家蠶β-呋喃果糖苷酶基因BmSuc1表達特征及其對激素的響應

楊偉克 唐芬芬 劉增虎 董占鵬

摘要：【目的】探究BmSuc1基因在家蠶不同組織及不同時期的表達特征及經(jīng)昆蟲激素處理后的表達變化規(guī)律，明確昆蟲激素對BmSuc1基因的調(diào)控作用，為深入解析BmSuc1基因的功能及其表達調(diào)控機制提供參考依據(jù)。【方法】利用實時熒光定量PCR檢測BmSuc1基因在家蠶發(fā)育過程中不同時期和不同組織及外源激素處理后的表達特征，并通過雙鏈RNA（dsRNA）干擾試驗檢測家蠶20-羥基蛻皮素（20E）受體基因（USP）干擾效果及BmSuc1基因的表達變化?！窘Y(jié)果】BmSuc1基因在家蠶中腸中的相對表達量最高，其次是絲腺、表皮和血淋巴，在其他組織中的相對表達量很低或幾乎不表達;BmSuc1基因呈脈沖型的表達模式，在家蠶每個齡期的將眠時、五齡后期（上簇前）及預蛹時的相對表達量較高。利用外源激素[20E和保幼激素（JH）]分別處理五齡第2 d發(fā)育良好的家蠶，發(fā)現(xiàn)經(jīng)20E處理后12和18 h，BmSuc1基因相對表達量極顯著高于注射0.1%二甲基亞砜（DMSO）的對照組（Ρ<0.01，下同），但在測定時間范圍內(nèi)JH處理組的BmSuc1基因相對表達量與對照組間無顯著差異（Ρ>0.05）。以體外轉(zhuǎn)錄合成USP基因的dsRNA注射五齡第3 d家蠶，注射后24和36 h，USP基因相對表達量極顯著下調(diào)，即dsRNA干擾成功。利用RNAi技術(shù)干擾USP基因能阻斷20E信號轉(zhuǎn)導，致使BmSuc1基因表達受抑制，其相對表達量在干擾USP基因后24和36 h顯著下調(diào)（Ρ<0.05）?！窘Y(jié)論】BmSuc1基因主要在家蠶蛻皮和變態(tài)時高表達，暗示其可能參與家蠶的變態(tài)發(fā)育過程。添加外源20E可誘導BmSuc1基因轉(zhuǎn)錄，而阻斷20E信號轉(zhuǎn)導途徑會抑制BmSuc1基因表達，即BmSuc1基因作為20E信號轉(zhuǎn)導通路中的下游靶基因，直接或間接受到20E信號調(diào)控。

關(guān)鍵詞： 家蠶;β-呋喃果糖苷酶;BmSuc1基因;20-羥基蛻皮素;保幼激素;表達特征

中圖分類號： S881.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）07-1991-07

Expression profiles and response to exogenous hormones of β-fructofuranosidase gene BmSuc1 in silkworm（Bombyx mori）

YANG Wei-ke1， TANG Fen-fen2， LIU Zeng-hu1， DONG Zhan-peng1*

（1 Sericulture and Apiculture Research Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Mengzi， Yunnan? 661101， China;2 College of Life Science and Technology， Honghe University， Mengzi， Yunnan? 661101， China）

