基于5個(gè)PI3K通路相關(guān)基因構(gòu)建肺腺癌預(yù)后預(yù)測(cè)模型

于麗華 王宏 秦麗 王偉娜 崔東燕 趙書平★

中國人群的肺癌發(fā)病率以及死亡率也呈逐年升高的趨勢(shì)，肺腺癌（Lung adenocarcinoma，LUAD）在我國最為常見［1］。早期LUAD 患者尚有手術(shù)機(jī)會(huì)，而晚期患者，往往只能采用靶向治療、放化療、免疫治療等以延長生存時(shí)間［2］。盡管如此，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和耐藥問題依舊是患者不良預(yù)后的主要原因［3］。所以，進(jìn)一步尋找可用于預(yù)測(cè)LUAD 患者的預(yù)后和死亡風(fēng)險(xiǎn)的腫瘤標(biāo)志物，仍然是目前首要任務(wù)。磷酸肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）信號(hào)下游包含多條信號(hào)通路，參與調(diào)節(jié)各類細(xì)胞生理過程。此外，眾多研究發(fā)現(xiàn)PI3K 通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用［4］。例如，Heavey 等人發(fā)現(xiàn)非小細(xì)胞肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移與PI3K/蛋白激酶B（Protein kinase B，Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）通路的異常激活與密切相關(guān)［5］。雖然PI3K 通路被證明與腫瘤相關(guān)，但可否采用PI3K 下游基因構(gòu)建預(yù)后預(yù)測(cè)模型，用于腫瘤復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)仍是盲點(diǎn)。本研究通過分析公共數(shù)據(jù)庫表達(dá)譜數(shù)據(jù)，利用單因素和多因素Cox 回歸分析構(gòu)建了一項(xiàng)基于PI3K 通路相關(guān)基因的預(yù)后預(yù)測(cè)模型。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源

通過系統(tǒng)檢索PI3K 通路下游基因列表，并從The Cancer Genome Atlas（TCGA）數(shù)據(jù)庫中提取相應(yīng)基因的表達(dá)譜數(shù)據(jù)（數(shù)據(jù)下載于2020年10月1日），及相應(yīng)患者的臨床信息［主要包括總體生存率（Overall survival，OS）、生存狀態(tài)（Survival status）、年齡（Age）、性別（Gender）、腫瘤分期（Tumor stage，T 分期）等，共包括497 例LUAD 病例和54 例對(duì)照。

1.2 篩選差異表達(dá)基因和基因富集

應(yīng)用R 統(tǒng)計(jì)軟件中的“l(fā)imma”軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，與PI3K 通路下游基因列表取交集，以log2FoldChange≥2 或≤-2，校正P-value ＜0.05 為條件，同時(shí)對(duì)差異基因進(jìn)行富集分析。

1.3 構(gòu)建預(yù)后預(yù)測(cè)模型

研究首先采用單因素Cox 回歸分析關(guān)聯(lián)差異表達(dá)的PI3K 通路基因與OS，并提取多因素Cox 回歸分析中各基因的系數(shù)用于預(yù)后模型的構(gòu)建，公式=（0.189 042 561×F2RL1 表達(dá)值）+（0.159 601 144×TWIST 表達(dá)值）-（0.289 521 135×FGR 的表達(dá)值）-（0.223 936 656×KLF4 表達(dá)值）+（0.250 520 925×CEP55 表達(dá)值），基于中位風(fēng)險(xiǎn)值，將患者分為高、低風(fēng)險(xiǎn)兩個(gè)亞組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，行χ2檢驗(yàn)；利用Kaplan-Meier（K-M）和log-rank 分析檢驗(yàn)?zāi)Ｐ椭懈?、低危組的生存狀態(tài)差異；繪制受試者工作特征（ROC）曲線，計(jì)算曲線下面積（AUC），檢驗(yàn)?zāi)Ｐ蜏?zhǔn)確性；采用多因素Cox 回歸分析探究該模型預(yù)測(cè)LUAD 患者預(yù)后是否受其他因素影響。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選差異表達(dá)的PI3K 通路相關(guān)基因

分析共納入出154 個(gè)PI3K 通路相關(guān)基因，分析共篩選出34 個(gè)差異表達(dá)的PI3K 通路基因。對(duì)獲取的差異基因進(jìn)行富集分析，結(jié)果顯示這些基因多富集于PI3K 等信號(hào)通路。見表1、圖1。

