重樓皂苷Ⅰ通過(guò)調(diào)控LncRNA CEBPA-AS1/miR-195-5p通路抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的初步研究

張翠　王珺　王凱波　林偉　孫田

[摘要]目的：探討重樓皂苷Ⅰ（PPⅠ）是否通過(guò)調(diào)控長(zhǎng)鏈非編碼RNA CEBPA-AS1（LncRNA CEBPA-AS1）/微小RNA-195-5p（miR-195-5p）通路影響瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及凋亡。方法：原代培養(yǎng)人瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，使用不同濃度的PPⅠ處理細(xì)胞，si-CEBPA-AS1、pcDNA-CEBPA-AS1分別轉(zhuǎn)染至細(xì)胞;采用MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖;應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期;采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率;采用qRT-PCR法檢測(cè)LncRNA CEBPA-AS1、miR-195-5p的表達(dá)量;雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)LncRNA CEBPA-AS1與miR-195-5p的靶向關(guān)系。結(jié)果：與Control組比較，PPⅠ可明顯降低細(xì)胞存活率、S期細(xì)胞比例、Bcl-2蛋白水平、LncRNA CEBPA-AS1的表達(dá)水平，提高G0/G1期細(xì)胞比例、凋亡率、miR-195-5p的表達(dá)水平，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與si-NC組比較，si-CEBPA-AS1組細(xì)胞存活率、S期細(xì)胞比例降低，G0/G1期細(xì)胞比例、凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)證實(shí)LncRNA CEBPA-AS1可靶向調(diào)控miR-195-5p;轉(zhuǎn)染pcDNA-CEBPA-AS1可明顯逆轉(zhuǎn)PPⅠ對(duì)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期及凋亡的作用。結(jié)論：重樓皂苷Ⅰ可能通過(guò)下調(diào)LncRNA CEBPA-AS1的表達(dá)及上調(diào)miR-195-5p的表達(dá)從而抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞]重樓皂苷Ⅰ;LncRNA CEBPA-AS1;miR-195-5p;瘢痕疙瘩;成纖維細(xì)胞;增殖;凋亡

[中圖分類(lèi)號(hào)]R619+.6? ? [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A? ? [文章編號(hào)]1008-6455（2021）09-0012-05

Polyphylin Ⅰ Inhibits Keloid Fibroblast Proliferation and Promotes Apoptosis by Regulating the LncRNA CEBPA-AS1/miR-195-5p Pathway

ZHANG Cui，WANG Jun，WANG Kai-bo，LIN Wei，SUN Tian

（Department of Dermatology，Shenyang Seventh People's Hospital，Shenyang 110000，Liaoning，China）

Abstract： Objective? To investigate whether PPⅠ affects keloid fibroblast proliferation and apoptosis by regulating the LncRNA CEBPA-AS1/miR-195-5p pathway. Methods? Primary culture of human keloid fibroblasts， and treatment of cells with different concentrations of PPⅠ. si-CEBPA-AS1 and pcDNA-CEBPA-AS1 were transfected into cells respectively. MTT was used to detect cell proliferation. Application of flow cytometry to detect cell cycle. Flow cytometry was used to detect the apoptosis rate. The expression of LncRNA CEBPA-AS1， miR-195-5p was detected by qRT-PCR method. The dual luciferase report experiment detected the targeting relationship between LncRNA CEBPA-AS1 and miR-195-5p. Results? Compared with the Control group， PPⅠ could significantly reduce the cell survival rate， S phase cell ratio， the protein level of Bcl-2， the expression level of LncRNA CEBPA-AS1， the differences were statistically significant （P<0.05）， and increase the G0/G1 phase cell ratio， apoptosis rate， the expression level of miR- 195-5p （P<0.05）. Compared with the si-NC group， the cell survival rate and the proportion of S-phase cells in the si-CEBPA-AS1 group was decreased （P<0.05）， and the proportion of cells in the G0/G1 phase and the apoptosis rate were increased （P<0.05）. The dual luciferase report experiment confirmed that LncRNA CEBPA-AS1 could target miR-195-5p. Transfection of pcDNA-CEBPA-AS1 could obviously reverse the effects of PPⅠ on cell proliferation， cell cycle and apoptosis. Conclusion? PolyphylinⅠmay inhibit the proliferation of keloid fibroblasts and promote apoptosis by down-regulating the expression of LncRNA CEBPA-AS1 and up-regulating the expression of miR-195-5p.

