NGAL、KIM-1、Th17細(xì)胞檢測(cè)對(duì)膿毒癥AKI患者預(yù)后的評(píng)估

楊火保 劉進(jìn)生 鄭彩罰

膿毒癥是急診科常見(jiàn)的危重情況之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界每年有2 500 萬(wàn)膿毒癥患者，有近800 萬(wàn)人因此失去生命，膿毒癥致死率高于乳腺癌、艾滋病、前列腺癌三種疾病總和［1］。膿毒癥常會(huì)引起多器官功能障礙，其中急性腎損傷（Acute kidney injury，AKI）是導(dǎo)致患者死亡率上升的重要原因之一。研究顯示，膿毒癥患者中有近40%可并發(fā)AKI，且膿毒癥所引起的AKI 預(yù)后比常規(guī)AKI 差，存活率低，存活患者常會(huì)伴有慢性腎臟損害，對(duì)患者預(yù)后健康與生活質(zhì)量均有嚴(yán)重不良影響［2］。連續(xù)性腎臟代替治療（Continuous renal replacement therapy，CRRT）是目前治療AKI 常用手段，作為體外循環(huán)血液凈化方式，CRRT 是具有良好血流動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性的腎臟代替治療模式，可有效改善多臟器功能。有研究表明，使用膿毒癥AKI 相關(guān)生物標(biāo)記物可在一定程度上為患者預(yù)后評(píng)估提供參考，但對(duì)于多種生物標(biāo)記物聯(lián)合應(yīng)用是否可提高對(duì)膿毒癥AKI 患者預(yù)后價(jià)值的研究較少［3］?；诖?，本研究將分析中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（Neutrophil gelatinase associated lipocalin，NGAL）、尿腎損傷分子-1（Kidney damage molecule-1，KIM-1）、外周血Th17 細(xì)胞在膿毒癥AKI患者中的表達(dá)情況，以期了解三者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)膿毒癥AKI 患者經(jīng)CRRT 治療預(yù)后的評(píng)估價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019年1月 至2020年3月69 例在本院行CRRT 治療的膿毒癥AKI 患者設(shè)為AKI 組，其中男41 例，女28 例，平均年齡為（52.16±6.80）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①臨床資料完整；②符合《國(guó)際嚴(yán)重膿毒癥和膿毒性休克治療指南》中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］；并符合AKI 診斷標(biāo)準(zhǔn)：48 h 內(nèi)血清肌酐水平升高≥26.5 μmol/L，或增加≥基線水平50%；持續(xù)6 h 尿量＜0.5 mL/（kg·h）［5］。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并存在心、肝、腎等嚴(yán)重原發(fā)性疾病；②為終末期腎臟疾病者；③長(zhǎng)期進(jìn)行血液透析治療者；④近3 個(gè)月有使用免疫抑制劑治療者。另選取68 例于本院同期行CRRT 治療的單純AKI 患者作為對(duì)照組，其中男39 例，女29 例，平均年齡為（52.33±6.54）歲，兩組患者在一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，受試者或其家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 CRRT 治療方法

患者均使用連續(xù)靜脈血過(guò)濾模式進(jìn)行治療，在患者股靜脈或頸內(nèi)靜脈建立血管通路，使用美國(guó)BM25 機(jī)器以及德國(guó)1.3 m2AV600 聚鞏膜濾器進(jìn)行治療。血流量在200～250 mL/h，置換液流量為30～35 mL（kg·h）。根據(jù)患者具體情況選擇抗凝以及超濾量。

1.2.2 分組

將AKI 組患者根據(jù)病情嚴(yán)重程度進(jìn)行分組，以急性生理與慢性健康狀況評(píng)分（Acute physiology and chronic health score，APACHE II）評(píng)價(jià)［6］：輕度組28 例：APACHEⅡ評(píng)分＜10 分，中度組19 例：APACHE Ⅱ評(píng)分：10 分～20 分，重度組：APACHEⅡ評(píng)分22 例：＞20 分。

1.2.3 預(yù)后情況

治療后隨訪30 d 記錄患者在此期間生存情況，根據(jù)此分為存活組和死亡組。

1.2.4 NGAL、KIM-1 聯(lián)合外周血Th17 細(xì)胞檢測(cè)

在患者確診入院后次日清晨空腹抽取靜脈血液4 mL，并收集尿液5 mL，使用離心機(jī)3 000 r/min 離心后獲取血清及尿液上清液，血清用于檢測(cè)NGAL、Th17 細(xì)胞，尿液用于檢測(cè)KIM-1。血清NGAL（試劑盒為上海邦景實(shí)驗(yàn)有限公司提供）及KIM-1（試劑盒為上海一研生物科技有限公司提供）使用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫法進(jìn)行檢測(cè)；Th17 細(xì)胞水平采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑配套說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用F檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；繪制受試者工作特征（ROC）曲線分析NGAL、KIM-1 聯(lián)合外周血Th17 細(xì)胞檢測(cè)對(duì)膿毒癥AKI 者預(yù)后評(píng)估價(jià)值，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AKI組與對(duì)照組NGAL、KIM-1、Th17水平比較

