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    急性顱腦損傷病人血清外泌體中泛素碳末端水解酶L1和神經(jīng)絲蛋白輕鏈多肽的表達(dá)及意義

    2021-11-03 01:01:18徐正芹李楊劉汪旺葉柳
    臨床外科雜志 2021年10期
    關(guān)鍵詞:軸索外泌體外周血

    徐正芹 李楊 劉汪旺 葉柳

    創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury,TBI)致殘率亦高。對于TBI病人的評估,除影像學(xué)以外,尋找TBI損傷相關(guān)生物標(biāo)志物是研究熱點。泛素碳末端水解酶L1(ubiquitin carboxy terminal hydrolases L1,UCH-L1)及神經(jīng)絲蛋白輕鏈多肽(neurofilament light polypeptide,NF-L)在TBI病人血清中表達(dá)升高,可反映TBI的損傷程度及進(jìn)展情況[1-2]。外泌體是一種分泌的細(xì)胞外小泡,攜帶一系列脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA和RNA,外泌體可很容易地通過血腦屏障進(jìn)入外周循環(huán),顯示了在各種神經(jīng)疾病中作為有效生物標(biāo)志物的潛力[3]。我們檢測TBI病人外周血中外泌體UCH-L1及NF-L蛋白的表達(dá),評估其對TBI損傷程度及預(yù)后的價值。

    對象與方法

    一、對象

    2017年1月~2020年8月在我院就診的中、重度TBI病人94例(觀察組),入院后常規(guī)行頭部CT檢查。同期健康體檢人群52例作為對照組。觀察組男53例,女41例,年齡18~65歲,平均年齡(45.1±11.2)歲,對照組男30例,女22例,年齡21~60歲,平均年齡(44.6±9.8)歲,兩組年齡、性別等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)中、重度TBI病人,入院時格拉斯哥昏迷評分(GCS)≤12分;(2)同意參與本次研究。排除標(biāo)準(zhǔn):年齡<18歲;入院時間距受傷時間>2小時;GCS=3或雙側(cè)瞳孔固定擴(kuò)張;頭部CT提示無異常;合并有可能影響生物標(biāo)志物濃度的其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病,如神經(jīng)退行性疾病、中風(fēng)史或腦血管事件等,或者懷孕。本研究獲得我院倫理委員會批準(zhǔn),經(jīng)受試者知情同意后采集標(biāo)本。

    二、方法

    1.標(biāo)本處理:觀察組病人分別于受傷后2小時、12小時、24小時、48小時、72小時,各抽取外周血約5 ml。于室溫下4 000Xg離心10分鐘,立即放置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。對照組于入院后2小時、12小時、24小時、48小時、72小時各抽取外周血5 ml,血液樣本處理與觀察組相同。觀察組病人入院后完善相關(guān)檢查,如頭顱CT、影像學(xué)評估損傷程度,是否合并腦水腫及是否彌漫性軸索損傷或局灶性軸索損傷等。每例病人均按照顱腦外傷診治規(guī)范予以對癥處理。統(tǒng)計入院后1周內(nèi)觀察組病人死亡人數(shù)。

    2.外泌體中UCH-L1及NF-L蛋白的檢測:樣品取0.5 ml解凍,4 ℃、3 000Xg離心15分鐘以去除碎片。加入ExoQuick溶液(System Biosciences公司),于4 ℃孵育1小時,1 500Xg離心30分鐘。離心后的上層清液用250 μl PBS重懸。使用Nanosight NS300納米顆粒跟蹤分析儀(NanoSight)對樣品進(jìn)行直徑(nm)和濃度分析。濃度測定后,每個樣品用哺乳動物蛋白提取試劑(M-PER,Thermo Scientific公司)裂解外泌體,采用蛋白酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA法)檢測UCH-L1(ab244963,abcam公司)和NF-L(ab272366,abcam公司)濃度。用BIO-RAD680型全自動酶標(biāo)儀獲取讀數(shù)。