Key words： Polyphylin Ⅰ; LncRNA CEBPA-AS1; miR-195-5p; keloid; fibroblast; proliferation; apoptosis

瘢痕疙瘩是皮膚纖維組織增生異常引起的，天然植物提取物對(duì)瘢痕具有明顯的抑制作用，但關(guān)于其作用機(jī)制尚未完全闡明[1-3]。重樓是我國(guó)中醫(yī)藥治療中的重要藥物之一，其主要成分重樓皂苷Ⅰ（Polyphylin Ⅰ，PPⅠ）具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[4]。但重樓皂苷Ⅰ對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的影響尚不明確。長(zhǎng)鏈非編碼RNA CEBPA-AS1（LncRNA CEBPA-AS1）在肝癌中呈高表達(dá)，并可能促進(jìn)肝癌發(fā)生及發(fā)展[5]。通過(guò)生物信息學(xué)分析顯示微小RNA-195-5p（miR-195-5p）可能是LncRNA CEBPA-AS1的靶基因，miR-195-5p在肺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲[6]。但重樓皂苷Ⅰ是否可通過(guò)調(diào)控LncRNA CEBPA-AS1/miR-195-5p通路影響瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及凋亡尚未可知。因此，本研究主要探討重樓皂苷Ⅰ對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的影響，探究其對(duì)LncRNA CEBPA-AS1/miR-195-5p通路的調(diào)控作用。

1? 材料和方法

1.1 材料和試劑：收集2017年10月-2018年10月于筆者醫(yī)院進(jìn)行瘢痕疙瘩手術(shù)的10例患者為研究對(duì)象，其中男6例，女4例，年齡22～63歲，平均（43.25±6.35）歲，取材部位：前胸部3例，肩部2例，耳垂部5例，采取樣本時(shí)瘢痕疙瘩處于增生活躍期、質(zhì)地較硬且局部充血，患者表現(xiàn)為毛細(xì)血管擴(kuò)張且伴隨瘙癢或疼痛，瘢痕疙瘩不存在破損或感染，均未接受任何治療。

重樓皂苷Ⅰ購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;胰蛋白酶、Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;CEBPA-AS1小分子干擾RNA（si-CEBPA-AS1）、亂序無(wú)意義陰性序列（si-NC）、miR-195-5p寡核苷酸模擬物（miR-195-5p mimics）及陰性對(duì)照mimic NC序列（miR-NC）購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司;pcDNA3.1購(gòu)自上海聯(lián)邁生物工程有限公司;Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄、熒光定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司;MTT購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司;細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;兔抗人Bax、Bcl-2抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;HRP標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞[7]：采用原代分散細(xì)胞培養(yǎng)法分離培養(yǎng)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，將切取的瘢痕疙瘩組織置于膠原酶溶液內(nèi)消化4h，剪碎，置于膠原酶溶液中消化，分散成纖維細(xì)胞，過(guò)濾，離心后進(jìn)行洗滌，加入含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素與100μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行傳代培養(yǎng)，待成纖維細(xì)胞鋪滿瓶底，置于光學(xué)顯微鏡下觀察，加入0.25%胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取第4代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組：瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞接種于6孔板（3×104個(gè)/孔），分別加入含有不同濃度（2mg/L、10mg/L、20mg/L）的重樓皂苷Ⅰ的培養(yǎng)基處理24h[8]，分別記作PPⅠ-L組、PPⅠ-M組、PPⅠ-H組。同時(shí)加入含0.1% DMSO的培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h作為Control組。后續(xù)實(shí)驗(yàn)設(shè)置si-NC組（si-NC轉(zhuǎn)染至瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞）、si-CEBPA-AS1組（si-CEBPA-AS1轉(zhuǎn)染至瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞）、PPⅠ-H+pcDNA組（pcDNA轉(zhuǎn)染至瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，加入含有濃度為20mg/L重樓皂苷Ⅰ的培養(yǎng)基處理24h）、PPⅠ-H+pcDNA-CEBPA-AS1組（pcDNA-CEBPA-AS1轉(zhuǎn)染至瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，加入含有濃度為20mg/L重樓皂苷Ⅰ的培養(yǎng)基處理24h）。

