3)。

圖3 SmCOL5蛋白在煙草葉片中的亞細(xì)胞定位Fig.3 Subcellular localization of SmCOL5 protein in tobacco leaves

2.2 SmCOL5蛋白與SmCOP1蛋白互作

酵母雙雜交試驗(yàn)結(jié)果表明,帶有pGADT7-SmCOL5與pGBKT7-SmCOP1質(zhì)粒的酵母在三缺板上可正常生長(zhǎng),在四缺板上也長(zhǎng)出了類(lèi)似單克隆的菌斑,而對(duì)照組((SmCOL5-AD×BD和SmCOP1-BD×AD)不論在三缺板還是四缺板上都不能正常生長(zhǎng)(圖4),說(shuō)明SmCOL5蛋白能與SmCOP1蛋白在酵母中互作,即SmCOL5轉(zhuǎn)錄因子功能受到SmCOP1蛋白的影響,參與到植物的光響應(yīng)生理活動(dòng)中。

圖4 SmCOL5蛋白與SmCOP1蛋白酵母雙雜交結(jié)果Fig.4 Yeast two-hybrid results of SmCOL5 protein with SmCOP1 protein

2.3 SmCOL5蛋白與SmF3 H、SmCHS基因的啟動(dòng)子結(jié)合

在酵母單雜交試驗(yàn)中,若調(diào)控基因可與結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子結(jié)合,則共轉(zhuǎn)化酵母菌菌落將呈現(xiàn)藍(lán)色,而對(duì)照仍呈現(xiàn)白色。如圖5所示,SmCOL5蛋白與SmF3H、SmCHS基因啟動(dòng)子混合的菌體均呈現(xiàn)藍(lán)色,而對(duì)照組(Pb42AD-SmCOL5×pLacZi、Pb42AD×pLacZi-SmF3H、Pb42AD×pLacZi-SmCHS以及Pb42AD×pLacZi)全部呈現(xiàn)白色,說(shuō)明SmCOL5蛋白可與SmF3H、SmCHS基因的啟動(dòng)子結(jié)合,推測(cè)SmCOL5蛋白可能對(duì)這2個(gè)結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控,即SmCOL5蛋白可以參與花青素生物合成的調(diào)節(jié)。

圖5 SmCOL5蛋白與SmF3 H、SmCHS基因啟動(dòng)子的酵母單雜交試驗(yàn)Fig.5 Yeast one-hybrid assay of SmCOL5 protein with promoters of SmF3 H and SmCHS genes

3 討論

BBX基因家族作為植物王國(guó)中重要的轉(zhuǎn)錄因子家族,其基因功能研究主要集中在擬南芥、水稻和蘋(píng)果等作物上,研究?jī)?nèi)容主要包括植物光形態(tài)建成、植物抗性和開(kāi)花等方面。隨著各界對(duì)花青素的關(guān)注度日益提高,BBX家族基因影響花青素累積的研究也逐漸增多。在擬南芥中已知的BBX家族基因?qū)ㄇ嗨乩鄯e有影響,如AtBBX21基因參與擬南芥的UV-B光形態(tài)建成,低劑量、長(zhǎng)波長(zhǎng)的UV-B能誘導(dǎo)植物的花青素累積[13];而在蘋(píng)果中,MdBBX20和MdBBX24基因能響應(yīng)UV-B和溫度的變化,調(diào)控蘋(píng)果中花青素的累積,從而影響蘋(píng)果著色[14];在水稻中,OsBBX14基因可以正調(diào)控花青素的生物合成[15]。關(guān)于BBX家族基因的研究在其他植物中已經(jīng)較為常見(jiàn),但在茄子中卻鮮有研究。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),茄子SmCOL5基因的表達(dá)量變化與光照量相關(guān)聯(lián),由此可以初步確定其與植物的光形態(tài)建成相關(guān),且SmCOL5蛋白可與SmCOP1蛋白互作,并結(jié)合下游調(diào)控花青素生物合成的結(jié)構(gòu)基因啟動(dòng)子,從而可能參與調(diào)控茄子中的花青素生物合成途徑。如前述研究,在蘋(píng)果的花青素生物合成中,MdBBX20蛋白能特異性識(shí)別下游的MdANS基因的啟動(dòng)子,并促進(jìn)其表達(dá),這一調(diào)控機(jī)理與本試驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似。此外,MdBBX37蛋白可與MdMYBs蛋白和MdHY5蛋白互作,共同影響花青素的生物合成[16],這也為研究SmC OL5基因在茄子花青素合成調(diào)控中的作用提供了更多的理論依據(jù)和方法參照。

為了進(jìn)一步確定SmC OL5基因參與調(diào)控茄子花青素生物合成的機(jī)理,后續(xù)將通過(guò)設(shè)計(jì)雙熒光素酶報(bào)告、瞬時(shí)過(guò)表達(dá)、穩(wěn)定過(guò)表達(dá)等試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證SmCOL5基因的功能,完善茄子花青素合成調(diào)控網(wǎng)絡(luò),從而為育成更高花青素含量的茄子奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。