MAIT細(xì)胞及其分泌因子表達(dá)與肺結(jié)核病情嚴(yán)重程度的關(guān)系

李福利 劉捷凌 冷霞 孫曉柯 阮祥林

肺結(jié)核是結(jié)核分枝桿菌感染肺部引起的呼吸系統(tǒng)疾病，屬于慢性傳染?。?］。人體感染結(jié)核分枝桿菌不一定發(fā)病，90%以上的人群感染后可長期處于潛伏狀態(tài)，但當(dāng)機(jī)體抵抗力降低或細(xì)胞介導(dǎo)的變態(tài)反應(yīng)增高時(shí)，會(huì)引起臨床發(fā)?。?］。因此，肺結(jié)核的發(fā)生發(fā)展不僅和結(jié)核分枝桿菌的數(shù)量和毒力有關(guān)，還與宿主自身免疫功能密切相關(guān)?，F(xiàn)代免疫學(xué)研究也證實(shí)，復(fù)雜的細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)與肺結(jié)核的病情發(fā)展有關(guān)［3］。粘膜相關(guān)恒定T 細(xì)胞（mucosal-associated invariant T cell，MAIT）是體內(nèi)高度保守的天然免疫T 細(xì)胞，在啟動(dòng)自身免疫活化，分泌效應(yīng)分子對(duì)抗微生物感染中有重要的作用［4-5］。越來越多的證據(jù)表明，MAIT 細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中有重要作用［6-7］。本研究將通過檢測(cè)肺結(jié)核患者外周血MAIT 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子水平，分析外周血MAIT 細(xì)胞功能與患者病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，以期進(jìn)一步明確MAIT 細(xì)胞與肺結(jié)核疾病進(jìn)展的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2017年1月至2019年3月入院治療的142 例肺結(jié)核患者作為肺結(jié)核組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①肺結(jié)核的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考《肺結(jié)核診斷的治療指南》［8］；②年齡＞18 歲；③患者及家屬自愿參與，且簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①抗結(jié)核治療應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑；②合并惡性腫瘤、自身免疫系統(tǒng)疾病等；③嚴(yán)重心、肝、腎功能不全；④孕婦和哺乳期女性；⑤存在認(rèn)知障礙和溝通障礙。同時(shí)選取45 例健康志愿者作為對(duì)照組。兩組性別比例、年齡、體質(zhì)指數(shù)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。本研究已通過醫(yī)院倫理委員會(huì)審批。

表1 兩組患者基線資料比較（±s）Table 1 Comparison of baseline data between 2 groups（±s）

表1 兩組患者基線資料比較（±s）Table 1 Comparison of baseline data between 2 groups（±s）

組別肺結(jié)核組對(duì)照組t/χ2值P 值n 142 45性別（男/女）82/60 24/21 0.271 0.603年齡（歲）47.29±7.21 46.83±8.16 0.361 0.718體質(zhì)指數(shù)（kg/m2）23.59±2.15 23.82±2.26 0.618 0.538

1.2 患者分組

肺結(jié)核患者入院后1 周內(nèi)完成胸片或胸部CT檢查，并了解其相關(guān)病例資料。根據(jù)患者肺結(jié)核的不同類型，分為初治組（n=68）和復(fù)治組（n=74）。根據(jù)影像學(xué)表現(xiàn)分組：①肺部病灶范圍分組：A 組（1～2 個(gè)肺野）（n=62）、B 組（3～4 個(gè)肺野）（n=45）和C 組（5～6 個(gè)肺野）（n=35）；②肺部是否有空洞分組：空洞組（n=59）和無空洞組（n=83）。

1.3 檢測(cè)方法

采集受試者空腹肘部靜脈血5 mL，抗凝處理后，加入淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，分別加入CD3、CD8、CD161 抗體，常溫下避光孵育30 min，清洗后上流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter 公司）進(jìn)行檢測(cè)，其中CD8+CD161+標(biāo)記細(xì)胞即為MAIT。再分選上述MAIT 細(xì)胞（密度2×105個(gè)/mL），分別加入干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、顆粒酶B（Granzyme B）及白細(xì)胞介素17（interleukin-17，IL-17）抗體，檢測(cè)MAIT 細(xì)胞中IFN-γ、TNF-α、Granzyme B 及IL-17 的表達(dá)，流式抗體均購自美國Santa Cruz 公司。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，方差齊性兩組比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩分析采用SNK-q法；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血MAIT 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子水平比較