Abstract：【Objective】In order to clarify the regulatory effects of insect hormones on the expression of BmSuc1 and provide a reference for further analysis of the function and expression regulation mechanism of BmSuc1， this study explored the expression profiles of BmSuc1 in different tissues and periods of silkworm and the expression changes of BmSuc1 after treatment with exogenous hormones. 【Method】By using real-time fluorescence quantitative PCR technology， the expression characteristics of BmSuc1 were detected in different periods， different tissues and after treatment with ex-ogenous hormones during the development of silkworm larvae. The expression of BmSuc1 and 20E receptor gene USP were detected after RNA interference with double-stranded RNA（dsRNA） of USP. 【Result】The relative expression of BmSuc1 gene in midgut was the highest， followed by silk glands， epidermis and hemolymph. However， there was much lower or almost no expression in other tissues. In addition， the BmSuc1 expression profile exhibited a pulse-like pattern in silkworm larvae， the expression level of BmSuc1 was higher at each instar stage before molting， late fifth instar before cocooning and prepupal stage. The day 2 of fifth-instar silkworm larvae were treated with 20-hydroxyecdysone（20E） and juvenile hormone（JH）， it was found that the expression of BmSuc1 was extremely significantly higher at 12 and 18 h after 20E treatment than the control group injected with 0.1% dimethyl sulfoxide（DMSO）（P<0.01， the same below）. But there were no significant difference of the BmSuc1 expression between the JH treatment and the control group during the measurement time range（P>0.05）. The dsRNA of USP was synthesized in vitro and injected into silkworm larvae at day 3 of the fifth instar. It was showed that the USP relative expression were extremely significantly down-regulated at 24 and 36 h after injection， which indicated that dsRNA interference was successful. RNAi of USP would block 20E signal transduction， and the expression of BmSuc1 was inhibited and significantly down-regulated at 24 and 36 h after injection of dsRNA of USP（P<0.05）. 【Conclusion】The BmSuc1 expression peaks appear in the molting of silkworm larvae and the metamorphosis of larvae to pupae， which suggests that BmSuc1 may be involved in the metamorphic development process of the silkworm. Treatment with exogenous ecdysone 20E can activate the expression of BmSuc1， but blocking the 20E signal transduction pathway may suppress expression of BmSuc1. It indicates that BmSuc1 as a downstream target gene in 20E signal transduction pathway is directly or indirectly regulated by 20E signal.

Key words： Bombyx mori; β-fructofuranosidase; BmSuc1; 20-hydroxyecdysone; juvenile hormone; expression characteristics

Foundation item：Agricultural Basic Research Joint Special Project of Yunnan（2018FG001-042）; Modern Agricultural Sericulture Industrial Technology System Construction Project of Yunnan（2019KJTX006）; Applied Basic Research Project of Yunnan Academy of Agricultural Sciences（YJM201710）