1.2.3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖：收集各組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞接種于96孔板（5×103個(gè)/孔），每孔加入MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，每孔加入150μl DMSO，室溫避光振蕩孵育5min，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值（OD值）。計(jì)算細(xì)胞存活率（%）=實(shí)驗(yàn)處理組OD值/Control組OD值×100%。

1.2.4 檢測(cè)細(xì)胞周期：取各組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/毫升，加入預(yù)冷PBS，4℃條件下經(jīng)3 000r/min離心5min，棄上清，加入500μl PBS重懸細(xì)胞，加入70%乙醇（3.5ml），充分混勻，4℃條件下孵育24h，取出單細(xì)胞懸液，4℃條件下經(jīng)3 000r/min離心5min，棄上清，收集細(xì)胞沉淀，加入50μl RNaseA，37℃條件下水浴30min，加入PI染液（450μl），4℃條件下孵育30min，應(yīng)用流式細(xì)胞儀與Flowjoe軟件分析各組細(xì)胞在G0/G1期、S期、G2/M期所占細(xì)胞比例。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：收集各組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/毫升，加入預(yù)冷PBS，4℃條件下經(jīng)3 000r/min離心5min，棄上清，收集細(xì)胞沉淀，加入500μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入5μl Annexin V-FITC充分混勻，加入5μl PI充分混勻，室溫振蕩搖晃孵育10min，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀及應(yīng)用Cellauest軟件檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞中LncRNA CEBPA-AS1、miR-195-5p的表達(dá)水平：收集各組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。LncRNA CEBPA-AS1正向引物5-AGAACCATTCCAAGAGCCCA-3，反向引物5-TGGCAACCTTAAACCACAGC-3;GAPDH正向引物5-GGAGCGAGATCCCTCC AAAAT-3，反向引物5-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3;miR-195-5p正向引物5-AATATTGGCTGTGCTGCTCC3，反向引物5-GGACCCTGTTCACACTCTGA-3;U6正向引物5-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3，反向引物5-GGAACGCTTCACG AATTTG-3，引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：SYBR Green Master Mix 10微升/孔，正反向引物0.8微升/孔，cDNA 1微升/孔，ddH2O補(bǔ)足體系至20μl;反應(yīng)條件：95℃ 2min循環(huán)1次，95℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 30s，共循環(huán)40次。LncRNA CEBPA-AS1以GAPDH為內(nèi)參，miR-195-5p以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA CEBPA-AS1、miR-195-5p相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)LncRNA CEBPA-AS1與miR-195-5p靶向關(guān)系：LncBase v.2預(yù)測(cè)顯示LncRNA CEBPA-AS1與miR-195-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，構(gòu)建野生型載體WT-CEBPA-AS1與突變型載體MUT-CEBPA-AS1，分別將miR-NC、miR-195-5p mimics與WT-CEBPA-AS1、MUT-CEBPA-AS1共轉(zhuǎn)染至瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24h，收集細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

