基于SRAP分子標(biāo)記的油梨種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

甘霖 高樂 陳麗娜 何鵬

摘要：【目的】基于SRAP分子標(biāo)記分析油梨種質(zhì)資源的遺傳多樣性，為油梨種質(zhì)資源新品種選育及創(chuàng)新利用提供理論依據(jù)?！痉椒ā恳?0份油梨種質(zhì)為材料，從184對SRAP引物組合中篩選出擴(kuò)增條帶清晰且多態(tài)性較好的引物組合，利用其對油梨種質(zhì)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，基于擴(kuò)增結(jié)果，利用PopGene 1.32計(jì)算遺傳多樣性指數(shù);利用NTSYS 2.1的UPGMA（非加權(quán)組平均法）計(jì)算遺傳相似系數(shù)，并進(jìn)行聚類分析?！窘Y(jié)果】從184對SRAP引物組合中篩選出17對擴(kuò)增條帶清晰且多態(tài)性較好的引物，利用該17對引物對50份供試油梨種質(zhì)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出322條條帶，其中多態(tài)性條帶有206個(gè)，平均每條引物擴(kuò)增出12.12條，多態(tài)比率為63.75%。50份油梨種質(zhì)材料的觀測等位基因數(shù)（Na）為1.0844～1.4034，平均為1.2493;有效等位基因數(shù)（Ne）為1.0067～1.6028，平均為1.3390;Neis遺傳多樣性指數(shù)（H）為0.0642～0.1466，平均為0.1439;Shannons信息指數(shù)（I）為0.0634～0.1759，平均為0.1308。大嶺2號與油梨種質(zhì)4號的遺傳一致度最高（0.9237），遺傳相似系數(shù)最大（0.92），同時(shí)二者之間的遺傳距離最?。?.1365），表明大嶺2號與油梨種質(zhì)4號種質(zhì)間的親緣關(guān)系最近。油梨種質(zhì)5號與Fuerte間的遺傳一致度相對最小（0.3765），且二者間的遺傳距離最大（0.8253），說明油梨種質(zhì)5號和Fuerte的親緣關(guān)系相對最遠(yuǎn)。在遺傳相似系數(shù)0.48處，50份油梨種質(zhì)被分為四大類群，海南白沙油梨種質(zhì)集中在第Ⅲ類群，海南儋州、廣東湛江及廣西南寧油梨種質(zhì)在第Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類群中均有分布，表明海南儋州、廣東湛江及廣西南寧油梨種質(zhì)的遺傳多樣性均較豐富?！窘Y(jié)論】海南儋州、廣東湛江及廣西南寧油梨種質(zhì)的遺傳多樣性相對較豐富，可為油梨親本選配和育種等方面的創(chuàng)新利用提供材料基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： 油梨;SRAP;遺傳多樣性;群體結(jié)構(gòu)

中圖分類號： S667.902.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2021）07-1798-08

Genetic diversity analysis of avocado germplasm resources based on SRAP molecular markers

GAN Lin1， GAO Le1， CHEN Li-na2， HE Peng1*

（1Rubber Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Danzhou， Hainan? 571737， China;

2Guangzhou Experimental Station， Chinese Academy of Tropical Agricultural Science， Guangzhou? 510140， China）