圖1 差異表達(dá)基因的富集分析Figure 1 The enrichment analyses of the differentially expressed genes

表1 差異表達(dá)PI3K 通路相關(guān)基因Table 1 The differentially expressed PI3K pathway-related genes

2.2 基于差異表達(dá)的PI3K 通路相關(guān)基因構(gòu)建預(yù)測(cè)模型

將有配對(duì)臨床資料的LUAD 樣本與差異表達(dá)基因相結(jié)合，剔除表達(dá)量較低或?qū)Y(jié)果影響較大的樣本，最終納入436 例患者表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)一步行單因素Cox 回歸分析，結(jié)果顯示有11 個(gè)基因與OS 相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。將11 個(gè)基因納入多因素Cox 回歸分析，篩選出5 個(gè)基因用于建模（F2RL1、TWIST、FGR、KLF4 和CEP55），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其中，KLF4、CEP55、F2RL1和TWIST為高風(fēng)險(xiǎn)基因，F(xiàn)GR為保護(hù)性基因。見圖2、表2。

表2 436 例LUAD 患者的臨床病理特征［n（%）］Table 2 The clinicopathological features of the enrolled 436 LUAD cases［n（%）］

圖2 單因素Cox 回歸分析結(jié)果Figure 2 The results of univariate Cox regression analysis

2.3 評(píng)估預(yù)測(cè)模型的有效性

患者中位風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分為0.963 667，以此為依據(jù)將患者分為低風(fēng)險(xiǎn)（218 人）和高風(fēng)險(xiǎn)組（218 人）。結(jié)果顯示，患者生存時(shí)間隨著風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分升高逐漸縮短（圖3A），且死亡人數(shù)（圖3B）則呈上升趨勢(shì)；圖3C 可見模型中KLF4、CEP55、F2RL1和TWIST的表達(dá)在高危組患者中明顯增高，F(xiàn)GR的表達(dá)在低危組患者中明顯增高；K-M 分析結(jié)果顯示，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與患者不良預(yù)后呈顯著正相關(guān)（圖3D）；ROC曲線分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)價(jià)值最高（圖3E，AUC=0.735）。見圖3。

圖3 建模基因分布與模型準(zhǔn)確性評(píng)估Figure 3 Modeling gene distribution and evaluation of model accuracy

2.4 模型可作為LUAD 患者獨(dú)立預(yù)后因子

單因素Cox 回歸分析表明LUAD 患者的T 分期、N 分期、臨床分期、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分與OS 相關(guān)（P＜0.05）；多因素Cox 回歸分析表明預(yù)測(cè)模型可作為患者OS 評(píng)估的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子（P＜0.05）；T 分期、N 分期對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)是獨(dú)立的（P＜0.05）。見表3、表4。

表3 單因素Cox 回歸分析Table 3 Cox regression analyses of univariate

表4 多因素Cox 回歸分析Table 4 Multivariate Cox regression analysis

2.5 預(yù)測(cè)模型與臨床病理特征的關(guān)系

使用R 軟件的“beeswarm”分析參與模型構(gòu)建的基因與臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，CEP55與患者年齡（P=0.006）、生存狀態(tài)（P=0.005）、性別（P=0.007）、N 分期（P=4.128e-04）、stage 顯著相關(guān)（P=0.003），F(xiàn)2RL1 與患者年齡（P=0.005）、生存狀態(tài)（P=0.018）顯著相關(guān)，F(xiàn)GR 與患者生存狀態(tài)（P=0.006）、T 分期（P=0.021）、stage（P=0.038）顯著相關(guān)，見圖4。

圖4 建?；蚺c臨床參數(shù)的關(guān)系Figure 4 The correlation between modeling genes and clinicopathological factors

3 討論

近年來，大量研究證實(shí)LUAD 的發(fā)生和進(jìn)展與PI3K 信號(hào)通路密切相關(guān)，但有關(guān)該通路基因是否可作為LUAD 患者預(yù)后評(píng)估標(biāo)志物的研究尚處于初步階段。本研究分析了PI3K 通路基因與LUAD 患者預(yù)后的關(guān)系，篩選出了能夠獨(dú)立預(yù)測(cè)LUAD 患者預(yù)后的關(guān)鍵基因，并以此為依據(jù)構(gòu)建了預(yù)后預(yù)測(cè)模型，系列分析證實(shí)了該預(yù)測(cè)模型的預(yù)測(cè)能力。同時(shí)，多因素Cox 回歸分析揭示該模型對(duì)LUAD 患者的預(yù)后評(píng)估作用不受其它臨床病理參數(shù)的干擾。