AKI 組NGAL、KIM-1、Th17 水平明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 AKI組與對(duì)照組NGAL、KIM-1、Th17水平比較（±s）Table 1 Comparison of NGAL，KIM-1 and Th17 levels between the observation group and the control group（±s）

表1 AKI組與對(duì)照組NGAL、KIM-1、Th17水平比較（±s）Table 1 Comparison of NGAL，KIM-1 and Th17 levels between the observation group and the control group（±s）

組別對(duì)照組AKI 組t 值P 值n 68 69--NGAL（ng/mL）19.26±3.59 37.19±7.18 18.444＜0.001 KIM-1（μg/mL）18.26±3.16 26.58±4.97 11.673＜0.001 Th17（%）3.16±0.11 4.19±0.41 20.017＜0.001

2.2 不同病情程度膿毒癥AKI 者NGAL、KIM-1、Th17 水平比較

NGAL、KIM-1、Th17 在不同病情程度膿毒癥AKI 患者中表達(dá)情況均為：重度組＞中度組＞輕度組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同病情程度膿毒癥AKI 者NGAL、KIM-1、Th17 水平比較（±s）Table 2 Comparison of NGAL，KIM-1 and Th17 levels in patients with sepsis AKI of different severity（±s）

表2 不同病情程度膿毒癥AKI 者NGAL、KIM-1、Th17 水平比較（±s）Table 2 Comparison of NGAL，KIM-1 and Th17 levels in patients with sepsis AKI of different severity（±s）

注：a為與輕度組比較，P＜0.05；b為與中度組比較，P＜0.05。

組別輕度組中度組重度組F 值P 值n 28 19 22 NGAL（ng/mL）18.84±3.11 36.59±7.42a 40.44±8.19ab 96.06＜0.001 KIM-1（μg/mL）17.50±2.94 23.59±3.57a 29.85±5.66ab 54.78＜0.001 Th17（%）2.10±0.67 6.22±0.18a 8.16±0.66ab 862.07＜0.001

2.3 不同預(yù)后膿毒癥AKI 者NGAL、KIM-1、Th17水平比較

69 例患者30 d 后死亡17 例，存活52 例，死亡組膿毒癥AKI 者NGAL、KIM-1、Th17 水平明顯高于存活組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 不同預(yù)后膿毒癥AKI 者NGAL、KIM-1、Th17 水平比較（±s）Table 3 Comparison of NGAL，KIM-1 and Th17 levels in AKI patients with sepsis（±s）

表3 不同預(yù)后膿毒癥AKI 者NGAL、KIM-1、Th17 水平比較（±s）Table 3 Comparison of NGAL，KIM-1 and Th17 levels in AKI patients with sepsis（±s）

組別存活組死亡組t 值P 值n 52 17 NGAL（ng/mL）16.54±3.26 40.15±7.66 17.975＜0.001 KIM-1（μg/mL）20.44±3.49 28.46±5.79 6.374＜0.001 Th17（%）2.33±0.17 6.98±0.77 41.151＜0.001

2.4 NGAL、KIM-1 聯(lián)合外周血Th17 細(xì)胞檢測(cè)對(duì)膿毒癥AKI 者預(yù)后評(píng)估價(jià)值

ROC 結(jié)果示，ROC 結(jié)果顯示，NGAL+KIM-1+Th17 評(píng)估膿毒癥AKI 者預(yù)后時(shí)AUC 為0.829，明顯高于三者單獨(dú)檢測(cè)（P＜0.05）。見(jiàn)表4及圖1。

表4 NGAL、KIM-1 聯(lián)合外周血Th17 細(xì)胞檢測(cè)對(duì)膿毒癥AKI 者預(yù)后評(píng)估價(jià)值Table 4 prognostic value of NGAL，KIM-1 combined with Th17 cell detection in patients with septic Aki

