王曉龍 陳亮 曹洪濤 林波 湯婷婷 馬克強(qiáng) 嵇騰飛 曹天生 王健 張文偉 楊建榮 盧卓才 由田 何青青 繆巍
胃癌是消化系統(tǒng)常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤,是全球第3大腫瘤相關(guān)性死亡的原因[1]。幽門(mén)螺桿菌、飲食、遺傳因素等與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及其表達(dá)的細(xì)胞因子、趨化因子等在胃癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用[3]。Chemokine(C-C motif) ligand 22(CCL22)是巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等表達(dá)的一種趨化因子,可以識(shí)別并趨化表達(dá)CCR4的T-reg細(xì)胞、Th2細(xì)胞等,抑制機(jī)體針對(duì)病原體、腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng),促進(jìn)病原體持續(xù)感染、腫瘤發(fā)展[4-5]。胃癌組織中CCR4表達(dá)水平增高[6]。本研究收集胃癌病人外周血標(biāo)本,檢測(cè)外周血中CCL22表達(dá)水平,并分析其表達(dá)水平與胃癌臨床分期的相關(guān)性,研究CCL22對(duì)胃癌細(xì)胞的趨化作用,探討CCL22在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用。
2016年1月~2019年1月在青海大學(xué)附屬醫(yī)院和南方醫(yī)科大學(xué)附屬花都醫(yī)院胃腸外科住院的胃癌病人55例,男性40例,女性15例,年齡41~65歲,平均年齡50.3歲,經(jīng)病理學(xué)檢查確診。按胃癌最新分期標(biāo)準(zhǔn)分期:Ⅰ期10例,Ⅱ期17例,Ⅲ期13例,Ⅳ期15例。術(shù)前檢查未發(fā)現(xiàn)主要臟器的器質(zhì)性病變,未行放化療或生物治療。對(duì)照組30例,男性24例,女性6例,年齡38~58歲,平均年齡48.2歲,為健康體檢者。所有入組者無(wú)并發(fā)HIV、乙型或丙型病毒性肝炎,未使用免疫抑制劑,排除自身免疫性疾病。
1.標(biāo)本收集:于晨起采空腹肘靜脈血10 ml,5 ml裝入干燥無(wú)菌非抗凝真空管,室溫靜置60分鐘后自行凝固,再以1 500 r/min離心12分鐘,取上清用EP管分裝,放入超低溫冰箱保存。5 ml放入無(wú)菌含肝素的抗凝管,F(xiàn)icoll密度梯度離心法分離、純化外周血單個(gè)核細(xì)胞。
2.總RNA提取及定量PCR:細(xì)胞總RNA提取采用用Trizol試劑盒(Invitrogen公司)。細(xì)胞總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Toyobo公司,Japan)。然后用real-time PCR Faststart Universal SYBR Green Master(Rox)試劑(Roche公司)擴(kuò)增。擴(kuò)增CCL22的引物如下[7]:F:5'-ATTACGTCCGTTACCGTCTGC-3',R:5'-TCCCTGAAGGTTAGCAACACC-3'。
3.ELISA :血清中CCL22蛋白表達(dá)水平用美國(guó)R&D公司ELISA試劑盒(貨號(hào):DMD00)檢測(cè),具體步驟按說(shuō)明書(shū)操作。
4.趨化實(shí)驗(yàn):用Biocoat細(xì)胞培養(yǎng)小室(Biocoat Invasion Chamber,BD公司)檢測(cè)CCL22對(duì)胃癌細(xì)胞株SNU216的趨化作用。將5×105個(gè)胃癌細(xì)胞置入chamber上層,加入或不加入不同濃度的CCR4抗體(Santa Cruz公司),用無(wú)血清dulbecco's modified eagle medium(DMEM)培養(yǎng)液培養(yǎng),將CCL22蛋白加入chamber下層,將chamber放入培養(yǎng)箱孵育,6~24小時(shí)后Giemsa染色,光鏡下計(jì)數(shù),檢測(cè)CCL22對(duì)胃癌細(xì)胞遷移的作用。
采用SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)。組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)或方差分析。相關(guān)性分析采用Pearson's相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
