PUMA、IQGAP1在胰腺癌中的表達(dá)及與臨床病理、預(yù)后生存的相關(guān)性

胡懷遠(yuǎn) 夏燕 雍翔 鄒萍 劉巖

胰腺癌是一種惡性程度極高的腫瘤，患者大多預(yù)后差。目前臨床治療胰腺癌以手術(shù)切除為首要治療手段，但由于該病早期誤診、漏診率高，導(dǎo)致生存率極低［1］。積極尋找胰腺癌新的標(biāo)志物對于胰腺癌的早期診斷及治療具有重要的臨床價(jià)值。凋亡調(diào)控基因（53 Up-regulated Modulator of Apoptosi，PUMA）為P53基因中誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要介質(zhì)，可阻礙線粒體發(fā)揮功能，刺激凋亡線粒體蛋白釋放，在肝癌、胃癌等惡性腫瘤中均有表達(dá)［2］。IQ 結(jié)構(gòu)域GTP 酶激活蛋白（IQ-domain GTPase-activating proteins，IQGAPs）是鳥苷三磷酸酶活化蛋白家族，IQGAP1 蛋白屬于其家族成員之一，具有多個(gè)結(jié)構(gòu)域［3］。有學(xué)者研究指出，IQGAP1可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路刺激腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移［4］。本文旨在探討PUMA、IQGAP1 蛋白在胰腺癌中的表達(dá)及其與臨床病理、預(yù)后生存的相關(guān)性，現(xiàn)研究報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年10月至2018年10月本院收治的74 例胰腺癌患者胰腺癌組織標(biāo)本、遠(yuǎn)離胰腺腫瘤3 cm 的癌旁組織標(biāo)本各74 份。其中男44例，女30 例；平均年齡（55.19±4.52）歲；腫瘤直徑最大為8.5 cm，最小1.8 cm；腫瘤位于胰腺頭頸部39 例，位于體尾部35 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①CT 檢查提示胰周脂肪層消失，出現(xiàn)雙軌征，局部出現(xiàn)凸起的腫物，并經(jīng)術(shù)后病理檢查確診為胰腺癌［5］；②均在入院后2 周內(nèi)進(jìn)行根治性手術(shù)切除；③術(shù)前未接受過放、化療等輔助治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并惡性腫瘤、阿爾茲海默癥者、因精神障礙無法配合治療者；②病理檢查結(jié)果為胰腺囊性腫瘤者；③因非胰腺癌死亡者及隨訪期間失訪者。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過，受試者或其家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集

PUMA、IQGAP1 標(biāo)本均經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋、切片、DAB 顯色劑顯色、蘇木精復(fù)染、乙醇脫水、二甲苯透明，中性樹膠封固等步驟處理。采用免疫組化染色法檢測PUMA、IQGAP1 表達(dá)情況。

1.2.2 試劑

PUMA 及IQGAP1 兔多克隆抗體均采購自美國Epitomics 公司。DAB 顯色劑及配套試劑盒采購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。L.3 回旋式切片機(jī)由北京手術(shù)器械廠提供。

1.2.3 結(jié)果判定

陽性結(jié)果判定［6］：PUMA 及IQGAPl 蛋白染色陽性信號呈棕黃或棕褐色，位于胞膜或胞漿。陽性細(xì)胞計(jì)分：0 分：無陽性細(xì)胞，1 分：陽性細(xì)胞＜10%，2 分：陽性細(xì)胞10%～50%，3 分：陽性細(xì)胞50%～75%，4 分：陽性細(xì)胞＞75%；細(xì)胞質(zhì)無染色計(jì)0 分，淡黃色計(jì)1 分，棕黃色計(jì)2 分，棕褐色計(jì)3 分。以雙盲法觀察切片，兩項(xiàng)評分之和≤2 分為陰性，≥3 分為陽性。陽性率=陽性例數(shù)/總例數(shù)×100%。

1.3 隨訪

隨訪從患者術(shù)后開始，直至患者死亡或本研究結(jié)束，為期2年（截止時(shí)間：2020年10月）。隨訪時(shí)間在1～24 個(gè)月中分布，平均隨訪時(shí)間為（11.10±2.64）個(gè)月。隨訪方式為門診復(fù)查，詳細(xì)記錄兩組患者治療后無進(jìn)展生存時(shí)間（Progression-Free-Survival，PFS））、總生存時(shí)間（Overall Survival，OS）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；計(jì)量資料以（）表示，多組間采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 生存分析預(yù)后，使用tarone 法進(jìn)行檢驗(yàn)；以P＜0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PUMA 及IQGAPl 在不同組織中的表達(dá)

胰腺癌組織中的PUMA 陽性率顯著低于癌旁組織，IQGAPl 陽性率顯著高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1及圖1。

表1 PUMA 及IQGAPl 在不同組織中的表達(dá)［n（%）］Table 1 expression of Puma and iqgapl in different tissues［n（%）］

圖1 胰腺癌組織免疫組化染色圖（SP，×500）Figure 1 immunohistochemical staining of pancreatic carcinoma（SP，×500）

2.2 胰腺癌組織中PUMA、IQGAPl 蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

TNM 分期為Ⅲ～Ⅵ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度為中-低分化的胰腺癌患者PUMA 陰性率、IQGAPl 陽性率更高（P＜0.05）。見表2。

表2 胰腺癌組織中PUMA、IQGAPl 蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Table 2 Relationship between puma，iqgapl protein expression and clinicopathological features in pancreatic cancer［n（%）］

