GOLPH3在肺癌組織中的表達(dá)及其對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲和遷移的影響

王智園 楊曼 劉士岳 蘇國苗 雷梓★

肺癌的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制復(fù)雜，受到多種基因的調(diào)控［1-3］。高爾基磷酸化蛋白-3（Golgi phosphoprotein-3，GOLPH3），也被稱為MIDAS、GPP34、GMx33，是新近發(fā)現(xiàn)的定位于高爾基網(wǎng)的具有強(qiáng)大轉(zhuǎn)化能力的癌基因［4-6］。研究表明GOLPH3 在卵巢癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等多種實(shí)體腫瘤組織中表達(dá)明顯上調(diào)［7-10］。GOLPH3 在肺癌的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制尚不明確，但有體外實(shí)驗(yàn)研究表明，封閉GOLPH3 基因后，腫瘤細(xì)胞被明顯抑制，提示GOLPH3參與惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。為探究GOLPH3 是否與肺癌的發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)，本研究分析GOLPH3 蛋白表達(dá)與肺癌臨床病理學(xué)特征之間的關(guān)系；構(gòu)建沉默GOLPH3 的肺癌A549 細(xì)胞，以分析GOLPH3 對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響，為非小細(xì)胞肺癌靶向治療提供潛在的新靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年至2020年間于昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除的非小細(xì)胞肺癌組織72例，其中61 例具有對(duì)應(yīng)的遠(yuǎn)離癌的肺組織（遠(yuǎn)癌組織），遠(yuǎn)癌組織來源于距癌組織邊緣5 cm 以上的肺組織。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有病例均未行術(shù)前放化療；②術(shù)前檢查排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；③術(shù)后病理檢查確診非小細(xì)胞肺癌。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除術(shù)后1 個(gè)月內(nèi)死亡者。研究經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并取得患者知情同意。

1.2 材料與試劑

肺腺癌細(xì)胞A549 細(xì)胞購買于中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，RPMI-1640 培養(yǎng)液、胎牛血清（#C04001-500）購于以色列BI（Bioind）公司，針對(duì)GOLPH3 基因特異性構(gòu)建并包裝的可供直接轉(zhuǎn)染的慢病毒載體和陰性對(duì)照慢病毒載體購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司。RIPA（#P0013K）細(xì)胞裂解液、BCA（#P0010）試劑盒和增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光ECL（P0018FS）試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Transwell 小室購自美國Millipore 公司，Matrigel（#356234）購自美國Becton，Dickinson and Company；兔抗人GOLPH3（#abs111104）50 μL 多克隆抗體購自愛必信（absin）公司，兔抗人E-Cadherin（24E10，#3195）100 μL 和兔抗人Vimentin（D21H3，#5741）100 μL 單克隆抗體均購自美國Cell Signaling Technology 公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)組織內(nèi)GOLPH3 表達(dá)

組織標(biāo)本常規(guī)制片，H-E 染色，光鏡下觀察腫瘤形態(tài)學(xué)特征。免疫組化使用SP 法染色，一抗用GOLPH3 多克隆抗體。免疫組化結(jié)果按照IRS 評(píng)分法判斷［11］：以陽性細(xì)胞數(shù)評(píng)分和陽性細(xì)胞強(qiáng)度評(píng)分乘積為總評(píng)分，以總評(píng)分來判斷陽性等級(jí)。其中陽性細(xì)胞數(shù)≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%依次記為0、1、2、3、4 分；陽性細(xì)胞強(qiáng)度中不著色、淡黃色、黃色、棕黃色分別記為0、1、2、3分?？傇u(píng)分0～3 分、4～6 分、7～9 分、10～12 分依次記為陰性、弱陽性、陽性、強(qiáng)陽性。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染與分組

將肺腺癌A549 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，用0.25%的含EDTA 的胰酶傳代。置于37℃，含5% CO2，且飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，待融合度達(dá)到80%時(shí)，0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的GOLPH3基因沉默技術(shù)構(gòu)建細(xì)胞：在GenBank 中查找人GOLPH3基因mRNA 序列，根據(jù)shRAN 設(shè)計(jì)原則，利用BLAST 進(jìn)行同源性分析，設(shè)計(jì)出GOLPH3-shRNA 序列。構(gòu)建GOLPH3-shRNA 質(zhì)粒，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染下調(diào)GOLPH3基因A549 細(xì)胞，為GOLPH3 沉默組，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒為對(duì)照組。繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后通過篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾載體的細(xì)胞。

1.3.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺癌A549 細(xì)胞遷移能力

將細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞融合后，用200 μL 移液器槍頭在6 孔板底部劃直線，PBS 洗去細(xì)胞碎片。于0 和24 h 分別采用Olympus IX50 顯微鏡拍照記錄細(xì)胞遷移的圖像，以遷移率表示細(xì)胞的遷移能力。

1.3.4 Transwell 侵襲試驗(yàn)檢測(cè)肺癌A549 細(xì)胞侵襲能力

采用8 μm 孔徑的Transwell 小室進(jìn)行細(xì)胞侵襲試驗(yàn)，將Matrigel 按1∶8 比例用培養(yǎng)基稀釋后加入小室上室，在上室分別接種10 000 個(gè)GOLPH3沉默和對(duì)照組的A549 細(xì)胞，并在小室下室加入500 μL 含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h 后，用棉簽擦拭上室內(nèi)未穿膜細(xì)胞及基質(zhì)膠，多聚甲醛固定，蘇木素染色，顯微鏡下觀察穿膜細(xì)胞并計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用Graphpad prism 8.4.2 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖；計(jì)量資料以（）表示，兩組間比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料采用n（%）表示，兩組間計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)用卡方檢驗(yàn)；P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 GOLPH3 表達(dá)與肺癌患者臨床病理因素的關(guān)系