肺結(jié)核組患者外周血MAIT 細(xì)胞比例、分泌IFN-γ、TNF-α、Granzyme B 的MAIT 細(xì)胞比例顯著低于對(duì)照組，分泌IL-17 的MAIT 細(xì)胞比例顯著高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組外周血MAIT 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子水平比較（±s）Table 2 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood between 2 groups（±s）

表2 兩組外周血MAIT 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子水平比較（±s）Table 2 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood between 2 groups（±s）

組別肺結(jié)核組對(duì)照組t 值P 值n 142 45 MAIT 細(xì)胞（%）3.37±0.88 5.93±1.42 14.468＜0.001 IFN-γ（%）7.84±2.07 12.61±3.21 11.662＜0.001 TNF-α（%）3.45±1.10 5.37±1.62 9.025＜0.001 Granzyme B（%）1.43±0.42 2.37±0.65 11.337＜0.001 IL-17（%）5.24±1.56 3.73±1.14 6.000＜0.001

2.2 不同肺結(jié)核類型患者外周血MAIT 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子水平比較

初治組和復(fù)治組患者外周血MAIT 細(xì)胞比例及其分泌細(xì)胞因子水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同肺結(jié)核類型患者外周血MAIT 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子水平比較（±s）Table 3 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different types of tuberculosis（±s）

表3 不同肺結(jié)核類型患者外周血MAIT 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子水平比較（±s）Table 3 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different types of tuberculosis（±s）

組別初治組復(fù)治組t 值P 值n 68 74 MAIT 細(xì)胞（%）3.46±0.92 3.21±0.80 1.731 0.086 IFN-γ（%）7.97±2.13 7.62±1.95 1.022 0.308 TNF-α（%）3.62±1.28 3.31±1.02 1.602 0.111 Granzyme B（%）1.49±0.48 1.38±0.35 1.569 0.119 IL-17（%）5.13±1.66 5.47±1.51 1.278 0.203

2.3 不同病灶范圍患者外周血MAIT 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子水平比較

不同肺部病灶范圍患者外周血MAIT 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中A 組MAIT 細(xì)胞及分泌IFN-γ、TNF-α 及Granzyme B 水平均高于B 組和C 組，分泌IL-17 水平低于B組和C組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 不同病灶范圍患者外周血MAIT 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子水平比較（±s）Table 4 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different ranges of lesions（±s）

表4 不同病灶范圍患者外周血MAIT 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子水平比較（±s）Table 4 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different ranges of lesions（±s）

注：與A 組比較，aP＜0.05；與B 組比較，bP＜0.05。

IL-17（%）4.65±1.42 5.53±1.78a 6.11±1.84a 9.485＜0.001組別A 組B 組C 組F 值P 值n 62 45 35 MAIT 細(xì)胞（%）3.81±1.02 3.29±0.75a 2.63±0.70ab 20.824＜0.001 IFN-γ（%）8.43±2.51 7.19±1.98a 6.32±1.82a 12.138＜0.001 TNF-α（%）4.37±1.35 3.16±1.02a 2.73±0.84a 27.624＜0.001 Granzyme B（%）1.73±0.52 1.32±0.41a 1.18±0.33a 20.242＜0.001

2.4 不同空洞表現(xiàn)患者外周血MAIT 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子水平比較

空洞組和無空洞組患者外周血MAIT 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5。

表5 不同空洞表現(xiàn)患者外周血MAIT 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子水平比較（±s）Table 5 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different cavity manifestations（±s）

表5 不同空洞表現(xiàn)患者外周血MAIT 細(xì)胞及其分泌細(xì)胞因子水平比較（±s）Table 5 Comparison on levels of MAIT cells and cytokines in peripheral blood among patients with different cavity manifestations（±s）

組別空洞組無空洞組t 值P 值n 59 83 MAIT 細(xì)胞（%）3.27±0.79 3.52±0.92 1.690 0.093 IFN-γ（%）7.71±1.84 8.05±2.26 0.952 0.342 TNF-α（%）3.31±0.95 3.62±1.18 1.669 0.097 Granzyme B（%）1.41±0.48 1.45±0.40 0.540 0.590 IL-17（%）5.53±1.43 5.11±1.72 1.536 0.127