0 引言

【研究意義】家蠶（Bombyx mori）是國際無脊椎動物協(xié)會唯一確定的鱗翅目模式昆蟲，也是支撐蠶絲產(chǎn)業(yè)的生物基礎(chǔ)，具有極高的經(jīng)濟價值（秦儉等，2010;朱文愷等，2018）。β-呋喃果糖苷酶（β-fructofuranosidase，β-FFase）是一種蔗糖水解酶，普遍存在于植物和微生物中，動物體內(nèi)不存在β-FFase的觀點長期存在，影響著人們的科學判斷（Krasikov et al.，2001;Alberto et al.，2004;楊偉克等，2016）。BmSuc1基因是首個被克隆鑒定的動物型β-FFase基因，其酶活性不受桑葉生物堿1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）的抑制影響（Gan et al.，2018）。BmSuc1基因在家蠶幼蟲的中腸、前部及中部絲腺中高表達，其編碼的β-Ffase可能在家蠶抵御桑葉生物堿的毒害作用中發(fā)揮重要生理作用（楊偉克等，2016）。因此，明確BmSuc1基因的轉(zhuǎn)錄表達特征及其對外源激素的響應，可為揭示BmSuc1基因在家蠶機體中發(fā)揮的生理功能及闡明昆蟲激素對β-FFase基因的分子調(diào)控機制提供參考依據(jù)?！厩叭搜芯窟M展】Daimon等（2008）率先在家蠶基因組中克隆出編碼β-FFase的BmSuc1基因，通過體外重組獲得融合蛋白BmSuc1，并證實融合蛋白BmSuc1具有蔗糖水解酶活性，且其活性不受桑葉DNJ等生物堿的影響。此后，研究人員又從蓖麻蠶（Samia cynthia ricini）和柞蠶（Antherea pernyi）的基因組中克隆獲得β-FFase同源基因（張蕾，2014），其中，蓖麻蠶有2個β-FFase同源基因（ScSuc1和ScSuc2），柞蠶有3個（ApSuc1a、ApSuc1b和ApSuc1c），但這些基因在非食桑昆蟲蓖麻蠶和柞蠶幼蟲體內(nèi)幾乎不被轉(zhuǎn)錄，且研究發(fā)現(xiàn)蓖麻蠶和柞蠶機體的蔗糖水解酶主要為α-葡萄糖苷酶，不具β-FFase活性（張蕾，2014）。李靜（2014）從桑螟中克隆獲得5個β-FFase同源基因片段（DpSuc1a、DpSuc1b、DpSuc2a、DpSuc2b和DpSuc2c），其中DpSuc1a和DpSuc2c基因在前腸、中腸、絲腺和脂肪體等組織中高表達，而DpSuc1b、DpSuc2a和DpSuc2b基因在桑螟所有組織中幾乎不表達;桑螟中腸的β-FFase具有分解蔗糖的活力，且其活性不受DNJ影響。桑螟是以桑葉為寄主的桑樹害蟲，盡管與家蠶親緣關(guān)系較遠，但其機體存在β-FFase同源基因，且具有β-FFase活性，說明β-FFase在食桑昆蟲的糖代謝途徑中發(fā)揮著重要的生物功能作用，可幫助食桑昆蟲正常水解蔗糖，避開桑葉生物堿的毒性通路（李鑫，2016）。昆蟲的蛻皮與變態(tài)發(fā)育過程是在蛻皮激素（Molting hormone，MH）和保幼激素（Juvenile hormone，JH）的協(xié)同調(diào)控下，大量基因按照一定的時間和空間次序被誘導或抑制表達而實現(xiàn)（程道軍，2008;唐芬芬和楊偉克，2020）。JH對保持昆蟲幼蟲的形態(tài)、性狀及促進生殖腺成熟等起重要作用;而昆蟲的蛻皮、變態(tài)發(fā)育和繁殖受MH的嚴格調(diào)控（Liu et al.，2018;Zhang et al.，2018）。MH作為控制昆蟲變態(tài)發(fā)育最關(guān)鍵的內(nèi)在因子之一，任何受其直接或間接調(diào)控的基因均有可能參與昆蟲的蛻皮和變態(tài)發(fā)育過程（劉素寧等，2019）?！颈狙芯壳腥朦c】BmSuc1基因是第一個被克隆鑒定的動物型β-FFase基因，但其在家蠶整個生命周期的轉(zhuǎn)錄表達特征及昆蟲激素對BmSuc1基因表達調(diào)控的相關(guān)研究至今鮮見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以鱗翅目模式昆蟲家蠶為研究對象，通過實時熒光定量PCR檢測BmSuc1基因在家蠶不同組織及不同時期的表達特征及經(jīng)昆蟲激素[20-羥基蛻皮素（20E）和JH]處理后的表達變化規(guī)律，明確昆蟲激素對BmSuc1基因的調(diào)控作用，為深入解析BmSuc1基因的功能及其表達調(diào)控機制提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試家蠶品系為湘暉，由云南省農(nóng)業(yè)科學院蠶桑蜜蜂研究所家蠶資源研究室提供。組織表達譜取材為五齡第3 d家蠶的頭、馬氏管、血淋巴、表皮、中腸、氣管、脂肪體、絲腺、精巢和卵巢;時期表達譜取材為一齡起蠶至化蛹各時期的整蠶。20E（Y0002054）和JH（33375）購自Sigma公司;高純總RNA快速提取試劑盒（RP1202）購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）和實時熒光定量PCR試劑盒TB Green? Premix Ex Taq?（RR42LR）購自TaKaRa公司;RiboMAX Large Scale System-T7體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（P1300）購自Promega公司。