GOLPH3 主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色顆粒，其中GOLPH3 在NSCLC 組中有42 例陽性，顯著高于遠(yuǎn)癌組織陽性病例數(shù)（23 例）；GOLPH3 在TMN Ⅲ+Ⅳ期組和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的陽性率也顯著高于TMNⅠ+Ⅱ期組和淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移組陽性率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。GOLPH3 的表達(dá)陽性率在年齡和性別的分組間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1和圖1。

圖1 肺癌組織及GOLPH3 免疫組化結(jié)果（HE，×100）Figure 1 Immunohistochemical results of GOLPH3 in lung cancer tissue（HE，×100）

表1 GOLPH3 表達(dá)與肺癌患者臨床病理因素的關(guān)系［n（%）］Table 1 The relationship between GOLPH3 expression and clinicopathological factors in patients with lung cancer［n（%）］

2.2 GOLPH3 沉默對(duì)肺癌細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)顯示，劃痕24 h后，GOLPH3-shRNA 組中細(xì)胞遷移率明顯低于NC-shRNA 組（24.80±3.50）vs（39.17±4.74），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 GOLPH3 沉默對(duì)肺癌A549 細(xì)胞遷移能力的影響Figure 2 Effect of GOLPH3 silencing on the migration ability of lung cancer A549 cells

2.3 GOLPH3 沉默對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響

GOLPH3-shRNA 組中穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)顯著低于NC-shRNA 組（47.40±12.20）vs（123.00±15.70），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 GOLPH3 沉默對(duì)肺癌A549 細(xì)胞侵襲能力的影響（蘇木素，×100）Figure 3 Effect of GOLPH3 silencing on invasion ability of lung cancer A549 cells（Hematoxylin，×100）

3 討論

肺癌是目前全世界發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，積極探究肺癌發(fā)生及侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制，在研究肺癌靶向治療、控制癌變發(fā)展、延長肺癌患者生命具有重要意義［12］。癌癥的發(fā)生和進(jìn)展是多基因多步驟的過程，Scott KL［13］等在進(jìn)行腫瘤基因組分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，乳腺癌、腎癌、直腸癌等多種實(shí)體腫瘤內(nèi)均存在GOLPH3 過量表達(dá)情況，確定GOLPH3 是一種原癌基因。GOLPH3 位于染色體5p13，主要存在于高爾基囊泡反面膜外圍，負(fù)責(zé)高爾基分選活動(dòng)。GOLPH3 在特定的病理或生理?xiàng)l件下被激活后，將誘導(dǎo)各種惡性腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展［14］。徐偉莉等［15］研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)腸癌組織內(nèi)GOLPH3 表達(dá)水平異常升高，且其表達(dá)水平與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、淋巴轉(zhuǎn)移及臨床分期等多個(gè)臨床參數(shù)密切相關(guān)。為了了解GOLPH3 與非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生發(fā)展是否存在關(guān)系，本研究結(jié)果提示，NSCLC 組織內(nèi)GOLPH3陽性表達(dá)率高于遠(yuǎn)癌組織；且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期較晚的肺癌病例組織中GOLPH3 的陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期較早的病例，與文獻(xiàn)研究結(jié)果一致。提示GOLPH3 高表達(dá)與肺癌的發(fā)生、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移間存在密切關(guān)系。

在上述研究結(jié)果的基礎(chǔ)上，筆者建立了GOLPH3 沉默的A549 細(xì)胞，在體外水平觀察GOLPH3基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞的影響。國內(nèi)王春曉［16］等通過體外實(shí)驗(yàn)表明，沉默GOLPH3基因可逆轉(zhuǎn)HT29 結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)順鉑化療的耐藥性。張利科等［17］通過重組慢性病毒方法，分別構(gòu)建沉默及過表達(dá)的GOLPH3 胰腺癌細(xì)胞株，并利用過MTT 實(shí)驗(yàn)，傷痕愈合實(shí)驗(yàn)以及Transwell 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，沉默GOLPH3 可有效抑制人胰腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。國外Cecilia Arriagada 等人［18］敲低人多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤T98G 細(xì)胞GOLPH3 表達(dá)后發(fā)現(xiàn)粘著斑激酶（FAK）的自激活減少，從而促進(jìn)細(xì)胞的遷移。與以上研究相似，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GOLPH3沉默組A549 細(xì)胞遷移能力明顯減弱，侵襲能力也明顯低于對(duì)照組，推測(cè)GOLPH3 可提高A549 細(xì)胞肺癌細(xì)胞侵襲和遷移能力，結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

綜上所述，GOLPH3 在肺癌組織表達(dá)高于遠(yuǎn)癌組織，且在臨床分期較晚和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病例表達(dá)顯著高于臨床分期較早和淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移的病例，在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)GOLPH3 沉默可減弱肺癌細(xì)胞侵襲遷移能力，提示GOLPH3 可促進(jìn)肺癌的進(jìn)展和侵襲遷移。因此，抑制GOLPH3 過表達(dá)有望成為肺癌靶向治療的可靠方向，但還需更進(jìn)一步細(xì)致研究不同病理類型肺癌中GOLPH3 表達(dá)情況及GOLPH3 發(fā)揮作用的分子機(jī)制，為靶向治療提供更多依據(jù)。