圖1 ROC 曲線Figure 1 ROC curve

3 討論

以往有研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致膿毒癥合并AKI 高死亡風(fēng)險(xiǎn)和此病缺乏有效的預(yù)后評(píng)估指標(biāo)有關(guān)，尋找合適的評(píng)估指標(biāo)可降低膿毒癥合并AKI 死亡風(fēng)險(xiǎn)［7］。

NGAL 于1993年在中性粒細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，在正常的腎臟組織中其表達(dá)水平低，但如果出現(xiàn)腎毒性物質(zhì)或腎臟出現(xiàn)缺血性損傷可導(dǎo)致腎小管升支粗段中NGAL 分泌迅速增高，通常在3 h 后可在尿液或血清中檢測(cè)到NGAL，其表達(dá)升高明顯早于尿N-乙酰B-D 氨基葡萄糖苷酶、血肌酐等因子［8］。文獻(xiàn)研究顯示，NGAL 可作為早期診斷AKI 的生物標(biāo)志物，且敏感性、特異性均較高［9］。王元真等人［11］通過(guò)建立動(dòng)物模型，發(fā)現(xiàn)NGAL 為最早出現(xiàn)在腎臟上皮中的蛋白質(zhì)，且穩(wěn)定性好，在出現(xiàn)腎損傷后數(shù)小時(shí)內(nèi)可在尿液和血液中被檢測(cè)到。國(guó)內(nèi)外均有研究顯示，AKI 損傷程度、損傷持續(xù)時(shí)間與NGAL 含量成正比，NGAL 水平增加，AKI 損傷越嚴(yán)重，NGAL水平逐漸下降恢復(fù)正常，AKI 也可得到一定恢復(fù)［10-11］。KIM-1 屬于跨膜糖蛋白，由黏蛋白、免疫球蛋白組成。在正常的腎臟組織中KIM-1 幾乎不表達(dá)，但在出現(xiàn)AKI 后細(xì)胞外的KIM-1 就會(huì)脫落，可在尿液中檢出［12］。KIM-1 作為磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine，PS）的受體，可有效識(shí)別脂蛋白和PS，從而清除凋亡細(xì)胞，減緩炎癥反應(yīng)，達(dá)到修復(fù)組織的目的。有研究通過(guò)建立缺血性腎病大鼠模型，檢測(cè)大鼠尿液中KIM-1 含量，發(fā)現(xiàn)KIM-1 在尿液中表達(dá)明顯上升［13］。劉瑞清等人［14］研究發(fā)現(xiàn)，KIM-1水平變化與腎臟管狀細(xì)胞受損程度存在正相關(guān)，KIM-1 對(duì)腎損傷早期診斷價(jià)值高于傳統(tǒng)生物標(biāo)記物。鄧欣雨等人［15］研究顯示，膿毒癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中炎癥反應(yīng)發(fā)揮著關(guān)鍵的作用，淋巴細(xì)胞作為重要效應(yīng)器，有著刺激炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的作用，可通過(guò)分化出多種特異性T 細(xì)胞并表達(dá)多種炎性因子參與到膿毒癥的發(fā)生、發(fā)展中。Th17 屬于輔助性T 細(xì)胞亞群，可分泌出IL-17，促進(jìn)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性因子聚集在感染部位。在感染性或自身免疫性疾病中，患者外周血Th17、IL-17 水平均明顯升高，且和患者病情嚴(yán)重程度存在密切的聯(lián)系。

本研究結(jié)果提示NGAL、KIM-1、Th17 可能參與膿毒癥AKI 發(fā)展過(guò)程。進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)隨著膿毒癥AKI 患者病情進(jìn)展，NGAL、KIM-1、Th17 水平為明顯上升趨勢(shì)。且在治療后30 d 隨訪中發(fā)現(xiàn)，預(yù)后生存組NGAL、KIM-1、Th17 水平明顯低于預(yù)后死亡組，與以往研究結(jié)果相符［16］。說(shuō)明三者水平變化與膿毒癥AKI 病情進(jìn)展密切相關(guān)，可為患者預(yù)后情況評(píng)估提供參考依據(jù)。行ROC 曲線分析說(shuō)明NGAL、KIM-1、Th17 可為膿毒癥AKI 患者治療預(yù)后評(píng)估提供一定參考信息，可作為膿毒癥AKI 患者預(yù)后預(yù)測(cè)的理想生物指標(biāo)。

綜上所述，NGAL、KIM-1、外周血Th17 細(xì)胞水平變化與膿毒癥AKI 患者病情變化密切相關(guān)，三者聯(lián)合可進(jìn)一步提高對(duì)膿毒癥AKI 患者經(jīng)CRRT治療短期預(yù)后的預(yù)測(cè)能力。