Abstract：【Objective】The genetic diversity of avocado germplasm resources was analyzed based on SRAP molecular markers，which provided a theoretical basis for the breeding and innovative utilization of new varieties of avocado germplasm resources. 【Method】Using 50 avocado germplasm as materials，184 pairs of SRAP primer combinations with clear amplification bands and good polymorphism were selected. The genetic diversity index of avocado germplasm was calculated by PopGene 1.32 based on the amplification results. The genetic similarity coefficient was calculated by UPGMA （unweighted group average method） of NTSYS 2.1，and cluster analysis was carried out. 【Result】A total of 17 primer pairs with clear amplification and good polymorphism were selected from 184 pairsof SRAP primer combinations. A total of 322 bands were amplified by PCR from 50 tested avocado germplasm materials by the 17 primer pairs，of which 206 were polymorphic，with an average of 12.12 amplified by each primer，and the polymorphism rate was 63.75%. The observed allele number（Na） of 50 avocado germplasm materials was 1.0844-1.4034，with an average of 1.2493，effective number of alleles（Ne） was 1.0067-1.6028，with an average of 1.3390. Neis genetic diversity index（H） was 0.0642-0.1466，with an average of 0.1439，Shannons information index（I） was 0.0634-0.1759，with an average of 0.1308. Daling 2 and avocado germplasm 4 had the highest genetic consistency（0.9237），the highest genetic similarity coefficient（0.92），and the lowest genetic distance（0.1365），indicating that Daling 2 and avocado germplasm 4 had the closest genetic relationship. The genetic consistency between avocado germplasm 5 and Fuerte was the minimum（0.3765），and the genetic distance between them was the largest（0.8253），indicating that the genetic relationship between avocado germplasm 5 and Fuerte was the farthest. At the genetic similarity coefficient of 0.48，50 avocado germplasm were divided into four groups. Avocado germplasm from Baisha，Hainan was concentrated in group III，and avocado germplasm from Danzhou， Hainan，Zhanjiang，Guangdong and Nanning，Guangxi were distributed in groups I，II and IV，indicating that avocado germplasm from? Danzhou，Hainan，Zhanjiang，Guangdong and Nanning，Guangxi were rich in genetic diversity. 【Conclusion】The genetic diversity of avocado germplasms from Danzhou，Hainan，Zhanjiang，Guangdong and Nanning，Guangxi are more abundant than that from Baisha，which provided a theoretical basis for innovation in parents selection and breeding.

Key words： avocado; SRAP; genetic diversity; population structure

Foundation item： Hainan Natural Science Foundation（319QN324）; Central Public-interest Scientific Institution Basal Research Fund for Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences（1630022018013）

0 引言

【研究意義】油梨（Persea americana Mill.）別名鱷梨、牛油果，屬樟科油梨屬常綠喬木果樹，原產(chǎn)于拉丁美洲，其營養(yǎng)豐富，富含脂肪酸（8%～30%）、碳水化合物（2%～9%）、蛋白質(zhì)（1%～3%）及多種維生素，香甜可口，既是水果又是糧食，具有“世界名貴果品”之稱，在世界范圍內(nèi)的40多個(gè)國家和地區(qū)均有栽培，其種植面積高達(dá)50萬ha，年產(chǎn)量為350萬～400萬t（應(yīng)東山等，2018;Rosero et al.，2019;Tugiyanti et al.，2019）。我國于20世紀(jì)20年代初開始引種試種油梨，目前在海南、廣東、廣西和云南等地均有種植，其種植面積高達(dá)1.5萬ha（李家興，2010;何國祥，2012;張良等，2015）。近年來，我國對農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源的收集、保存和利用工作十分重視，越來越多的科研單位和企業(yè)從國外引入油梨新品種，但對其品種間的親緣關(guān)系、種群結(jié)構(gòu)等信息尚不清楚，嚴(yán)重影響油梨種質(zhì)的創(chuàng)新利用及其育種研究的深入發(fā)展。因此，研究分析油梨種質(zhì)的遺傳多樣性對其種質(zhì)資源保存、創(chuàng)新利用及新品種選育均具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】SRAP分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于作物種質(zhì)的遺傳多樣性分析、種群結(jié)構(gòu)分析、種質(zhì)資源鑒定等研究領(lǐng)域，其中包括蘋果（張春雨等，2009）、荔枝（趙玉輝等，2010）、梨（梁婷婷等，2015）、柚（林紹生等，2015）、芒果（羅世杏等，2018;劉榮等，2019）等果樹。目前，我國對油梨遺傳多樣性的研究報(bào)道較少。李家興（2010）根據(jù)生物學(xué)特性分析了貴州地區(qū)油梨種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)。周海蘭（2016）利用12條多態(tài)性ISSR引物對112份油梨材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，在遺傳相似系數(shù)為0.72時(shí)，供試材料分為七大類群。周海蘭等（2016）建立了穩(wěn)定的SSR-PCR反應(yīng)體系及篩選出穩(wěn)定的油梨SSR多態(tài)性引物。應(yīng)東山等（2018）利用轉(zhuǎn)錄測序技術(shù)開發(fā)了34對多態(tài)性SSR引物，為油梨種群的遺傳多樣性分析及親本鑒定提供新途徑。周兆禧等（2019）以國內(nèi)收集的170份油梨種質(zhì)資源為材料，對其15個(gè)表型性狀進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明油梨種質(zhì)資源的遺傳變異類型較豐富。郭俊等（2020）以32份油梨種質(zhì)資源為材料，開發(fā)了40對多態(tài)性SSR引物，并將其分為四大類?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前鮮見利用SRAP分子標(biāo)記進(jìn)行油梨種質(zhì)遺傳多樣性分析的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】開發(fā)多態(tài)性SRAP分子標(biāo)記，分析不同油梨種質(zhì)的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)，為油梨種質(zhì)資源的創(chuàng)新利用和新品種選育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試的50份油梨種質(zhì)分別來自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院橡膠研究所五隊(duì)試驗(yàn)基地（海南儋州）、南亞熱帶作物研究所國家熱帶果樹種質(zhì)資源圃（廣東湛江）、廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院果樹基地（廣西南寧）及海南省白沙市大嶺農(nóng)場（海南白沙）（表1）。主要試劑：Taq DNA聚合酶、dNTPs、PCR Buffer、DNA提取所需試劑、瓊脂糖、丙烯酰胺、DL2000 DNA Marker等均購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，SRAP引物由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成。主要儀器：低溫高速離心機(jī)（Eppendorf centrifuge 5804R，德國）、梯度核酸擴(kuò)增儀（TP1600，澳大利亞）、垂直電泳系統(tǒng)（北京六一儀器廠）和核酸凝膠成像系統(tǒng)（G-BOXF3）。