當(dāng)前模型共納入5 個(gè)PI3K 通路相關(guān)基因。F2RL1基因位于5 號(hào)染色體上，其編碼蛋白PAR2是一種G 蛋白偶聯(lián)受體，可以啟動(dòng)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在慢性粒細(xì)胞白血病中，PAR2 的高表達(dá)預(yù)示著患者預(yù)后不良。研究發(fā)現(xiàn)，PAR2 可上調(diào)BclL12 表達(dá)，而Bcl2L12 可通過抑制Mdm2 與p53蛋白啟動(dòng)子結(jié)合，抑制p53 的轉(zhuǎn)錄活性，減少肺癌細(xì)胞凋亡進(jìn)程［6］。研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)2RL1 與吉非替尼耐藥密切相關(guān)。抑制PAR2 表達(dá)，可以阻斷ERK通路磷酸化及上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，上調(diào)吉非替尼治療敏感性［7］。TWIST 最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)胚胎中胚層分化和肌細(xì)胞形成，現(xiàn)在更多關(guān)注的是其在上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤侵襲中的作用。研究發(fā)現(xiàn)，Twist 在肺癌組織中較癌旁組織顯著高表達(dá)，且Twist 表達(dá)與肺腫瘤的分化程度密切有關(guān)。肺腺癌細(xì)胞系高表達(dá)Twist 后，上皮細(xì)胞呈梭形、紡錘體改變；此外，高表達(dá)該基因的肺腺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力顯著增強(qiáng)，但增殖能力相對(duì)減弱［8］。不僅如此，過表達(dá)TWIST 可抑制E-鈣蛋白和β-連環(huán)蛋白的表達(dá)，同時(shí)增強(qiáng)AKT2 蛋白活性，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［9］。KLF4基因含有KLF 超家族的鋅指蛋白結(jié)構(gòu)，參與真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。據(jù)報(bào)道，KLF4基因在乳腺癌中高表達(dá)可促進(jìn)腫瘤增殖［10］，但卻在胃癌、前列腺癌等腫瘤中起到抑瘤作用［11］。研究還發(fā)現(xiàn)KLF4 在肺癌組織中較癌旁組織表達(dá)降低，過表達(dá)KLF4 能夠顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖，引起細(xì)胞G1 期阻滯；機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，KLF4可通過激活p21 和抑制cyclin D1 表達(dá)來抑制腫瘤進(jìn)展，同時(shí)其還與Sp1 競爭結(jié)合cyclin D1，進(jìn)而抑制cyclin D1 表達(dá)，發(fā)揮腫瘤抑制作用［12］。CEP55位于染色體10q23.33 內(nèi)，是一個(gè)55 kDa 的中心體蛋白，在大多數(shù)腫瘤中可檢測(cè)到CEP55 的異常高表達(dá)。Jiang 等人［13］發(fā)現(xiàn)CEP55 在非小細(xì)胞肺癌腫瘤組織中表達(dá)顯著上調(diào)，且與患者預(yù)后不良顯著相關(guān)。Liu 等人［14］也發(fā)現(xiàn)，沉默CEP55 表達(dá)可顯著抑制肺癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡；沉默CEP55 可顯著降低肺癌細(xì)胞中CDK4、p21 和Bcl-2表達(dá)，上調(diào)凋亡前蛋白、Bad、caspase-3 和PARP 的表達(dá)，這提示CEP55 可作為肺癌治療的潛在作用靶點(diǎn)。綜上，這些結(jié)果更加提示了這些預(yù)后相關(guān)基因在肺癌發(fā)生和進(jìn)展過程中的關(guān)鍵作用。

綜上，本研究通過系統(tǒng)分析構(gòu)建了一項(xiàng)由5 個(gè)PI3K 通路基因組成的LUAD 患者預(yù)后預(yù)測(cè)模型。經(jīng)過分析與驗(yàn)證，充分說明該預(yù)后模型預(yù)測(cè)效率以及準(zhǔn)確率較高，能夠有效指導(dǎo)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)，協(xié)助制定更為精準(zhǔn)的治療方案。