1. 2 外源激素處理

參照張捷等（2018）的方法，選用五齡第2 d發(fā)育良好的家蠶，以微量注射器（10 μL）在每頭家蠶第2個氣孔注射2 μL的20E（1.0 μg/μL）或JH（0.5 μg/μL），分別在注射后6、12、18和24 h取樣，-80 ℃保存?zhèn)溆?。以注射等量?.1%二甲基亞砜（DMSO）為對照。每處理設(shè)4個重復，每次取樣設(shè)3次重復。

1. 3 總RNA提取及cDNA制備

根據(jù)高純總RNA快速提取試劑盒操作說明，提取家蠶總RNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA完整性，采用SimpliNano超微量核酸蛋白定量儀檢測其濃度和純度;然后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用于實時熒光定量PCR檢測。

1. 4 實時熒光定量PCR檢測

以NCBI已公布的家蠶BmSuc1基因（GenBank登錄號NM_001126249.1）為靶標基因，核糖體蛋白基因Rp49（GenBank登錄號NM_001098282）為內(nèi)參基因，利用Primer Premier 5.0設(shè)計實時熒光定量PCR擴增引物（表1），委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。按照TB Green? Premix Ex Taq? 說明配制實時熒光定量PCR反應體系20.0 μL：2×TB Green Premix Ex Taq 10.0 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA模板1.5 μL，無菌水7.5 μL。擴增程序：95 ℃預變性5 min;95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，進行40個循環(huán)。根據(jù)CFX-96實時熒光定量PCR儀記錄數(shù)據(jù)，通過2-△△Ct法換算目的基因相對表達量。利用Excel 2016和SPSS 21.0對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析及制圖。

1. 5 dsRNA干擾試驗

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是通過雙鏈 RNA（dsRNA）介導特異性降解靶標基因mRNA，導致轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默現(xiàn)象。利用siDirect v2.0（http：//sidirect2.rnai.jp/）在線預測家蠶20E受體基因（USP）CDS序列潛在的siRNA位點，選擇siRNA位點集中且特異性較好的片段為dsRNA干擾片段，以家蠶紅色熒光蛋白基因（RFP）為內(nèi)參基因。利用Pri-mer 5.0設(shè)計RNAi引物（表2），并在各引物的5'端分別添加T7接頭序列（下劃線部分）。根據(jù)RiboMAX Large Scale System-T7試劑盒說明體外轉(zhuǎn)錄合成USP和RFP基因的dsRNA片段，于家蠶五齡第3 d按每頭家蠶30 μg的劑量，利用玻璃毛細管針注射dsRNA。分別在注射后24、36、48和60 h取材，通過實時熒光定量PCR檢測dsRNA干涉效果及BmSuc1基因的表達變化。

2 結(jié)果與分析

2. 1 BmSuc1基因的組織及時期表達特征

利用實時熒光定量PCR檢測BmSuc1基因在五齡第3 d家蠶10個組織中的表達情況，結(jié)果（圖1）顯示，BmSuc1基因在家蠶中腸的相對表達量最高，其次是絲腺、表皮和血淋巴，在其他組織中的相對表達量很低或幾乎不表達。BmSuc1基因在一齡起蠶至化蛹各時期的表達模式如圖2所示。BmSuc1基因呈脈沖型的表達模式，一齡至四齡的每個齡期起蠶的BmSuc1基因相對表達量均較低;隨著家蠶開始進食桑葉，BmSuc1基因相對表達量逐漸增加，至將眠時其相對表達量升至最高值（紅色箭頭標注），隨后開始降低，眠期結(jié)束時的相對表達量最低，之后又開始下一個循環(huán)。此外，在五齡后期（上簇前）及預蛹時均存在一個表達高峰（紅色箭頭標注）。

