嬰幼兒配方奶粉中生物素檢測(cè)的人員比對(duì)

梁穎思 黃家欣 陳秀芬 蘇妙貞 周露

(廣東省食品檢驗(yàn)所 廣東廣州 510435)

1 前言

生物素(Biotion)又稱(chēng)為維生素B7，它是一種維持人體自然生長(zhǎng)和正常人體機(jī)能所必須的水溶性維生素，但是人體無(wú)法通過(guò)自身代謝合成[1]。因其在食物中分布廣泛，所以一般情況下人體并不缺乏這種維生素，但是嬰兒腸道功能不完善，易導(dǎo)致缺乏生物素而患皮炎，且嬰幼兒在脫離母乳之后，飲食以配方奶粉及各類(lèi)輔食為主，因此需在嬰幼兒食品中添加適量的生物素以增加?jì)胗變簩?duì)生物素的攝取[1-2]。

實(shí)驗(yàn)室人員比對(duì)實(shí)驗(yàn)是指在相同的儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目、環(huán)境和設(shè)施條件下，對(duì)性能穩(wěn)定的操作對(duì)象，由不同的實(shí)驗(yàn)人員進(jìn)行試驗(yàn)。只研究1個(gè)實(shí)驗(yàn)因素即人員，因素中有2個(gè)水平，即檢驗(yàn)員A與檢驗(yàn)員B，通過(guò)對(duì)不同人員的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，研究人員之間的檢驗(yàn)數(shù)據(jù)有無(wú)顯著性差異[3]。人員比對(duì)是實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制中主要的有效措施之一，有助于了解實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力，為實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性、重現(xiàn)性、可驗(yàn)證性打下良好基礎(chǔ)；同時(shí)，通過(guò)內(nèi)部人員比對(duì)有助于了解自身不足，量化實(shí)驗(yàn)室系統(tǒng)誤差，以便采取相應(yīng)的完善措施[4]。

隨著國(guó)家對(duì)食品安全問(wèn)題愈發(fā)重視，對(duì)食品檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的能力要求也越來(lái)越高，作為食品微生物實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)當(dāng)不斷提高檢驗(yàn)員的檢測(cè)能力，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制[5]。本文按照GB 5009.259-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物素的測(cè)定》與內(nèi)部質(zhì)量控制技術(shù)要求的規(guī)定進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)檢驗(yàn)員的質(zhì)量控制，為本實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制提供可靠的數(shù)據(jù)，確保檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。

2 材料與方法

2.1 儀器與試劑

水浴鍋(德國(guó)ika/艾卡ICC basic eco 18)；Ph計(jì)(梅特勒-托利多)；離心機(jī)(Beckman Allegra 64R)；生物安全柜(新加坡ESCO)；生化培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(日本島津)；生物素檢測(cè)試劑盒(德國(guó)拜發(fā)公司)。

2.2 樣品及質(zhì)控樣品

嬰配樣品：廣東省食品檢驗(yàn)所提供的某品牌嬰兒配方奶粉2段(營(yíng)養(yǎng)成分表中生物素含量為12.0 μg/100 g)。

質(zhì)控樣品：購(gòu)于中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心的嬰幼兒配方乳粉(編號(hào)為QC-IP-017，證書(shū)結(jié)果證明樣品中生物素的含量指定值為26.00 μg/100 g，滿意值范圍為21.56～30.44μg/100 g)。

2.3 樣品處理

分別稱(chēng)取1 g樣品溶入30 ml蒸餾水；用HCl或NaOH調(diào)整pH至8.0±0.2，搖勻，用蒸餾水定容40 ml；95℃水浴30 min，每5 min震蕩1次，確保離心管塞緊閉；迅速冷卻至30℃以下；樣品過(guò)0.2μm獨(dú)立包裝無(wú)菌濾膜；樣品系列稀釋。

2.4 培養(yǎng)基制備

用鑷子取出培養(yǎng)基中的干燥劑袋，加入10 ml無(wú)菌水，95℃水浴5 min，每2 min震蕩1次，保持瓶子密封，水浴后迅速冷卻至室溫；用無(wú)菌濾膜過(guò)濾至一次性無(wú)菌離心管中。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)品的制備

標(biāo)準(zhǔn)品濃縮液：取試劑盒所帶無(wú)菌水2 ml至標(biāo)準(zhǔn)品瓶，混勻。

表1 生物素標(biāo)準(zhǔn)曲線制備表

2.6上板

取相應(yīng)數(shù)量的微孔板條至板架，分別加入150 μl的培養(yǎng)基和150μl的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品：

QC1 QC1 QC1 C1 Std1 Std1 Std1 C2 Std2 Std2 Std2 C3 Std3 Std3 Std3 Std4 Std4 Std4 Std5 Std5 Std5 P1 P1 P1 P2 P2 P2

用試劑盒中的密封膠片將所有微孔密封，然后在36℃黑暗條件下孵育48 h。

2.7 讀數(shù)

孵育完畢后，將微孔板倒置于桌面，進(jìn)行震蕩使其混勻；之后揭去粘合箔并去除微孔液體表面的氣泡，并盡快用酶標(biāo)儀在630 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行讀數(shù)。