1.2.8 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)：收集各組瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。SDS-PAGE電泳分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉2h，加入一抗稀釋液（1：1 000），4℃孵育過(guò)夜，TBST洗滌，加入二抗稀釋液（1：2 000），室溫孵育1h，TBST洗滌，曝光顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以（x?±s）表示且均符合正態(tài)分布，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1 重樓皂苷Ⅰ對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖的影響：與Control組比較，PPⅠ-L組、PPⅠ-M組、PPⅠ-H組細(xì)胞存活率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高，S期細(xì)胞比例顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且PPⅠ-L組、PPⅠ-M組、PPⅠ-H組細(xì)胞存活率、G0/G1期、S期細(xì)胞比例比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），而不同組別間G2/M期細(xì)胞比例比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 重樓皂苷Ⅰ對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡的影響：與Control組比較，PPⅠ-L組、PPⅠ-M組、PPⅠ-H組細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;Bax蛋白水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且PPⅠ-L組、PPⅠ-M組、PPⅠ-H組細(xì)胞凋亡率、Bax、Bcl-2蛋白水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1、表2。

2.3 重樓皂苷Ⅰ對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中LncRNA CEBPA-AS1、miR-195-5p表達(dá)量的影響：與Control組比較，PPⅠ-L組、PPⅠ-M組、PPⅠ-H組LncRNA CEBPA-AS1的表達(dá)水平顯著降低，miR-195-5p的表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;且PPⅠ-L組、PPⅠ-M組、PPⅠ-H組LncRNA CEBPA-AS1、miR-195-5p的表達(dá)水平比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 干擾LncRNA CEBPA-AS1表達(dá)對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的影響：與si-NC組比較，si-CEBPA-AS1組細(xì)胞存活率顯著降低，G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高，S期細(xì)胞比例顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;G2/M期細(xì)胞比例無(wú)明顯變化（P>0.05）;細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bax蛋白水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2，表4。

2.5 LncRNA CEBPA-AS1靶向調(diào)控miR-195-5p：LncBase v.2預(yù)測(cè)顯示LncRNA CEBPA-AS1與miR-195-5p存在結(jié)合位點(diǎn)，見(jiàn)圖3。共轉(zhuǎn)染W(wǎng)T- CEBPA-AS1的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與miR-NC組比較，miR-195-5p組熒光素酶活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;共轉(zhuǎn)染MUT-CEBPA-AS1的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-195-5p組熒光素酶活性與miR-NC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表5。與si-NC組比較，si-CEBPA-AS1組miR-195-5p的表達(dá)水平顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與pcDNA組比較，pcDNA-CEBPA-AS1組miR-195-5p的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)表6。

2.6 LncRNA CEBPA-AS1過(guò)表達(dá)可降低重樓皂苷Ⅰ對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的作用：與PPⅠ-H+pcDNA組比較，PPⅠ-H+pcDNA-CEBPA-AS1組細(xì)胞存活率顯著升高，G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，S期細(xì)胞比例顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;G2/M期細(xì)胞比例無(wú)明顯變化（P>0.05）;細(xì)胞凋亡率顯著降低，Bax蛋白水平顯著降低，Bcl-2蛋白水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖4，表7。

3? 討論

瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞過(guò)度增殖與細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)量沉積可造成瘢痕疙瘩的形成，目前臨床主要采用藥物進(jìn)行預(yù)防及治療，但治療效果不佳，因而尋找治療效果好且副作用小的藥物具有重要意義，苦參堿、辣椒素等藥物具有抗炎、止癢、抗腫瘤等作用，可明顯抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖[9-10]。因而本研究仍積極探尋新型治療藥物并探究其可能作用機(jī)制，為提高瘢痕疙瘩的治療效果提供參考依據(jù)。

