血漿循環(huán)腫瘤DNA基因突變檢測(cè)國(guó)家參考品的應(yīng)用評(píng)價(jià)

孫楠 于婷 孫晶 賈崢 曲守方 黃杰

肺癌是全世界最常見的癌癥，每年約有170萬(wàn)人死于該疾?。?］。液體活檢作為一種微創(chuàng)工具，可滿足對(duì)包括肺癌在內(nèi)的惡性腫瘤進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和個(gè)性化治療的迫切需求。細(xì)胞循環(huán)腫瘤DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA）檢測(cè)是一種較為成熟的液體活檢方式，能夠進(jìn)行縱向監(jiān)測(cè)，全面了解腫瘤的異質(zhì)性。研究表明使用基于高通量測(cè)序又稱二代基因測(cè)序（next generation sequencing，NGS）的ctDNA 分析的靈敏度為75%～90%，檢測(cè)結(jié)果與組織檢測(cè)高度一致［2-5］。2016年中國(guó)肺癌峰會(huì)專家小組會(huì)議就液體活檢達(dá)成共識(shí)并指出：檢測(cè)已知的、多個(gè)平行臨床可藥物抑制的靶點(diǎn)，用于發(fā)現(xiàn)未知基因，探索療效監(jiān)測(cè)、預(yù)后判斷和發(fā)現(xiàn)耐藥機(jī)制等，液體活檢技術(shù)推薦NGS 方法［6］。

本研究使用可逆末端終止測(cè)序技術(shù)對(duì)血漿循環(huán)腫瘤DNAKRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突變檢測(cè)國(guó)家參考品進(jìn)行檢測(cè)，用于評(píng)價(jià)基于二代測(cè)序技術(shù)平臺(tái)的以血漿為檢測(cè)樣本的腫瘤基因突變檢測(cè)試劑盒的性能。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

血漿ctDNAKRAS/NRAS/EGFR/ BRAF/MET基因突變檢測(cè)國(guó)家參考品，批號(hào)：360037-201901，87支/套，4.2 mL/支，血漿樣本，由中國(guó)食品藥品檢定研究院（中檢院）提供。

1.2 儀器與試劑

Qubit DNA 定量分析儀購(gòu)自美國(guó)Life technologies 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)Life technologies 公司，NextSeq CN500 基因測(cè)序分析儀購(gòu)自杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司，微滴式數(shù)字PCR 系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad 公司，文庫(kù)定量試劑（批號(hào)：2109868）購(gòu)自美國(guó)KAPA Biosystems公司，DNA 純化試劑盒（磁珠法）（批號(hào)：R0037）購(gòu)自杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司，人類EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HER2/MET基因突變聯(lián)合檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法）（批號(hào)：R3002191001）購(gòu)自杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司，NextSeq CN500 中通量測(cè)序試劑盒（批號(hào)：R0300）購(gòu)自杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取與建庫(kù)

首先提取ctDNAKRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突變檢測(cè)國(guó)家參考品的血漿游離DNA，然后采用人類EGFR/ALK/ROS1/RET/KRAS/NRAS/PIK3CA/BRAF/HER2/MET基因突變聯(lián)合檢測(cè)試劑盒（可逆末端終止測(cè)序法）對(duì)提取的血漿游離DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。在樣本DNA 片段兩端添加接頭，然后在連接酶的作用下將帶有接頭的DNA 片段環(huán)化。通過在突變位點(diǎn)附近設(shè)計(jì)背靠背式引物進(jìn)行反向PCR 擴(kuò)增，富集目標(biāo)DNA 片段，獲得線性化的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。構(gòu)建的文庫(kù)采用DNA 純化試劑盒（磁珠法）試劑盒進(jìn)行純化。

1.3.2 終文庫(kù)質(zhì)控

終文庫(kù)經(jīng)過實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，樣品濃度不低于1 nM，方可進(jìn)行下一步的上機(jī)測(cè)序。

1.3.3 測(cè)序

將文庫(kù)進(jìn)行混合，變性，復(fù)性后，加載于芯片上，準(zhǔn)備測(cè)序用反應(yīng)試劑，清潔和檢查測(cè)序芯片，點(diǎn)擊NextSeq Control Software（NCS）圖標(biāo)，NCS 初始化完成后，從NCS 的主界面點(diǎn)擊Sequence，測(cè)序芯片艙門打開，放入芯片，當(dāng)所有運(yùn)行前測(cè)試都通過，點(diǎn)擊Start，開始測(cè)序。

1.3.4 結(jié)果判讀

通過生物信息軟件分析，識(shí)別攜帶基因突變的腫瘤DNA 序列，獲得相關(guān)基因突變信息。

2 結(jié)果

2.1 終文庫(kù)質(zhì)控結(jié)果

樣品文庫(kù)濃度均≥1 nM。見表1。

表1 終文庫(kù)質(zhì)控結(jié)果Table 1 Final library quality control results

2.2 特異性結(jié)果

對(duì)國(guó)家參考品中的陰性參考品進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒聲稱可檢測(cè)的27 種突變檢測(cè)結(jié)果的突變r(jià)eads 均為0 條，為突變陰性；基因融合檢測(cè)，融合突變r(jià)eads 數(shù)均為0 條，為融合突變陰性。見表2。對(duì)試劑盒范圍外的國(guó)家陽(yáng)性參考品進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒聲稱可檢測(cè)的27 種突變檢測(cè)結(jié)果均為突變陰性；3 種基因融合檢測(cè)，為融合突變陰性。