2.8 結(jié)果計(jì)算

使用R-Biopharm公司提供的RidaWin軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

樣品中生物素含量(μg/100g)=(標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀取的樣品濃度×稀釋倍數(shù))/樣品總量

3 結(jié)果與分析

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

在“RidaWin”軟件中，以生物素標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制出準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～0.72μg/100 g范圍內(nèi)時(shí)，2名檢驗(yàn)員檢測(cè)生物素標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，分別為：R2=0.9994(圖1a)和R2=0.9978(圖1b)。檢驗(yàn)的R2值均大于0.99，符合標(biāo)準(zhǔn)GB/T 27404-2008[6]中線性回歸方程相關(guān)系數(shù)的要求。

3.2 樣品及質(zhì)控樣品中生物素的測(cè)定

對(duì)2名檢驗(yàn)員檢測(cè)結(jié)果(表2)進(jìn)行顯著性差異分析，發(fā)現(xiàn)兩者測(cè)定的生物素的數(shù)值差異不顯著(P>0.05)。

表2 二者對(duì)生物素測(cè)定的結(jié)果

乳粉質(zhì)控樣品生物素的測(cè)定值范圍是21.56～30.44μg/100g，指定值為26.00μg/100g。二者的測(cè)定值均在質(zhì)控樣品測(cè)定值的范圍內(nèi)，與指定值相比，檢驗(yàn)員A的測(cè)定值較低，為5.77%，檢驗(yàn)員B的測(cè)定值較高，為13.46%，均屬于可接受水平(±17.08%)。

測(cè)定結(jié)果根據(jù)內(nèi)部質(zhì)量控制的技術(shù)要求，進(jìn)行復(fù)現(xiàn)性計(jì)算，對(duì)各自的測(cè)定結(jié)果取對(duì)數(shù)值，以?xún)烧邔?shí)驗(yàn)結(jié)果之間的絕對(duì)差值不大于復(fù)現(xiàn)性限為結(jié)果滿意[7]，此次的人員比對(duì)復(fù)現(xiàn)性R=0.03(R<0.45)，故此次人員比對(duì)結(jié)果為滿意。

4 結(jié)論

基于王晶、梁美丹、張旺、周敏等人的研究探索[8-11]，試劑盒法操作簡(jiǎn)單，利于實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用與樣品檢驗(yàn)，且國(guó)標(biāo)法中亦有提到試樣提取液也可采用預(yù)先包埋了菌種的微生物法生物素試劑盒測(cè)定，效果相當(dāng)[12]，故本次人員比對(duì)采用了試劑盒法進(jìn)行試驗(yàn)。

生物素檢測(cè)方法有多種，包括微生物法、色譜法、熒光法等，當(dāng)前，生物素微生物檢測(cè)法被美國(guó)AOAC和中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)選定為仲裁方法，方法原理是利用植物乳桿菌對(duì)有活性生物素的特異性，從而檢測(cè)出生物素[9]。在本文中基于微生物檢測(cè)的原理，使用試劑盒法對(duì)2名檢驗(yàn)員進(jìn)行嬰幼兒配方奶粉中生物素檢測(cè)的人員比對(duì)，從比對(duì)結(jié)果可知兩者測(cè)定的生物素的結(jié)果差異不顯著，兩者的測(cè)定結(jié)果均表明該奶粉中生物素的含量符合營(yíng)養(yǎng)成分表(生物素含量>12.0μg/100g)。

本文在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行了多次預(yù)實(shí)驗(yàn)，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)一些問(wèn)題：標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系不好(R2<0.99)；因估算不準(zhǔn)，樣品稀釋倍數(shù)選取不正確，導(dǎo)致測(cè)出結(jié)果不在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)；個(gè)別微孔讀取的樣品濃度平行性差異較大。

通過(guò)對(duì)檢測(cè)步驟加以分析總結(jié)，得出以下實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)：該實(shí)驗(yàn)易受外界因素干擾，在操作中注意無(wú)菌的同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中所使用到的器皿還須避免各種雜質(zhì)的干擾，特別是玻璃器皿，在使用前應(yīng)用2%的鹽酸液浸泡數(shù)小時(shí)，洗凈烘干后再使用；在樣品處理時(shí)，注意稀釋倍數(shù)的選取，若估算不準(zhǔn)，應(yīng)嘗試多個(gè)稀釋度，并注意稀釋液的均勻性；在上板時(shí)因加樣量大，要謹(jǐn)慎細(xì)致，加液體時(shí)沿孔壁加入，以防液體飛濺污染其它孔影響試驗(yàn)結(jié)果；讀數(shù)前須將板內(nèi)培養(yǎng)物充分混勻并保證讀數(shù)時(shí)每孔的空氣都排盡，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。

綜上所述，通過(guò)人員比對(duì)，可以分析總結(jié)在實(shí)驗(yàn)中易出現(xiàn)的問(wèn)題，提高檢驗(yàn)員的檢測(cè)能力，從而提升實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)水平。應(yīng)定期開(kāi)展內(nèi)部人員比對(duì)進(jìn)行質(zhì)量控制，確保檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。并注意保存每次實(shí)驗(yàn)的樣品信息和數(shù)據(jù)結(jié)果，為之后的測(cè)定提供參考，提高檢測(cè)效率。