重樓是治療腫瘤的重要藥物之一，其具有清熱解毒、消腫止痛等作用，重樓皂苷Ⅰ是重樓的主要活性物質(zhì)，其具有抗腫瘤等作用，并可作用腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖[11-13]。與上述研究結(jié)果相似，本研究結(jié)果顯示不同濃度的重樓皂苷Ⅰ處理后細(xì)胞存活率顯著降低，G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高，S期細(xì)胞比例顯著降低，且隨著藥物劑量的增加而明顯變化，提示重樓皂苷Ⅰ可抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖，并可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯于G1期，且呈劑量依賴(lài)性。Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于促凋亡蛋白，Bax表達(dá)上調(diào)可通過(guò)促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C而激活Capase級(jí)聯(lián)反應(yīng)從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[14]。本研究結(jié)果顯示不同濃度的重樓皂苷Ⅰ處理后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，且隨著藥物劑量的增加而顯著變化，提示重樓皂苷Ⅰ可促進(jìn)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞凋亡，且呈劑量依賴(lài)性。

LncRNA CEBPA-AS1在口腔鱗狀細(xì)胞癌中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)量與口腔鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后不良相關(guān)，并可能通過(guò)CEBPA/Bcl2促進(jìn)腫瘤發(fā)生[15]。本研究結(jié)果顯示不同濃度的重樓皂苷Ⅰ處理后LncRNA CEBPA-AS1的表達(dá)水平顯著降低，且隨著藥物劑量的增加而顯著降低，提示重樓皂苷Ⅰ可能通過(guò)下調(diào)LncRNA CEBPA-AS1的表達(dá)從而發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示干擾LncRNA CEBPA-AS1表達(dá)后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞存活率顯著降低，G0/G1期細(xì)胞比例顯著升高，S期細(xì)胞比例顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bax表達(dá)上調(diào)，Bcl-2表達(dá)下調(diào)，提示干擾LncRNA CEBPA-AS1表達(dá)可抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)本研究采用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)與qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)LncRNA CEBPA-AS1可靶向結(jié)合miR-195-5p，并可負(fù)向調(diào)控miR-195-5p的表達(dá)。研究表明miR-195-5p在非小細(xì)胞肺癌中可能發(fā)揮抑癌基因作用[16]。沉默AGAP2-AS1可能通過(guò)上調(diào)miR-195-5p的表達(dá)從而抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移及侵襲[17]。本研究結(jié)果顯示不同濃度的重樓皂苷Ⅰ處理后瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞中miR-195-5p的表達(dá)水平顯著升高，且隨著藥物劑量的增加而顯著升高，提示重樓皂苷Ⅰ可能通過(guò)上調(diào)miR-195-5p的表達(dá)從而發(fā)揮作用。為進(jìn)一步探究重樓皂苷Ⅰ是否可通過(guò)調(diào)控LncRNA CEBPA-AS1/miR-195-5p通路而發(fā)揮作用，本研究將LncRNA CEBPA-AS1過(guò)表達(dá)載體與重樓皂苷Ⅰ共同處理瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞存活率顯著升高，G0/G1期細(xì)胞比例顯著降低，S期細(xì)胞比例顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低，Bax蛋白水平顯著降低，Bcl-2蛋白水平顯著升高，提示LncRNA CEBPA-AS1過(guò)表達(dá)可降低重樓皂苷Ⅰ對(duì)瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及凋亡的作用。

綜上所述，重樓皂苷Ⅰ可抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能為通過(guò)下調(diào)LncRNA CEBPA-AS1的表達(dá)而上調(diào)miR-195-5p的表達(dá)從而發(fā)揮作用，可為進(jìn)一步揭示瘢痕疙瘩發(fā)病機(jī)制奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，還可為闡釋重樓皂苷Ⅰ治療瘢痕疙瘩的分子機(jī)制提供參考依據(jù)。

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[收稿日期]2020-08-13

本文引用格式：張翠，王珺，王凱波，等.重樓皂苷Ⅰ通過(guò)調(diào)控LncRNA CEBPA-AS1/miR-195-5p通路抑制瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡的初步研究[J].中國(guó)美容醫(yī)學(xué)，2021，30（9）：12-16.