miR-10b、LMP1和Twist1聯(lián)合檢測在鼻咽癌早期診斷及復(fù)發(fā)診斷中的應(yīng)用

魏曉 陳鵬 張艷

鼻咽癌是一類高發(fā)惡性腫瘤，多發(fā)生于咽隱窩、鼻咽頂壁等處，目前全球范圍內(nèi)每年發(fā)病人數(shù)高達八萬以上，病死人數(shù)接近五萬［1-2］。研究顯示，該病對放化療表現(xiàn)出較高的敏感性，患者在疾病發(fā)現(xiàn)早期進行積極治療后五年生存率可達到80%，但部分患者進展至中晚期后腫瘤遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移、局部浸潤程度較高，其預(yù)后生存情況并不理想［3-4］。微小RNA（microRNA，miRNA）作為參與細(xì)胞增殖、代謝、凋亡的重要RNA 分子，在機體腫瘤、炎癥病變中發(fā)揮重要參與作用［5］。其中miR-10b基因可在肝癌、腎癌等多種惡性腫瘤患者腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中出現(xiàn)表達異常；與潛伏膜蛋白1（Latent membrane protein 1，LMP1）相關(guān)的EB 病毒與鼻咽癌關(guān)系緊密，LMP1 作為此類病毒的基因產(chǎn)物，具有一定的癌基因功能，可參與此類疾病病情進展［6-7］；Twist 相關(guān)蛋白1（Twist related protein 1，Twist1）則在褐色脂肪代謝、胚胎發(fā)育中作用關(guān)鍵，其可于多種腫瘤中有所表達［8］。目前臨床對上述指標(biāo)與鼻咽癌診斷的研究較少，本次研究將探究其水平在鼻咽癌早期診斷以及復(fù)發(fā)診斷中的效能?，F(xiàn)將所得成果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年6月至2019年12月期間于鄭州頤和醫(yī)院行各項檢查的82 例疑似鼻咽癌受檢者臨床資料，根據(jù)后續(xù)實際診斷結(jié)果分為確診組51 例與未確診組31 例，將確診組根據(jù)后續(xù)實際復(fù)發(fā)情況分為復(fù)發(fā)組23 例與未復(fù)發(fā)組28 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均于本院接受各項相關(guān)檢查；②復(fù)發(fā)組患者均符合中國抗癌協(xié)會鼻咽癌專業(yè)委員會制定的《復(fù)發(fā)鼻咽癌治療專家共識》相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］；③所有人員均為初次診治，未經(jīng)相關(guān)治療，且臨床資料保存完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在嚴(yán)重感染狀態(tài)者；②合并頜面部周圍組織嚴(yán)重病變或其他類型惡性腫瘤者。受檢者一般資料：男62 例，女20 例；平均年齡（46.39±12.36）歲。確診組患者TNM 分期［10］：Ⅰ期11 例，Ⅱ期40 例；腫瘤轉(zhuǎn)移情況：伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移33例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18 例。

1.2 方法

采用實時熒光定量PCR 法檢測血清miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 水平，收集受檢者靜脈血10 mL，經(jīng)3 500 r/min 離心10 min 后分離血清，采用Trizol reagent RNA 提取試劑盒對血清中RNA 進行提取檢測，并以Nanodrop 判斷RNA 濃度，隨后將RNA 作為模板逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，miR-10b上游引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTG-GAGTCGGCAATTCAGTTGAGCACAAATT-3′，下游引物序列：5′-GTGTCGTGGAGTCGGCAATTC-3′；LMP1上游引物序列：5′-ACACACTGCCCTGAGGATG-3′，下游引物序列：5′-TGAGCAGGAGGGTGATCA-3′；Twist1上游引物序列：5′-CAAGCTGCAGCTATGTGGC-3′，下游引物序列：5′-TGTCCATTTTCTCCTTCTCTGG-3′。miR-10b在95℃下進行30 s 預(yù)變性以及5 s 變性，隨后60℃下進行30 s 退火，并于70℃進行30 s 延伸，循環(huán)共持續(xù)40 個；LMP1、Twist1 在95℃下進行60 s 預(yù)變性以及20 s 變性，隨后58℃下進行25 s 退火，并于70℃進行30 s 延伸，循環(huán)同樣持續(xù)40 個。隨后通過2-ΔΔCT法對上述三個指標(biāo)相對表達量進行測定。