3 討論

1993年，MAIT 細(xì)胞首次在腸黏膜淋巴組織中被發(fā)現(xiàn)，其是一類表達(dá)半恒定T 細(xì)胞受體的T 淋巴細(xì)胞［9］。不同于傳統(tǒng)T 淋巴細(xì)胞可表達(dá)多種T 細(xì)胞受體識(shí)別多種抗原，MAIT 細(xì)胞僅能限制性識(shí)別主要組織相容性復(fù)合體1b 分子，呈現(xiàn)出高度保守性［10］。MAIT 細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞，在人體血液和肝臟內(nèi)數(shù)量豐富，可參與抵抗病原體、腸道免疫、維持上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)等過程。

近年來研究顯示，MAIT 細(xì)胞在宿主防御感染性病原體的免疫反應(yīng)中有重要的調(diào)控作用，可能是天然的、抗感染、抗炎因素［11］。相關(guān)臨床研究結(jié)果也顯示，聚集于腸黏膜中的MAIT 細(xì)胞在腸炎疾病中具有保護(hù)性作用［12］。病原體入侵后，MAIT 細(xì)胞可以識(shí)別來源于細(xì)菌和酵母菌的抗原，活化后的MAIT 細(xì)胞可聚集于感染灶，可迅速分泌細(xì)胞因子，主要是IFN-γ 和TNF-α，殺傷受損的細(xì)胞，并調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞功能。MAIT 細(xì)胞是一種具有同源表型的細(xì)胞亞型，占人類外周血T細(xì)胞的1%～10%［13］。本研究結(jié)果這與既往研究報(bào)道感染性疾病患者外周血MAIT 細(xì)胞的數(shù)量減少相符［14］。但MAIT 細(xì)胞在肺結(jié)核患者肺組織中的表達(dá)情況還不清楚，后期將努力收集其肺組織樣本，觀察MAIT 細(xì)胞在感染部位免疫應(yīng)答情況。

目前，MAIT 細(xì)胞對(duì)于銅綠假單胞菌、分支桿菌屬的抗菌作用已在相關(guān)鼠類模型中明確，上述感染模型中MAIT 細(xì)胞數(shù)量減少，而細(xì)菌負(fù)荷增加［15］，但MAIT 細(xì)胞發(fā)揮抗菌活性的具體機(jī)制還不清楚?；罨腗AIT 細(xì)胞可迅速分泌細(xì)胞因子及細(xì)胞毒性產(chǎn)物，包括IFN-γ、TNF-α、Granzyme B 及IL-17等。通過流式細(xì)胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，肺結(jié)核患者外周血MAIT 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子功能也發(fā)生改變，分泌IFN-γ、TNF-α 及Granzyme B 等細(xì)胞因子能力減弱，而分泌IL-17 因子能力增強(qiáng)，這與報(bào)道指出MAIT 細(xì)胞在不同疾病中呈現(xiàn)的功能不同相符［16］。B?ttcher 等［17］研究報(bào)道，MAIT 細(xì)胞在疾病狀態(tài)中分泌的細(xì)胞因子由Th1 型轉(zhuǎn)向Th17 型，與本文結(jié)果相符。本研究分析結(jié)果進(jìn)一步說明MAIT 細(xì)胞及其功能與肺結(jié)核的進(jìn)展密切相關(guān)。但本研究納入病例數(shù)較少，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，肺結(jié)核患者外周血MAIT 細(xì)胞功能存在明顯缺陷，病灶范圍較廣的患者M(jìn)AIT 細(xì)胞功能缺陷更明顯。但患者體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)是復(fù)雜、多面的，MAIT 細(xì)胞及其分泌因子在不同疾病狀態(tài)下所起的作用也不盡相同。MAIT 細(xì)胞在肺結(jié)核中的作用機(jī)制尚未徹底明確，仍需進(jìn)一步研究闡明其免疫機(jī)制。MAIT 細(xì)胞功能應(yīng)用于肺結(jié)核病情判斷和相關(guān)治療將是本課題未來的研究方向。