    三、統(tǒng)計學(xué)方法

    結(jié)果

    1.兩組UCH-L1及NF-L蛋白濃度比較見圖1。對照組2~72小時過程中UCH-L1及NF-L蛋白濃度均無明顯變化,分別為(11.34±0.62)pg/ml及(1.23±0.37)pg/ml。觀察組病人于受傷后12小時開始,外周血外泌體中UCH-L1及NF-L蛋白濃度即出現(xiàn)升高,其中UCH-L1蛋白濃度于12小時達(dá)到高峰,后逐步下降,但各時間點均高于對照組,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與UCH-L1蛋白濃度變化不同,NF-L蛋白濃度逐漸升高,2小時、12小時、24小時、48小時、72小時NF-L蛋白濃度分別為(1.11±0.38)、(5.43±2.32)、(8.39±1.23)、(9.12±1.64)及(11.43±2.45)pg/ml,與對照組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

    圖1 兩組外周血外泌體UCH-L1蛋白濃度變化比較

    圖2 兩組外周血外泌體NF-L蛋白濃度變化比較

    2.外泌體中UCH-L1及NF-L蛋白濃度與臨床特征的關(guān)系見表1及表2。結(jié)果表明,UCH-L1及NF-L蛋白濃度與年齡、性別及是否合并腦水腫均無關(guān),UCH-L1與病灶是否彌漫性或局灶性亦無關(guān),但NF-L能很好區(qū)分彌漫性損傷或局灶性損傷,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

    表1 觀察組外泌體中UCH-L1蛋白濃度與臨床特征的關(guān)系(pg/ml)

    表2 觀察組外泌體中NF-L蛋白濃度與臨床特征的關(guān)系(pg/ml)

    3.外泌體中UCH-L1蛋白對死亡預(yù)測的作用:觀察組94例有12例病人UCH-L1蛋白的濃度變化與其他82例明顯不同,呈持續(xù)升高趨勢,而其他82例病人UCH-L1蛋白濃度于12小時達(dá)到高峰后即逐步下降,兩者比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。此12例病人均于入院后1周內(nèi)死亡,余82例未出現(xiàn)死亡。說明外泌體中UCH-L1蛋白可以預(yù)測TBI病人早期死亡率。

    圖3 觀察組不同預(yù)后病人UCH-L1濃度變化比較

    討論

    影像學(xué)檢查在評估TBI病情中具有重要作用,如顱腦CT、普通核磁共振以及磁共振彌散張量成像(DTI)等,前兩種檢查敏感性不高,后者為評估創(chuàng)傷性軸索損傷的有效手段,但成本較高,且要求繁瑣的圖像后處理。尋找可用于預(yù)測TBI嚴(yán)重程度以及預(yù)后的生物標(biāo)志物,正成為研究的熱點[4]。除血清等傳統(tǒng)來源的標(biāo)志物之外,外泌體的研究也受到關(guān)注。

    外泌體是一種細(xì)胞外囊泡,廣泛存在于血液、腦脊液等各種體液中,可以攜帶來源細(xì)胞的信息,包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA及RNA等,進(jìn)行細(xì)胞間信號傳導(dǎo),參與各種重要的生理功能[5]。比如,在神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞之間傳遞細(xì)胞介質(zhì),促進(jìn)相互作用[6]。外泌體可以自由出入血腦屏障,這就為在外周循環(huán)中檢測中樞系統(tǒng)來源外泌體提供了可能。本研究表明,中、重度TBI病人發(fā)病早期,外周血外泌體中UCH-L1及NF-L升高,與對照組比較有明顯差異;同時,NF-L可以區(qū)分彌漫性或局灶性軸索損傷,UCH-L1可以預(yù)測發(fā)病早期死亡率。