1.3 觀察指標(biāo)

比較確診組與未確診組血清miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 水平，采用受試者工作特征（ROC）曲線評估上述指標(biāo)各自對鼻咽癌的早期診斷效能及聯(lián)合診斷效能；比較復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組血清miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 水平，采用ROC 曲線評估上述指標(biāo)各自對鼻咽癌復(fù)發(fā)的診斷效能及聯(lián)合診斷效能。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 21.0 分析數(shù)據(jù)，計量資料用（）表示，采用獨立樣本t檢驗進行組間比較，診斷效能分析采用ROC 曲線，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 確診組與未確診組血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA 水平比較

確診組血清miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 水平均顯著高于未確診組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 確診組與未確診組血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA 水平比較（±s）Table 1 Comparison of levels of serum miR-10b，LMP1 mRNA and Twist1 mRNA between confirmed group and unconfirmed group（±s）

表1 確診組與未確診組血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA 水平比較（±s）Table 1 Comparison of levels of serum miR-10b，LMP1 mRNA and Twist1 mRNA between confirmed group and unconfirmed group（±s）

組別確診組未確診組t 值P 值n 51 31 miR-10b 7.86±1.42 5.78±1.03 7.092＜0.001 LMP1 mRNA 4.83±0.92 3.32±0.76 7.678＜0.001 Twist1 mRNA 4.12±0.89 2.78±0.65 7.278＜0.001

2.2 血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA早期診斷鼻咽癌的效能分析

血清miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 聯(lián)合早期診斷鼻咽癌的ROC 曲線AUC 為0.978，優(yōu)于單一診斷（P＜0.05）。見表2、圖1。

表2 ROC 曲線參數(shù)Table 2 ROC curve parameters

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curve

復(fù)發(fā)組miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA水平均顯著高于未復(fù)發(fā)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

表3 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA 水平比較（±s）Table 3 Comparison of levels of serum miR-10b，LMP1 mRNA and Twist1 mRNA between recurrence group and non-recurrence group（±s）

表3 復(fù)發(fā)組與未復(fù)發(fā)組血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA 水平比較（±s）Table 3 Comparison of levels of serum miR-10b，LMP1 mRNA and Twist1 mRNA between recurrence group and non-recurrence group（±s）

組別復(fù)發(fā)組未復(fù)發(fā)組t 值P 值n 23 28 miR-10b 8.76±1.02 7.12±1.26 5.030＜0.001 LMP1 mRNA 5.44±0.92 4.32±0.97 4.198＜0.001 Twist1 mRNA 4.62±0.86 3.70±0.75 4.080＜0.001

2.4 血清miR-10b、LMP1 mRNA、Twist1 mRNA診斷鼻咽癌復(fù)發(fā)的效能分析

miR-10b、LMP1mRNA、Twist1mRNA 診斷鼻咽癌復(fù)發(fā)的ROC 曲線AUC 分別為0.804、0.818、0.733，三者聯(lián)合診斷AUC 為0.932（P＜0.05），見表4、圖2。

表4 ROC 曲線參數(shù)Table 4 ROC curve parameters

圖2 ROC 曲線Figure 2 ROC curve

3 討論

鼻咽癌是國內(nèi)頭頸部惡性腫瘤中常見的類型，早期診斷及治療極為重要，目前放療作為其早期主要治療方式具備顯著療效，但不良反應(yīng)較多，且面臨局部復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移風(fēng)險［11］，故臨床仍需進一步探究用于其早期診斷及復(fù)發(fā)診斷的標(biāo)志物。