2.3 胰腺癌患者不同PUMA、IQGAPl 表達(dá)的預(yù)后情況

74 例胰腺癌患者2年生存率為16.22%。PUMA陰性表達(dá)、IQGAPl 陽性表達(dá)的胰腺癌患者死亡率高于PUMA 陽性表達(dá)、IQGAPl 陰性表達(dá)的患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 胰腺癌患者PUMA、IQGAPl 表達(dá)的預(yù)后情況［n（%）］Table 3 prognosis of different expression of Puma and iqgapl in patients with pancreatic cancer［n（%）］

2.4 生存曲線分析

PUMA 表達(dá)陰性、表達(dá)陽性及IQGAPl 表達(dá)陰性、表達(dá)陽性半數(shù)生存時(shí)間分別為（9.12±1.18）月、（16.25±1.58）月、（17.40±2.70）月、（10.70±1.60）月。生存分析顯示PUMA（表達(dá)陽性）、IQGAPl（表達(dá)陰性）者生存期較長，Keplan-meier 生存曲線明顯不同（P＜0.05）。見圖2。

圖2 不同PUMA、IQGAPl 表達(dá)的患者生存曲線分析Figure 2 analysis of survival curve of patients with different Puma and IQGAPl expression

2.5 影響胰腺癌患者預(yù)后生存的單因素和多因素分析

TNM（Ⅲ～Ⅵ期）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有）、分化程度（中-低分化）、PUMA（表達(dá)陰性）、IQGAPl（表達(dá)陽性）為影響胰腺癌患者預(yù)后生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見表4。

表4 影響胰腺癌患者預(yù)后生存的單因素和多因素分析Table 4 univariate and multivariate analysis of prognostic factors in patients with pancreatic cancer

3 討論

據(jù)統(tǒng)計(jì)，胰腺癌在全球范圍內(nèi)惡性腫瘤發(fā)病率中排名靠前，死亡率位居第7 位，目前臨床多依據(jù)腹部CT、胰腺M(fèi)RI、腹部超聲、超聲內(nèi)鏡等檢查結(jié)合術(shù)后病理檢查確診［7］。但由于胰腺位置隱蔽，在患者表現(xiàn)出臨床癥狀時(shí)，腫瘤多已發(fā)展到中晚期，手術(shù)根治難度大，患者仍面臨術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，且預(yù)后情況不理想。

隨著醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，腫瘤相關(guān)基因標(biāo)志檢測逐漸引起廣大學(xué)者的重視，有學(xué)者研究指出，正常的胰腺細(xì)胞發(fā)展為胰腺癌的過程中有多個(gè)癌基因及抑癌基因的參與［8］。PUMA是近年來新發(fā)現(xiàn)的促凋亡基因，可發(fā)揮強(qiáng)大的促凋亡作用［9］。IQGAPl 是一種能通過ERk-2 信號通路的透明質(zhì)酸，并與透明質(zhì)酸受體結(jié)合促進(jìn)細(xì)胞遷移及侵襲。本研結(jié)果顯示這與既往學(xué)者報(bào)道結(jié)果一致［10］。

國外文獻(xiàn)報(bào)道，胰腺癌患5年生存率僅在5%左右［11］。本研究隨訪資料顯示：胰腺癌患者術(shù)后2年生存率僅為16.22%；PUMA 陰性表達(dá)、IQGAPl 陽性表達(dá)的患者死亡率更高；PUMA 陽性表達(dá)、IQGAPl 陰性表達(dá)的患者生存期更長。這與Ghosh 等學(xué)者［12］研究結(jié)果一致，可見PUMA、IQGAPl 參與了胰腺癌發(fā)生、發(fā)展的過程。IQGAPl 作為血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體結(jié)合蛋白，在血管內(nèi)皮的遷移、增殖過程中發(fā)揮重要作用；而PUMA是一種新的具有凋亡作用的靶基因，對細(xì)胞起著惡性轉(zhuǎn)化的作用，其可抑制細(xì)胞凋亡并參與腫瘤的發(fā)生、惡化的過程。有學(xué)者報(bào)道，PUMA 的表達(dá)下調(diào)與腫瘤發(fā)生相關(guān)，PUMA基因丟失后，加劇了淋巴組織的轉(zhuǎn)移，并促使腫瘤生長［13］。

吳萍等學(xué)者［14］通過小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PUMA 表達(dá)的改變會(huì)影響胃癌細(xì)胞的增殖能力，PUMA 低表達(dá)與胃癌的發(fā)生有關(guān)。提示可在患者化療過程中，通過增加PUMA 表達(dá)量，達(dá)到促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡、抗腫瘤的目的。國內(nèi)學(xué)者報(bào)道，在食管鱗狀細(xì)胞癌組織中，IQGAP1 表達(dá)明顯上調(diào)，推測IQGAP1陽性表達(dá)可促進(jìn)惡性腫瘤浸潤，提高腫瘤侵襲能力［15］。本研究結(jié)果亦證實(shí)這一觀點(diǎn)。但由于本研究納入樣本量較少，且未對PUMA、IQGAP 在腫瘤中侵襲、轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，導(dǎo)致研究存在不足。后續(xù)將擴(kuò)大樣本量并對血清標(biāo)志物進(jìn)行聯(lián)合檢測，以明確二者在胰腺癌病情進(jìn)展中的作用機(jī)制，證實(shí)其對診治胰腺癌的敏感性。

綜上所述，PUMA 陰性、IQGAPl 陽性為影響胰腺癌患者預(yù)后生存的危險(xiǎn)因素，臨床可通過加強(qiáng)監(jiān)測二者表達(dá)情況，以評估胰腺癌患者病情進(jìn)展情況及預(yù)后。