2. 2 外源激素對BmSuc1基因表達的影響

20E和JH協(xié)同調(diào)控昆蟲的蛻皮及變態(tài)過程，家蠶進入將眠和變態(tài)期，20E含量逐漸增加，而JH含量逐漸降低（程道軍，2008）。根據(jù)BmSuc1基因的時期表達譜（圖2），推測BmSuc1基因受20E和JH的協(xié)同調(diào)控，因此選用20E和JH分別處理五齡第2 d家蠶，檢測處理后不同時間點BmSuc1基因的表達變化規(guī)律，結(jié)果（圖3）表明，20E處理后12和18 h，BmSuc1基因相對表達量極顯著高于對照組（Ρ<0.01，下同）;但在測定的時間范圍內(nèi)，JH處理組的BmSuc1基因相對表達量與對照相間無顯著差異（Ρ>0.05），說明BmSuc1基因受20E的誘導表達，對JH處理則無明顯應答反應。

2. 3 阻斷20E信號對BmSuc1基因表達的影響

20E通過其受體EcR/USP轉(zhuǎn)導信號，即干擾EcR基因或USP基因均能有效阻斷20E信號轉(zhuǎn)導。以體外轉(zhuǎn)錄合成USP基因的dsRNA注射五齡第3 d家蠶，采用實時熒光定量PCR檢測USP基因干擾效果及BmSuc1基因的表達變化，結(jié)果（圖4）顯示，注射USP基因的dsRNA后24和36 h，USP基因相對表達量極顯著下調(diào)，說明dsRNA干擾成功。由圖5可看出，利用RNAi技術(shù)干擾USP基因能阻斷20E信號轉(zhuǎn)導，致使BmSuc1基因表達受抑制，其相對表達量在注射USP基因的dsRNA后24和36 h顯著下調(diào)（Ρ<0.05），推測BmSuc1基因作為20E信號轉(zhuǎn)導通路中的下游靶基因，受20E信號調(diào)控。

3 討論

隨著越來越多昆蟲基因組測序的完成，在許多昆蟲中發(fā)現(xiàn)有β-FFase同源基因存在。Pauchet等（2008）在棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）中腸cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)編碼β-FFase的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。隨后又在煙草天蛾（Manduca sexta）的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)2個編碼β-FFase的基因重疊群（MsSuc1和MsSuc2），說明鱗翅目昆蟲基因組中普遍存在β-FFase基因（Pauchet et al.，2009）。此外，在鞘翅目昆蟲山松甲蟲（Dendroctonus ponderosae）、甘蔗象鼻蟲（Sphenopho-rus levis）和白蠟窄吉丁蟲（Agrilus planipennis）的基因組中也發(fā)現(xiàn)編碼β-FFase的基因序列（Pedezzi et al.，2014;Zhao et al.，2014）。家蠶作為鱗翅目的模式昆蟲，BmSuc1基因是第一個被克隆鑒定的動物型β-FFase基因，但BmSuc1基因在家蠶整個生命周期及不同組織器官的表達特征并不清晰，其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機理尚未被解析。本研究全面系統(tǒng)分析BmSuc1基因的組織和時期表達規(guī)律，結(jié)果顯示，BmSuc1基因不僅在家蠶中腸高表達，在表皮和絲腺中的相對表達量也較高。昆蟲的蛻皮和變態(tài)均涉及到新舊表皮更替，而BmSuc1基因在表皮中高表達，暗示其可能參與蛻皮和變態(tài)的生理過程。Daimon等（2008）利用半定量PCR檢測BmSuc1基因在不同組織的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmSuc1基因在中腸和絲腺中的表達水平較高，但在表皮組織中檢測不到BmSuc1基因。本研究的實時熒光定量PCR檢測結(jié)果與Daimon等（2008）的研究結(jié)果存在一定差異，可能是檢測方法差異所造成，半定量PCR是通過瓊脂糖凝膠電泳條帶的明亮程度判斷基因表達情況，影響因素較多，而實時熒光定量PCR的靈敏度和精準度均高于半定量PCR。