1.外周血中CCL22 RNA表達(dá)見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示,胃癌組CCL22mRNA表達(dá)高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
圖1 兩組病人外周血中CCL22 mRNA表達(dá)水平
2.外周血中CCL22蛋白質(zhì)表達(dá)見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示,胃癌組CCL22蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05) 。
圖2 兩組病人外周血中CCL22蛋白質(zhì)表達(dá)水平
3.外周血中CCL22表達(dá)水平見(jiàn)表1。結(jié)果顯示,胃癌組病人外周血CCL22表達(dá)水平隨胃癌分期而逐漸增高。
表1 不同胃癌分期病人外周血CCL22表達(dá)(pg/ml)
4.CCL22可趨化胃癌細(xì)胞:如圖3所示,CCL22呈劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株SNU216遷移(圖3A)。加入CCR4抗體阻斷CCL22誘導(dǎo)的SNU216細(xì)胞遷移(圖3B)。
圖3 A:CCL22誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞遷移;B:CCR4抗體阻斷CCL22誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞遷移
本研究發(fā)現(xiàn),胃癌病人外周血中趨化因子CCL22表達(dá)增高,且其表達(dá)水平隨胃癌分期而逐漸增高,CCL22呈劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞遷移。CCL22是一種趨化因子,可以趨化Treg細(xì)胞、Th2細(xì)胞、單核細(xì)胞等,抑制機(jī)體針對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng),促進(jìn)腫瘤發(fā)展[4-5]。
有研究證實(shí),胃癌組織中Treg細(xì)胞數(shù)量增多,且Treg細(xì)胞表面CCR4表達(dá)增高[8],而CCR4是CCL22識(shí)別并結(jié)合的受體。CCL22識(shí)別并結(jié)合表達(dá)CCR4的免疫細(xì)胞,發(fā)揮趨化作用。CCL22通過(guò)與CCR4識(shí)別、結(jié)合,趨化Treg細(xì)胞等免疫細(xì)胞聚集至胃癌組織,改變腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞的組成,在腫瘤局部發(fā)揮免疫抑制作用,有利于腫瘤的生長(zhǎng)。因此,本研究推測(cè)針對(duì)CCL22的表達(dá)可能作為治療胃癌的一個(gè)靶點(diǎn)。
有研究發(fā)現(xiàn),胃癌組織中趨化因子CCL20、CCL17表達(dá)增高[1,9],CCL20通過(guò)識(shí)別結(jié)合表達(dá)CCR6、CCL17通過(guò)識(shí)別結(jié)合表達(dá)CCR4的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)至胃癌組織,參與胃癌的發(fā)病。本研究發(fā)現(xiàn),胃癌病人外周血中CCL22表達(dá)增高,且其表達(dá)水平與胃癌分期呈正相關(guān),而CCL22亦可識(shí)別并結(jié)合CCR4,發(fā)揮趨化作用。研究報(bào)道胃癌細(xì)胞表達(dá)CCR4[10]。我們利用細(xì)胞模型進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn),研究發(fā)現(xiàn),CCL22呈劑量依賴(lài)性誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞遷移,CCR4抗體可阻斷CCL22誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞遷移。因此,CCL22可能通過(guò)識(shí)別結(jié)合表達(dá)CCR4的免疫細(xì)胞參與胃癌的發(fā)生發(fā)展,亦可能通過(guò)識(shí)別結(jié)合表達(dá)CCR4的胃癌細(xì)胞促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移。
綜上所述,胃癌病人外周血中CCL22表達(dá)增高,其表達(dá)水平隨胃癌分期而逐漸增高,CCL22可趨化胃癌細(xì)胞遷移,CCL22可能參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移。