    UCH-L1是一種半胱氨酸泛素蛋白水解酶,特異性地存在于神經(jīng)元中,曾被用作神經(jīng)元的組織學(xué)標(biāo)志物。UCH-L1在清除神經(jīng)元中過量或錯誤折疊的蛋白質(zhì)過程中發(fā)揮重要作用[7]。神經(jīng)絲蛋白(NF)是神經(jīng)元細(xì)胞骨架的重要組成部分。研究表明,UCH-L1及NF-L 均在不少種類的神經(jīng)退行性疾病中參與了其發(fā)病過程[8]。有研究證實,在TBI發(fā)病后,血清中UCH-L1及NF-L水平升高,這兩種蛋白可以作為TBI潛在的生物標(biāo)志物[9]。本研究結(jié)果表明,在中、重度TBI病人發(fā)病早期,外周血外泌體中UCH-L1及NF-L升高,UCH-L1蛋白濃度于12小時達(dá)到高峰,后逐步下降,但各時間點均明顯高于對照組相應(yīng)數(shù)值,而NF-L蛋白濃度呈持續(xù)升高,兩者分別與對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。說明中、重度TBI病人外周血外泌體中UCH-L1及NF-L有可能成為有價值的生物標(biāo)志物。本研究還發(fā)現(xiàn),NF-L可以很好地區(qū)分彌漫性或局灶性軸索損傷,UCH-L1可以預(yù)測發(fā)病早期死亡率。

    彌漫性軸索損傷(diffusion axonal injury,DAI)是TBI病人的主要神經(jīng)病理改變,主要是由于外力致頭部短時間內(nèi)突然加速及減速,腦白質(zhì)軸索纖維受到拉伸和剪切力,從而引起軸索的破壞和斷開[10]。傳統(tǒng)的神經(jīng)影像學(xué)如CT及MRI敏感性低,而DTI技術(shù)仍不是臨床常規(guī),效果仍有待觀察。AI等[11]及Pashtun等[12]研究指出,在受傷早期,血清NF-L 的濃度變化并不能反映DAI的嚴(yán)重程度。Johan等[13]研究指出,血清NF-L與DAI正相關(guān),但Johan等的研究僅收集了9例病人,證據(jù)級別較低。這些研究結(jié)果說明,至少在目前看來,血清NF-L水平尚不能很好地反映DAI。我們的結(jié)果證實外周血外泌體NF-L水平能很好地區(qū)分彌漫性或局灶性軸索損傷,是反映DAI的敏感指標(biāo)。之所以出現(xiàn)血清與外泌體中NF-L濃度與DAI之間關(guān)系的不一致,我們分析,可能是由于外泌體由受損神經(jīng)元細(xì)胞或膠質(zhì)分泌,通過血腦屏障進(jìn)入外周循環(huán),其包膜結(jié)構(gòu)能很好地保護(hù)外泌體內(nèi)物質(zhì)的完整性,所以外泌體內(nèi)NF-L蛋白濃度能較真實地反映腦損傷的程度。而外周血NF-L的濃度受較多因素的影響,比如可能受外周循環(huán)其他細(xì)胞因子的調(diào)控,以維持NF-L濃度在體內(nèi)的平衡,這樣外周血血清中NF-L蛋白的濃度就不一定能反映真實的腦損傷情況。當(dāng)然,具體的相關(guān)機(jī)制,仍有待于進(jìn)一步研究。

    我們的研究結(jié)果還顯示,在94例TBI觀察組病人中,外泌體UCH-L1蛋白濃度整體上呈現(xiàn)升高后再下降的趨勢,但其中有12例病人UCH-L1蛋白的濃度變化與其他82例明顯不同,是呈持續(xù)升高趨勢,這12例病人均于入院后1周內(nèi)死亡,可以用以幫助鑒別出受傷后早期可能出現(xiàn)死亡的病人,采用不同治療手段干預(yù)。

    本研究也存在局限。樣本量較小,外泌體中UCH-L1蛋白表達(dá)的差異情況是普遍規(guī)律還是個別現(xiàn)象,外泌體中NF-L濃度與DAI之間的關(guān)系,仍有待于更大規(guī)模的臨床研究來進(jìn)一步證實

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