在家蠶體內(nèi)，USP基因的RNAi效率較EcR基因的RNAi效率高（Masumoto et al.，2009）。本研究通過體外轉(zhuǎn)錄合成家蠶USP基因的dsRNA，注射五齡第3 d家蠶后能顯著下調(diào)USP基因表達，從而阻斷20E信號轉(zhuǎn)導;同時發(fā)現(xiàn)BmSuc1基因表達受抑制，暗示BmSuc1基因作為20E信號轉(zhuǎn)導通路中的下游靶基因，受20E信號的直接或間接調(diào)控。昆蟲20E信號轉(zhuǎn)導途徑已基本明晰：在分子伴侶復合物的協(xié)助下，20E先與異源二聚體受體EcR-USP結(jié)合，再與靶基因調(diào)控序列上的20E反應元件（Ecdysone receptor response element，EcRE）結(jié)合，募集共激活因子，在RNA聚合酶作用下啟動20E初級應答基因（轉(zhuǎn)錄因子E74、E75、E93和Br-C）轉(zhuǎn)錄（Nishita，2014;Li et al.，2016;Liu et al.，2018）。20E信號由初級應答基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子誘導次級應答基因表達而被級聯(lián)放大，進而實現(xiàn)對昆蟲生長發(fā)育、蛻皮變態(tài)及免疫防御的調(diào)控（劉素寧等，2019）。

關(guān)于20E對家蠶基因表達調(diào)控方面已有較多研究報道。趙國棟等（2012）用20E浸泡過的桑葉喂食家蠶，其中腸、脂肪體和馬氏管組織中的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶基因（BmGSTs1和BmGSTs2）轉(zhuǎn)錄水平顯著上升，表明這2個基因參與了家蠶蛻皮激素的代謝過程。Yang等（2014）研究表明，添加外源20E能顯著上調(diào)家蠶卵黃原蛋白基因（Vg）表達。楊歡歡（2016）研究發(fā)現(xiàn)，20E能調(diào)控五齡家蠶絲腺磷酸吡哆醇氧化酶基因（PNPO）和磷酸吡哆醛激酶基因（PLK）的表達，而JH對PNPO基因和PLK基因的表達無明顯影響。Mai等（2017）通過研究家蠶抗菌肽基因（Lebocin）在中腸的表達調(diào)控機制，發(fā)現(xiàn)20E可通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子基因（BmBR-CZ4和BmEts），而啟動Lebocin基因表達。此外，20E可通過BrC-Z4順式作用元件調(diào)控幾丁質(zhì)酶基因（BmCHT5）參與家蠶的蛻皮和變態(tài)過程（Zhang and Zheng.，2017）。20E通過作用于EcRE或介導E74、E75、E93和Br-C等相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子應答基因，實現(xiàn)對靶標基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用（洪芳等，2016）。本研究的外源激素注射試驗結(jié)果表明，BmSuc1基因的表達受20E調(diào)控，但具體調(diào)控機制尚未明確，BmSuc1基因啟動子序列是否存在EcRE或相關(guān)轉(zhuǎn)綠因子結(jié)合位點均有待后續(xù)進一步探究。

4 結(jié)論

BmSuc1基因主要在家蠶蛻皮和變態(tài)時高表達，暗示其可能參與家蠶的變態(tài)發(fā)育過程。添加外源20E可誘導BmSuc1基因轉(zhuǎn)錄，而阻斷20E信號轉(zhuǎn)導途徑會抑制BmSuc1基因表達，即BmSuc1基因作為20E信號轉(zhuǎn)導通路中的下游靶基因，直接或間接受到20E信號調(diào)控。

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（責任編輯 蘭宗寶）