表2 陰性參考品檢測(cè)結(jié)果Table 2 Negative reference result

2.3 單核苷酸變異（single nucleotide variant）和插入缺失突變（insertion-deletion）結(jié)果

對(duì)試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的國(guó)家陽(yáng)性參考品進(jìn)行檢測(cè)，符合文庫(kù)下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)量要求。對(duì)參考品的突變位點(diǎn)檢測(cè)，突變r(jià)eads 數(shù)均大于1，均為相應(yīng)位點(diǎn)的突變陽(yáng)性。見表3。

表3 陽(yáng)性參考品檢測(cè)結(jié)果Table 3 Positive reference result

2.4 檢測(cè)限結(jié)果

對(duì)試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的1%和0.3%突變頻率檢測(cè)限參考品進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)注的KRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突變位點(diǎn)和其他突變位點(diǎn)均檢出陽(yáng)性。對(duì)試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的EGFR/MET基因拷貝數(shù)擴(kuò)增陽(yáng)性參考品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果檢出陽(yáng)性。對(duì)試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的0.1%突變比例檢測(cè)限參考品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)試劑盒聲稱的檢測(cè)限，標(biāo)注的KRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突變位點(diǎn)和其他突變位點(diǎn)檢出（不高于0.1%突變頻率）或未檢出。見表4。

表4 檢測(cè)限參考品結(jié)果Table 4 Detection limit reference result

3 討論

液體活檢可用于晚期癌患者或由于其它原因不能獲取腫瘤組織樣本的患者［7-8］，主要應(yīng)用于個(gè)性化用藥指導(dǎo)，腫瘤發(fā)展過程監(jiān)測(cè)等［9］。液體活檢最大的挑戰(zhàn)是腫瘤患者體內(nèi)ctDNA 濃度可低至整個(gè)循環(huán)DNA 的0.01%［10-11］，因此對(duì)于檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)下限的研究很重要。有研究表明可使用細(xì)胞系或基因編輯的細(xì)胞系作為標(biāo)準(zhǔn)化的樣本，對(duì)檢測(cè)限附近的檢出能力進(jìn)行研究驗(yàn)證［12］。另外基于NGS 的方法檢測(cè)ctDNA 時(shí)，需要使用超深測(cè)序（＞10 000×原始覆蓋），以達(dá)到適合的檢測(cè)限（≤0.1%）［13-14］。

目前沒有關(guān)于高通量測(cè)序法檢測(cè)ctDNA 的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，也沒有相關(guān)的國(guó)家參考品或國(guó)際參考品。據(jù)國(guó)家衛(wèi)生健康委臨床檢驗(yàn)中心公布《2019年腫瘤游離DNA（ctDNA）基因突變檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)》結(jié)果，我國(guó)各實(shí)驗(yàn)室ctDNA 基因突變檢測(cè)總體合格率僅為80%，其中173 個(gè)假陽(yáng)性突變結(jié)果、67 個(gè)假陰性結(jié)果。

為評(píng)價(jià)基于不同NGS 平臺(tái)的液體活檢試劑盒的質(zhì)量和性能，開展ctDNA 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化研究，中檢院建立了血漿ctDNAKRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突變檢測(cè)國(guó)家參考品（批號(hào)：360037-201901）用于相關(guān)試劑盒的性能評(píng)價(jià)，包括準(zhǔn)確性、特異性及檢測(cè)限［15］。該參考品對(duì)試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)標(biāo)注的基因突變位點(diǎn)均應(yīng)檢出；對(duì)試劑盒檢測(cè)范圍外標(biāo)注的基因突變位點(diǎn)均不應(yīng)檢出；對(duì)試劑盒檢測(cè)范圍內(nèi)的1%和0.3%突變比例檢測(cè)限參考品進(jìn)行檢測(cè)，標(biāo)注的基因突變位點(diǎn)均應(yīng)檢出。

參考品原料系提取自野生型或各種基因突變細(xì)胞系基因組DNA，經(jīng)酶切打斷后，加入血漿樣本中。為保證國(guó)家參考品的換批連續(xù)性，本參考品通過建立永生化細(xì)胞系，獲得細(xì)胞基因組DNA 作為原料。本研究的局限性在于國(guó)家參考品不包括融合突變的基因類型，因此未對(duì)試劑盒的ALK、ROS1、RET三個(gè)基因的融合突變的檢測(cè)能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。

本研究是基于高通量測(cè)序平臺(tái)，首先利用環(huán)化單分子擴(kuò)增，獲得線性化的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。然后通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序，準(zhǔn)確識(shí)別攜帶基因突變的腫瘤DNA 序列，獲得相關(guān)基因突變信息。該技術(shù)能夠滿足血漿ctDNA KRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突變檢測(cè)國(guó)家參考品的要求，為ctDNA 腫瘤基因檢測(cè)提供了一種可靠的檢測(cè)方法。

綜上所述，血漿ctDNA KRAS/NRAS/EGFR/BRAF/MET基因突變檢測(cè)國(guó)家參考品可以有效保障ctDNA 檢測(cè)的準(zhǔn)確性，可以提升相關(guān)診斷試劑的質(zhì)量控制水平，有利于加快循環(huán)腫瘤DNA 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)化的進(jìn)程。