人類2q31 HOXD 基因簇中的miR-10b編碼基因可通過與下游靶基因3'-非編碼區(qū)相結(jié)合達成對多種靶基因表達的調(diào)控，在機體出現(xiàn)心血管病變、自身免疫性疾患以及惡性腫瘤后，其表達可發(fā)生明顯異常變化。孫秀英等［12］研究發(fā)現(xiàn)鼻咽癌患者癌組織miR-10b 與LMP1、Twist1mRNA 的表達呈正相關(guān)，與鼻咽癌腫瘤TNM 分期亦有顯著相關(guān)性。王述蓮等［13］研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌患者發(fā)病過程中可伴隨miR-10b 水平的上升，而在相關(guān)體外實驗中亦發(fā)現(xiàn)miR-10b 可促進腫瘤細(xì)胞侵襲過程。EB病毒作為一類嗜淋巴細(xì)胞病毒，在人體感染后大多處于潛伏狀態(tài)，而在腫瘤病情進展等條件下可進行二次復(fù)制，并通過病毒編碼產(chǎn)生LMP1，以達到促進腫瘤細(xì)胞增殖、抑制其凋亡并誘導(dǎo)B 淋巴細(xì)胞分化的作用。陳俊妮等［14］研究發(fā)現(xiàn)，LMP1 與鼻咽癌患者腫瘤分期、頸部淋巴結(jié)體積等具有顯著相關(guān)性，可作為預(yù)測鼻咽癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的重要分子標(biāo)志物。本研究中，上述兩種指標(biāo)均在確診組患者中呈高表達水平，且腫瘤復(fù)發(fā)患者表達水平高于未復(fù)發(fā)患者。ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，miR-10b、LMP1 在鼻咽癌早期診斷及復(fù)發(fā)診斷中效能顯著，與上述研究結(jié)果相似。此外，miR-10b 屬于致癌miRNA，可對巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶8 發(fā)揮一定調(diào)控作用，使蛋白激酶信號通路得以激活，從而加劇腫瘤細(xì)胞增殖及局部浸潤，另一方面，其表達水平的上升可對同源性磷酸酶張力蛋白基因等抑癌基因表達產(chǎn)生一定抑制作用，有利于腫瘤細(xì)胞增殖。吳克復(fù)等［15］研究指出，EB 病毒隱性感染可誘發(fā)免疫失調(diào)，引起機體免疫失控、局部淋巴增生及超炎癥狀態(tài)，有助于鼻咽癌等惡性腫瘤形成，此外EB 病毒感染引發(fā)的代謝類型改變亦可支持病毒持續(xù)感染，此類改變亦可能導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。在鼻咽癌發(fā)生后EB 病毒可從潛伏狀態(tài)活化，從而導(dǎo)致LMP1mRNA 水平上升，使LMP1作為活性受體激活蛋白激酶途徑、核因子κB 等多種胞內(nèi)信號通路，使血管內(nèi)皮生長因子、基質(zhì)金屬蛋白酶等癌基因表達上升，促進腫瘤增殖、遷移。

Twist1基因可參與神經(jīng)管閉合、神經(jīng)發(fā)育以及褐色脂肪代謝等過程的調(diào)節(jié)，其屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋蛋白家族中高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，在胚胎發(fā)育過程中可調(diào)節(jié)組織重建，達到促進細(xì)胞遷移的作用，此外Twist1亦是促進多種腫瘤轉(zhuǎn)移、侵襲的關(guān)鍵基因，在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中也可發(fā)揮重要作用［16］。本研究中，Twist1 在確診組及復(fù)發(fā)組中表達水平更高，且經(jīng)ROC 曲線分析發(fā)現(xiàn)，Twist1 在鼻咽癌早期診斷及復(fù)發(fā)診斷中效能顯著，與上述研究背景相似。分析其原因，Twist1 作為轉(zhuǎn)錄因子可誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，使上皮細(xì)胞發(fā)生形態(tài)學(xué)改變向間充質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變，并因此獲得遷移能力，使上皮細(xì)胞或組織分離、遷移至其他部位。故認(rèn)為Twist 誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化程序為鼻咽癌轉(zhuǎn)移啟動的重要原因。

綜上所述，血清miR-10b、LMP1、Twist1 可應(yīng)用于鼻咽癌早期診斷及復(fù)發(fā)診斷，其聯(lián)合應(yīng)用可表現(xiàn)出更佳診斷效能。