1. 2 樣品采集和DNA提取

采集油梨嫩葉1～2片/株，采用CTAB法提取葉片DNA（周麗霞等，2013），于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 3 引物篩選

隨機(jī)選取大嶺2號的DNA為模板，對184對SRAP引物組合進(jìn)行篩選。反應(yīng)總體系15.0 μL：DNA模板2.0 μL，2×Taq PCR Master-Mix（含染料）8.0 μL，正、反向引物各1.0 μL，ddH2O補(bǔ)足至15.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，35 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，將退火溫度升至56.4 ℃，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸7 min。

1. 4 統(tǒng)計(jì)分析

用Excel 2010統(tǒng)計(jì)PCR產(chǎn)物中清晰可辨的條帶數(shù)，相同位置有條帶的記為“1”，無條帶的記為“0”，從而構(gòu)建成原始數(shù)據(jù)矩陣。利用NTSYS 2.1的UPGMA（非加權(quán)組平均法）計(jì)算遺傳相似系數(shù)，并繪制聚類圖;利用PopGene 1.32計(jì)算遺傳多樣性指數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2. 1 SRAP引物篩選結(jié)果

以大嶺2號DNA為模板，利用184對SRAP引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)PCR產(chǎn)物條帶的清晰度、穩(wěn)定性及多態(tài)性的豐富度，共篩選出17對SRAP引物，引物序列如表2所示。利用該17對引物對50份供試油梨種質(zhì)材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共擴(kuò)增出322條條帶，其中多態(tài)性條帶有206條，平均每條引物擴(kuò)增出12.12條，多態(tài)比率為63.75%（表2）。圖1為引物組合Me7/Em18對50份供試油梨種質(zhì)的擴(kuò)增圖譜，同一引物針對不同的供試油梨種質(zhì)材料，其擴(kuò)增結(jié)果差異較大，說明該供試群體的遺傳多樣性較豐富?？梢姡琒RAP分子標(biāo)記可用于油梨種質(zhì)的遺傳多樣性分析。

2. 2 油梨種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析結(jié)果

應(yīng)用PopGene 1.32計(jì)算50份油梨種質(zhì)的遺傳多樣性指數(shù)，結(jié)果如表3所示。50份油梨種質(zhì)的觀測等位基因數(shù)（Na）為1.0844～1.4034，平均為1.2493;有效等位基因數(shù)（Ne）為1.0067～1.6028，平均為1.3390;Neis遺傳多樣性指數(shù)（H）為0.0642～0.1466，平均為0.1439;Shannons信息指數(shù)（I）為0.0634～0.1759，平均為0.1308，說明50份油梨種質(zhì)材料的遺傳多樣性較豐富。

50份油梨種質(zhì)材料的遺傳一致度和遺傳距離如表4所示。廣東湛江與海南儋州的遺傳一致度相對最高，為0.9237，同時(shí)二者之間的遺傳距離最小，為0.1365，說明這兩個(gè)地區(qū)油梨種質(zhì)的親緣關(guān)系最近。廣西南寧與廣東湛江油梨種質(zhì)的遺傳一致度相對最小，為0.4308，且二者的遺傳距離最大，為0.6730，說明這兩個(gè)地區(qū)間油梨種質(zhì)的親緣關(guān)系相對最遠(yuǎn)。

應(yīng)用NYSTS 2.1計(jì)算油梨遺傳相似系數(shù)，結(jié)果（表5）顯示50份供試油梨材料的遺傳相似系數(shù)為0.22～0.92，其中大嶺2號（編號1）與油梨種質(zhì)4號（編號2）的遺傳相似系數(shù)最大，為0.92，說明二者親緣關(guān)系最近;油梨種質(zhì)4號（編號2）與Fuerte（編號5）的遺傳相似系數(shù)最小，為0.22，說明二者親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2. 3 油梨種質(zhì)資源的聚類分析結(jié)果

為了分析50份供試油梨種質(zhì)的群體結(jié)構(gòu)，應(yīng)用UPGMA對其進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖3。在遺傳相似系數(shù)為0.48時(shí)，50份供試油梨種質(zhì)被分為四個(gè)大類群，其中來自海南白沙市的油梨種質(zhì)集中分布在第Ⅲ類群，其他3個(gè)地區(qū)的油梨種質(zhì)在第Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類群中均有分布。第Ⅰ類群含有20份油梨種質(zhì)：大嶺2號、油梨種質(zhì)5號、Hass、RN-1、RN-4、RN-5、Beta、Tonnie、Simmonds、Migule、Monroe、Wilson seedless、NR-3、RLW-3、RLW-4、RLW-10、GY-5、GY-7、GY-15和GY-16;第Ⅱ類群含有15份油梨種質(zhì)：Fuerte、RN-11、RN-17、RN-18、Dupuis、Tonnage、Brooks late、Loretta、Peterson、NR-5、RLW-2、RLW-6、GY-2、GY-3和GY-11;第Ⅳ類群含有5份油梨種質(zhì)：油梨種質(zhì)4號、Lula、NR-10、RLW-1和GY-12。表明海南省白沙市油梨種質(zhì)的遺傳多樣性相對單一，遺傳背景相對狹窄，群體內(nèi)親緣關(guān)系較接近;海南儋州、廣東湛江和廣西南寧的油梨種質(zhì)在第Ⅰ、Ⅱ和Ⅳ類群中均有分布，說明其遺傳多樣性豐富度高，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，群體結(jié)構(gòu)較復(fù)雜。總體來看，50份供試油梨種質(zhì)的遺傳多樣性較豐富。

3 討論

3. 1 SRAP分子標(biāo)記是分析油梨遺傳多樣性的有效手段

SRAP分子標(biāo)記已廣泛用于多種植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析（王國澤等，2013），但鮮見應(yīng)用于油梨的相關(guān)研究報(bào)道。本研究應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記對50份油梨種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，共篩選出17對多態(tài)性較好的引物組合，獲得322個(gè)清晰的位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)有206個(gè)，其多態(tài)比率為63.75%。該結(jié)果高于孟慧等（2018）對海南降香檀（52.8%）、高寧寧等（2019）對甜瓜（58.0%）的SRAP多態(tài)比率，低于洪建聰?shù)龋?019）對野生白及（90.6%）的SRAP多態(tài)比率，說明SRAP分子標(biāo)記是一種可用于油梨遺傳多樣性分析的有效手段。

3. 2 基于SRAP分子標(biāo)記的油梨種質(zhì)資源遺傳特點(diǎn)

觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis多樣性指數(shù)（H）和Shannons信息指數(shù)（I）是判斷物種間種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富度的常用指標(biāo)，可明確當(dāng)前收集的油梨遺傳變異動(dòng)向，了解其遺傳多樣性，為育種工作提供理論基礎(chǔ)。本研究中，供試50份油梨種質(zhì)的Na為1.7225，Ne為1.8818，H為0.1977及I為0.1308，與紅米（馬孟莉等，2019）、鐵皮石斛（楊貞等，2019）的研究結(jié)果相似，表明供試油梨種質(zhì)的遺傳多樣性較豐富。其中，來自廣東湛江的油梨種質(zhì)遺傳多樣性指數(shù)（Na、Ne、H和I）最高，其次為廣西南寧，海南白沙的油梨種質(zhì)遺傳多樣性指數(shù)最低，結(jié)果表明廣東湛江和廣西南寧的油梨種質(zhì)遺傳多樣性較豐富，海南儋州油梨種質(zhì)的遺傳背景相對豐富，海南白沙油梨種質(zhì)的遺傳背景最簡單，親緣關(guān)系最近。

本研究應(yīng)用UPGMA對50份油梨種質(zhì)材料進(jìn)行聚類分析，結(jié)果將其分為四大類群，其中海南白沙的油梨種質(zhì)主要集中分布在第Ⅲ類群，而其他3個(gè)地區(qū)的種質(zhì)分布較為分散，說明海南儋州、廣東湛江及廣西南寧油梨種質(zhì)遺傳多樣性較高，海南白沙油梨種質(zhì)的遺傳多樣性相對最低，與上述計(jì)算所得的遺傳多樣性指數(shù)結(jié)果相符。不同種源遺傳多樣性參數(shù)差異明顯，遺傳多樣性的變化原因較復(fù)雜，其本質(zhì)原因是物種等位基因數(shù)目或頻率的變化，同時(shí)受遺傳漂變、自然選擇等因素影響，還包括人為干擾、環(huán)境變化及地理隔離等。我國從20世紀(jì)20年代開始引種油梨，目前廣泛種植在廣東、廣西、福建及海南等?。▍^(qū)），其中廣東和廣西已建成我國重要的油梨生產(chǎn)基地，涵蓋了從墨西哥和印度尼西亞等國家引入的多個(gè)優(yōu)良油梨種質(zhì)，1960年儋州華安熱帶作物學(xué)院在其試驗(yàn)站內(nèi)開始建油梨種植園，先后分別從美國和澳大利亞引入多種適合海南西部地區(qū)種植的油梨品種。因此，廣東、廣西和海南儋州涵蓋的的油梨種質(zhì)遺傳背景相對豐富，基因流影響較大，遺傳相似性較低，遺傳多樣性水平也較高。海南白沙大嶺農(nóng)場現(xiàn)主要是以家庭分散的經(jīng)營模式為主，農(nóng)場油梨園為輔，粗放式管理，品種未更新，遺傳相似性較高，遺傳多樣性相對較低?？梢?，SRAP分子標(biāo)記可有效地判斷油梨種質(zhì)親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，同時(shí)可用于鑒定評價(jià)物種種質(zhì)資源群體結(jié)構(gòu)的有效方法。

優(yōu)良且多樣的種質(zhì)資源可為新品種培育提供基礎(chǔ)材料，只有掌握種質(zhì)資源的種群結(jié)構(gòu)、遺傳背景及遺傳信息，才能對其進(jìn)行充分有效的創(chuàng)新利用。本研究應(yīng)用SRAP分子標(biāo)記對50份油梨種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)海南儋州、廣東湛江及廣西南寧油梨種質(zhì)的遺傳多樣性較豐富，遺傳背景較復(fù)雜。在此基礎(chǔ)上，今后應(yīng)進(jìn)一步調(diào)查研究海南儋州、廣東湛江及廣西南寧地區(qū)油梨的表型性狀，并與遺傳性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，為親本選配及油梨新品種培育提供材料基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

海南儋州、廣東湛江及廣西南寧油梨種質(zhì)的遺傳多樣性較豐富，可用作油梨親本選配育種及創(chuàng)新利用的基礎(chǔ)材料。

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（責(zé)任編輯 陳 燕）